Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar los cambios en el proceso fagocítico o actuar en la polimerización tras la adición de agonistas o antagonistas. Esto se logra mediante la adición de partículas marcadas con fluorescencia a las células fagocíticas y dejando tiempo suficiente para que se produzca la fagocitosis. Como segundo paso para detener la fagocitosis, las células se tratan con azul de triam para extinguir la fluorescencia de las partículas no internalizadas, lavadas y posteriormente fijadas con paraldehído.

Lo siguiente es la tinción y la cuantificación. Con el fin de facilitar la detección fluorescente de células y partículas, células sostenidas con DPI o actina, los resultados muestran el efecto del tratamiento sobre la fagocitosis y la polimerización de actina cuantificado a través de una relación de fluorescencia verde-roja a azul basada en un análisis fluorométrico. La principal ventaja de la técnica fluorométrica sobre los métodos existentes es que es un método rentable y de alto rