Name: Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende un método quirúrgico postauricular para la entrega viral directa en la cóclea de ratones mediante la membrana de la ventana redonda. Esta técnica minimiza la pérdida de sangre y la mortalidad animal.

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Este trabajo está respaldado por una subvención R21 de los Institutos Nacionales de Salud y por una subvención de Hearing Research, Incorporated.

NOTA: Todos los procedimientos y manejo de los animales cumplido con las pautas de ética NIH y los requisitos del protocolo aprobado del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California en San Francisco. 1. Preparación del Animal de Cirugía <ol><li> Llevar a cabo procedimientos quirúrgicos en un espacio dedicado limpio. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, esterilizar con un esterilizador de vidrio de grano antes de la cirugía. NOTA: En este protocolo, utilice el día postnatal 10-12 (P10-12) ratones FVB. Diferentes edades y razas de ratones se pueden utilizar para satisfacer las necesidades de un proyecto específico. Ratones mayores de P40 puede ser un reto porque el hueso bulla se hace más difícil. </li><li> Anestesiar a los ratones con inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg / kg), clorhidrato de xilazina (10 mg / kg) y acepromacina (2 mg / kg). Comienza la preparación quirúrgica sólo después de que el animal ya no responde a los estímulos dolorosos, como la pizca dedo del pie. Si necessary, administrar una dosis de refuerzo (un quinto de la dosis original) del cóctel anestésico para restaurar el plano original de anestésico. NOTA: Tenga cuidado en este paso porque la mayor parte de la mortalidad observada en esta edad es causada por sobredosis de anestésico. </li><li> Cubrir los ojos del animal con una pomada oftálmica de protección para mantener los ojos húmedos durante la anestesia, la supresión de parpadeo reflejo del animal. </li><li> Coloque el ratón con cuello extendido sobre una almohadilla caliente durante todo el procedimiento hasta que el ratón está totalmente despierto, para prevenir la hipotermia post-anestesia. </li><li> Afeitarse la región post-auricular izquierda con un clipper y desinfectar con etanol al 70% y la povidona yodada antes de la manipulación quirúrgica. </li></ol> 2. El procedimiento quirúrgico y la inyección del vector <ol><li> Utilice un enfoque post-auricular para exponer la bulla timpánica. Incisión en el tejido subcutáneo con unas tijeras pequeñas para exponer el músculo post-auricular. Después de la retracción del tejido adiposo a Mlado posterior e de la incisión, separar los músculos a la derecha y el lado izquierdo perpendicular a la incisión para exponer el hueso temporal. Asegúrese de que esta incisión es el tiempo suficiente para trabajar cómodamente con una visualización adecuada. </li><li> Perforar la bulla timpánica con una aguja 25 G y ampliar el agujero como sea necesario con unas pinzas por el pelado de la columna vertebral para permitir el acceso a la espira basal de la cóclea, y luego ampliar suficientemente para visualizar la arteria estapedial y la membrana de la ventana redonda (RWM) . </li><li> Perforar el RWM suavemente en el centro con una pipeta capilar de borosilicato. Observe flujo de salida de líquido a través de la RWM en este punto; esto es normal. Esperar hasta que el flujo de salida se ha estabilizado (el líquido effluxed de la cóclea se seca con un papel de filtro estéril). NOTA: Tenga cuidado al sostener y hacer avanzar la aguja de vidrio para que la perforación RWM es lo más pequeño posible. Dependiendo del microscopio usado, tienen las pipetas usando un micromanipulador o a mano usando una pipetatitular. </li><li> Preparar las pipetas para inyección con una pipeta extractor se preparan de la misma manera pipetas de patch clamp. Asegúrese de que el diámetro de la punta es grande (unos 15 m de diámetro) para que dispensó el virus de entrada y salida se hace fácilmente. </li><li> Elaborar 1 a 2 l de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP o AAV2-GFP en una pipeta de inyección. Después se estabiliza el flujo de salida (5 a 10 minutos), microinyectar este volumen fijo en la rampa timpánica por el mismo agujero hecho previamente en RWM. </li><li> Sellar el nicho RW rápidamente después de sacar la pipeta con un pequeño tapón de músculo y seguro que con una pequeña gota de adhesivo tisular colocado en el músculo para evitar la fuga de la ventana redonda. NOTA: Selle este agujero muy bien después se retira la aguja con un pequeño tapón de músculo para evitar cualquier fuga perilinfa de la cóclea, este paso es fundamental para preservar la audición. El fracaso para sellar completamente el VM se traducirá en la pérdida de audición en el tiempo. </li><li> Después de la inyección, cubra elagujero en la ampolla auditiva con el tejido adiposo, los músculos de regreso post-auricular y el tejido adiposo a su posición normal y la sutura de la herida en capas con una sutura absorbible crómico 6-0 o más pequeño. </li><li> Desinfectar la herida con povidona yodada. </li></ol> 3. Cuidado posoperatorio <ol><li> Coloca los ratones en una jaula caliente y no los deje sin supervisión hasta que estén completamente recuperados luego pasar de nuevo con la madre. Se recomienda retirar el macho de la jaula antes de poner los cachorros de vuelta con la madre. </li><li> Administrar subcutánea carprofeno (2 mg / kg) para la analgesia después de la operación y cada 24 h durante 3 días a partir de entonces, para gestionar la inflamación y el dolor. Monitorear los animales diariamente para detectar signos de sufrimiento, pérdida anormal de peso, dolor o infección. Generalmente por el 3er día después de la cirugía todos los ratones deberían estar actuando normalmente. Si cualquier signo de sufrimiento o la enfermedad aparecen en un ratón después de los 3 días, considere la eutanasia de tél ratón según las directrices institucionales. </li></ol> 4. Evaluación de la función coclear después de un parto Viral Utilizando respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) Grabaciones NOTA: La respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) es una auditivo potencial extraído de la actividad eléctrica en curso en el cerebro y grabado a través de electrodos colocados bajo el cuero cabelludo evocado. El animal se estimula con el sonido. La grabación resultante consiste en cinco ondas que reflejan la actividad eléctrica de los puntos sucesivos en la vía auditiva en los primeros 10 mseg después de la aparición de un estímulo auditivo. <ol><li> Anestesiar ratones por inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilazina como se describe en la sección 1.2 de este protocolo, sólo que sin la acepromacina. </li><li> Coloque el ratón sobre una almohadilla de calefacción en toda la prueba de audición hasta que el ratón está totalmente despierto, para prevenir la hipotermia post-anestesia. NOTA: El usolos siguientes estímulos sonoros en este experimento: haga clic (5 milisegundos de duración; 31 Hz tasa de presentación). </li><li> Coloque los electrodos de aguja subdérmicos en el vértice, por debajo del pabellón auricular del oído izquierdo (de referencia), y por debajo de la oreja contralateral (tierra) y empezar ABRs grabación como se describe anteriormente en una cámara insonorizada 27,28. Grabar formas de onda ABR en 5 intervalos de nivel de presión sonora dB por debajo del máximo de amplitud. </li><li> Determinar los umbrales ABR postoperatorio tan pronto como 4 días después del parto viral NOTA: Umbral se define como el nivel de estímulo más bajo al que de respuestas de los picos para las ondas I-V eran claramente y repetidamente presente en la inspección visual. </li><li> Mida Wave I para analizar la actividad del nervio coclear. El nivel de estímulo más bajo que produce una forma de onda de ABR detectable se define como el umbral. </li></ol> 5. Coclear Transgén expresión de la proteína mediante inmunofluorescencia <ol><li> Anestesiar ratones por una sobredosis de intrapinyección eritoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilazina como se describe en la sección 1.2 de este protocolo, sólo que sin la acepromacina. </li><li> Decapitar la cabeza solamente después que el animal ya no responde a los estímulos dolorosos, como la pizca dedo del pie. </li><li> Diseccionar las cócleas y proceso para todo el montaje de inmunofluorescencia como se describe 26. Un protocolo detallado de coclear inmunofluorescencia de montaje en toda utilizando anticuerpos anti-7a anti-miosina VGLUT3 y se describe en Akil et al., 2013 29. </li><li> Para el etiquetado GFP, incubar los cocleares enteros monta la noche a 4 ° C con un anticuerpo de conejo anti-GFP en dilución 1: 250. </li><li> Enjuague el cochleae dos veces durante 10 min con PBS y luego se incuba durante 2 horas en IgG de cabra anti-conejo conjugado con Cy2 diluido 1: 4000 en PBS. </li><li> Enjuague el cochleae dos veces con PBS durante 10 minutos y se incuba con DAPI durante 15 min. </li><li> Monte el cochleae en portaobjetos de vidrio y observar under un microscopio con inmunofluorescencia confocal. </li></ol>

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<li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li>
<li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus%3A+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).</li>
<li>Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

En este trabajo, se describe en detalle una técnica que se puede utilizar para la terapia génica coclear, con el objetivo de restaurar o rescatar la función auditiva normal que se ve comprometida por un defecto genético. Como es típicamente atraumática, este enfoque es seguro para la transferencia de genes coclear u otras terapias moleculares potenciales 30. Se han descrito otros enfoques para la terapia coclear, incluyendo un enfoque ventral 24, cocleostomía 31,32 y el saco endolinfátic...

La terapia génica durante mucho tiempo ha sido sugerido como un posible tratamiento para la pérdida auditiva genética, pero el éxito en esta área ha sido difícil de alcanzar 1. Hasta la fecha, las metodologías mediadas por virus han predominado por la capacidad teórica para dirigirse a tipos específicos de células dentro de la cóclea relativamente inaccesible. Ambos adenovirus (AV) y el virus adeno-asociado (AAV) se han utilizado para la entrega de genes coclear. AAV son ventajosos en la cóclea por un número de razones. Ellos son virus deficientes en la replicación y pueden transferir de manera eficiente moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluyendo neuronas, un objetivo importante para un número de causas de la pérdida de audición. Entrada AAV en la célula está mediada por receptores específicos 2; Por lo tanto, la elección de un serotipo particular, debe ser compatible con los tipos de células a ser transducidas. AAV puede transfectar eficazmente células ciliadas 3 e incorporar en el genoma del huésped, lo que resulta en una expresión estable y a largo plazo de la traproteína nsgenic y cambio fenotípico en la celda 4. Aunque no necesariamente ventajoso para aplicaciones de corto plazo, tales como la regeneración de células de pelo, expresión a largo plazo es muy importante para el rescate estable de defectos genéticos. Debido AAV no están asociados con ninguna enfermedad humana o infección y demuestran no ototoxicidad 5,6,7, son un candidato ideal para su uso en la terapia génica para formas heredadas de la pérdida de audición 8. Transferencia de material genético exógeno en el oído interno de los mamíferos utilizando vectores virales se ha estudiado en la última década y se perfila como una técnica prometedora para el tratamiento de las formas tanto genéticas y adquiridas de la pérdida de 9 de la audición. La cóclea es potencialmente una diana ideal para la terapia génica por varias razones: 1) su volumen pequeño requiere una cantidad limitada de que el virus sea necesario; 2) su relativo aislamiento de otros efectos secundarios límites del sistema de órganos; y 3) sus cámaras llenas de líquido facilitan viralentrega en todo el laberinto 10, 11,12,13,14, 15. Los modelos de ratón de la sordera congénita permiten el uso de muchos métodos de estudio para monitorear el desarrollo del oído interno de una manera sistemática, replicable. Mientras que el pequeño tamaño de cochleae ratón no presenta cierta dificultad quirúrgica, el ratón sirve como un modelo extremadamente importante en el estudio de la pérdida auditiva genética, con varias ventajas sobre otras especies experimentales 16. Los modelos de ratón permiten la evaluación de una serie de características a través de análisis de ligamiento genético, colección de observaciones morfológicas detalladas, y la simulación de escenarios patógenos; Como tales, son buenos candidatos para la terapia génica mediada por virus. Extensos estudios genéticos en ratones combinados con los avances tecnológicos han hecho posible la generación de ratones modificados genéticamente de forma reproducible a través de laboratorios de 17,18, 19, 20,21. Furthermore, existen numerosos modelos para ambos adquiridas y heredadas de la audición fenotipos de pérdida en ratones, lo que permite a rigurosas pruebas en este modelo animal 22, 23,24. Por lo tanto, la corrección de la audición mediante la terapia génica mediada por virus en un modelo de ratón es un primer paso apropiado en la búsqueda de una cura para la enfermedad humana. Hemos demostrado previamente que los ratones transgénicos que carecen de glutamato vesicular transportador 3 (VGLUT3) nacen sordos debido a la falta de liberación de glutamato en la sinapsis cinta IHC 25. Debido a que esta mutación no conduce a una degeneración primaria de las células ciliadas sensoriales, estos ratones mutantes son potencialmente un excelente modelo en el que para probar la terapia génica coclear para la pérdida de audición congénita. Hasta la fecha, un número de técnicas de administración virales para la terapia génica coclear se han descrito, incluyendo la difusión membrana de la ventana redonda, la inyección de membrana de la ventana redonda, y la entrega a través de una cocleostomía. Hay potenteventajas ial y desventajas de cada uno de estos enfoques 9. Aquí mostramos un método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus en el oído interno VGLUT3 KO ratón a través de la membrana de la ventana redonda (RWM). El método de inyección de RWM post-auricular es mínimamente invasiva con la preservación audiencia excelente, y es relativamente rápido. Como hemos publicado anteriormente, en un esfuerzo para restaurar la audición en este modelo de ratón, un vector de AAV1 que lleva el gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) se introdujo en la cóclea de estos ratones sordos en el día postnatal 12 (P! @), Resultando en la restauración de la audición 26. Audición en los ratones KO VGLUT3 se verificó por la respuesta del tronco encefálico (ABR), mientras que la expresión de proteínas transgén se verificó mediante inmunofluorescencia (IF). Por tanto, esta metodología demuestra que la terapia génica mediada por virus-puede corregir un defecto genético que de otro modo resulta en sordera.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine Proporcionado</td><td>por UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analgesia de carprofeno</td><td>Proporcionado por UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Betadine Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ungüento oftálmico de dexametasona (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aguja 25G</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta capilar de borosilicato</td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sutura PDS*plus Antibacteriano</td><td>Ethicon</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento para tejidos (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP</td><td>de conejo Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Micropipeta Flaming/ Marrón&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Extractor Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modelo P-97&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema TDT BioSig III&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; Tecnologías</td><td></td><td></td> Tucker-Davis</tr></tbody></table>

método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón interior a través de la ventana de membrana ronda

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

La terapia génica, que se utiliza para lograr la recuperación funcional de la sordera neurosensorial, se compromete a conceder una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y genéticos subyacentes que contribuyen a la pérdida de la audición. Introducción de vectores en el oído interno debe hacerse de una manera que distribuye ampliamente el agente a lo largo de la cóclea al tiempo que minimiza la lesión a las estructuras existentes. Este manuscrito describe un enfoque quirúrgico post-auricular que se puede utilizar para la terapia coclear ratón usando molecular, farmacológica, y la entrega viral a ratones día postnatal 10 y mayores a través de la membrana de la ventana redonda (RWM). Este abordaje quirúrgico permite una entrega rápida y directa en la rampa timpánica y reducir al mínimo la pérdida de sangre y evitar la mortalidad de los animales. Esta técnica implica un daño insignificante o no a las estructuras esenciales del oído medio e interno, así como los músculos del cuello, mientras su totalidad preservar la audición. Para demostrar la eficacia de esta técnica quirúrgica, el glutam vesicularcomió transportador 3 knockout (KO VGLUT3) los ratones se utilizará como un ejemplo de un modelo de ratón de la sordera congénita que recupera la audición después de la entrega de VGLUT3 al oído interno utilizando un virus adeno-asociado (AAV-1).

Para verificar las características técnicas y utilidad del enfoque post-auricular para la terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP y AAV2-GFP se entregaron en ratones P10-12 oído interno a través de la RWM. Este enfoque demuestra con éxito la expresión del transgén dentro de las células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 y Figura 2 GFP y GFP Figura 3A), las células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) y células de soporte (GFP Fi...

El abordaje quirúrgico postauricular descrito permite una administración rápida y directa en el lápido timpático coclear del ratón, al tiempo que minimiza la pérdida de sangre y la mortalidad animal. Este método se puede utilizar para la terapia coclear mediante la administración molecular, farmacológica y viral a ratones posnatales a través de la membrana de la ventana redonda.

Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

El objetivo general de este procedimiento es describir un abordaje quirúrgico postauricular que permita la administración rápida y directa del virus en el timi de la escala S coclear del ratón a través de la membrana de la ventana redonda. Esto se logra exponiendo primero la bulla timpánica. En el segundo paso, se perfora el tejido y se visualizan la arteria edia y la membrana de la ventana redonda.A continuación, se perfora la membrana redonda de la ventana y se inyecta el virus en el esponón. En el paso final, se sella el agujero. En última instancia, la expresión de la proteína transgénica y la recuperación de la audición del animal pueden evaluarse mediante microscopía inmunofluorescente y medición de la respuesta auditiva del tronco encefálico, respectivamente.Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes como la coch, la ostomía y el abordaje ventral es que la inyección postular en membrana de ventana redonda es mínimamente invasiva relativamente rápida, permite inyecciones de mayor volumen y facilita la transfección generalizada de una variedad de células en toda la cóclea. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque el procedimiento depende en gran medida de una comprensión profunda de la anatomía de la cóclea. Después de confirmar la anestesia por el dedo del pie, pellizcar afeitar la región postauricular izquierda y desinfectar la piel de un día postnatal, 10 a 12 ratones con etanol al 70% y povidona yodada.A continuación, cubra los ojos con una pomada oftálmica protectora y coloque al animal con el cuello extendido sobre una almohadilla térmica. Una vez finalizada la preparación quirúrgica, incida el tejido subcutáneo con unas tijeras pequeñas para exponer el músculo postauricular. Después de retraer el tejido adiposo hacia el lado posterior de la incisión, separe los músculos hacia los lados derecho e izquierdo perpendiculares a la incisión.Para exponer el hueso temporal, use una aguja de calibre 25 para perforar la bulla timpánica, pelando el hueso con pinzas según sea necesario para expandir el orificio y permitir el acceso al giro basal de la cóclea. A continuación, ensanche el orificio lo suficiente como para permitir la visualización de la arteria fija y la membrana redonda de la ventana. Perfore suavemente la membrana redonda de la ventana en el centro con una pipeta capilar de silicato de burro.Seque la membrana de la ventana redonda con un papel de filtro estéril. Luego espere de cinco a 10 minutos para que el fluido e flujo se estabilice En este paso. Tenga cuidado al sujetar y avanzar la pipeta, para que la perforación de la membrana de la ventana redonda sea lo más pequeña posible.Dependiendo del uso del microscopio, la pipeta se puede sujetar con la mano o con un manipulador de micrómetros. Como puede ver aquí, sostenemos la pipeta con la mano, ya que el microscopio está demasiado cerca del ratón para permitir un micromanipulador. Ahora extraiga uno o dos microlitros del virus en una pipeta de vidrio estirado con una punta de 15 micrómetros de diámetro y microinyecte el virus en la escala de timoni a través del mismo orificio hecho previamente en la membrana redonda de la ventana.A continuación, extraiga la pipeta y selle rápidamente el nicho redondo de la ventana con un pequeño tapón de músculo, asegurándolo con una pequeña gota de adhesivo de tejido. Cubra el orificio de la bulla auditiva con tejido adiposo y devuelva los músculos postauriculares y el tejido adiposo a su posición normal. A continuación, utilizando una sutura crómica absorbible de 6,0 o menor, cierre la herida y desinfecte la zona de la incisión con povidona yodada.Luego coloque el ratón en una jaula caliente, devolviéndole el pop a la madre después de una recuperación completa con monitoreo diario. Para evaluar la función coclear tan pronto como cuatro días después del parto viral, coloque un animal transfectado sedado en una almohadilla térmica y luego coloque electrodos de aguja subdérmica en el vértice debajo del pabellón auricular izquierdo y debajo del oído contralateral. Finalmente, comience a registrar las respuestas auditivas del tronco encefálico o un BR en una cámara insonorizada como se describió anteriormente, midiendo la onda uno para analizar la actividad del nervio coclear como se ve en el montaje del orificio coclear.Este enfoque demuestra la expresión exitosa de transgenes dentro de las células ciliadas internas, las células ciliadas externas y las células de soporte sin una lesión significativa en los órganos COR T que permiten observar diferentes tipos de células que expresan GFP en el orificio coclear. Mount demuestra que la elección del serotipo de virus adenoasociado debe ser compatible con los tipos de células que se van a transducir. El número de células transfectadas varía en función de la concentración y el volumen inyectado por el virus.En este caso, el aumento de 0,6 a un microlitro resultó en un aumento en el número de células transfectadas a un nivel comparable al tipo salvaje V La expresión del transgén tres se restauró en ratones KO inyectados como se ve en estas imágenes aquí, el efecto de la membrana de ventana redonda postauricular de la membrana de ventana redonda del virus V GL tres en el oído interno de los ratones V gl tres knockout en el rescate auditivo se demuestra como se ve en el gráfico. Las trazas de A BR se restauraron en el ratón knockout rescatado de la VLU, alcanzando umbrales comparables a los observados en ratones de tipo salvaje. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse su tiempo para cada paso para evitar daños en las estructuras del oído interno y medio, así como en los músculos del cuello.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un enfoque posquirúrgico para la administración de tratamientos experimentales virales farmacológicos moleculares en la bandeja del esqueleto de MA a través de la membrana de viento redonda.

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Investigación

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Neurociencia

La oreja de ratón interno es un órgano sensorial placoda derivada del desarrollo cuyo programa se elaboró ​​durante la gestación. Se define...

Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior<em&gt; En Vivo</em&gt; La electroporación

Fuente: Kozin, E. D., et.al. Visualización directa del núcleo coclear dorsal murino para la estimulación optogenética de la vía auditiva. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la transferencia de genes mediada por virus al núcleo coclear dorsal (DCN) del ratón para permitir la estimulación auditiva inducida por la luz. Un vector viral que codifica opsina, un canal iónico sensible a la luz, se inyecta en el DCN después de una craneotomía y aspiración cerebelosa para acceso directo. Las opsinas...

Transferencia de genes mediada por virus al núcleo coclear dorsal del ratón para estimulación auditiva inducida por luz

Este video muestra la canalostomía, un procedimiento que permite la administración local de fármacos en el oído interno de un ratón a través del canal semicircular con un daño mínimo a la audición y la función vestibular. Este método permite la inoculación de vectores virales, productos farmacéuticos y moléculas pequeñas en el oído interno del ratón.

Canalostomía para la administración local de fármacos en el oído interno de un ratón adulto

Fuente: Akil, O., et al., Método quirúrgico para la administración de genes mediados por vía viral al oído interno del ratón a través de la membrana de la ventana redonda. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el procedimiento de administración de un gen terapéutico en el oído interno de un cachorro de ratón con pérdida auditiva inducida genéticamente. Usando un vector viral adenoasociado (AAV), el gen se inyecta a través de la membrana de la ventana redonda, lo que permite que las partículas...

Terapia génica basada en vectores virales para la restauración de la audición en un modelo de ratón

Existen varios métodos para introducir agentes ototóxicos en las cócleas de modelos animales. Se presenta un protocolo quirúrgico para la administración de agentes ototóxicos en el nicho de ventana redonda. El procedimiento es fiable, crea lesiones intracocleares específicas y evita daños mecánicos en la microarquitectura. Es posible examinar la autorreparación/regeneración coclear.

El Enfoque del ratón Ronda-ventana para ototóxicos Agente de entrega: Una rápida y técnica fiable para la inducción de degeneración de las células cocleares

Aquí se describen y comparan dos enfoques de microcirugía para la administración local de fármacos al oído interno en términos de impacto en los parámetros auditivos, la citoarquitectura coclear y la expresión de marcadores inflamatorios.

Estudio comparativo de los métodos de entrega de fármacos dirigidos a la oreja del ratón interno: Bullostomy vs. Inyección transtimpánicos

Divulgamos un método quirúrgico para administrar medicamentos al oído interno de un primate no humano, el tití común (Callithrix jacchus), a través de la membrana de ventana redonda.

Un procedimiento quirúrgico para la administración de medicamentos para el oído interno en una no humanos primates común tití (Callithrix jacchus)

En este estudio, describimos el enfoque del canal semicircular posterior como un método confiable para la entrega del gene de oído interno en ratones neonatales. Mostramos que entrega del gene a través del canal semicircular posterior es capaz de inundar todo oído interno.

Enfoque del Canal Semicircular posterior para la entrega del Gene de oído interno en ratón Neonatal

Aquí describimos el procedimiento de canalostomy que permite la entrega del local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y neonatales a través del canal semicircular con mínimo daño a la función auditiva y vestibular. Este método puede utilizarse para inocular vectores virales, productos farmacéuticos y pequeñas moléculas en el oído interno de ratón.

Canalostomy como un abordaje quirúrgico a la entrega del Local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y Neonatal

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

Aprende un método quirúrgico postauricular para la entrega viral directa en la cóclea de ratones mediante la membrana de la ventana redonda. Esta técnica minimiza la pérdida de sangre y la mortalidad animal.

Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda (Video) | JoVE Journal

Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda

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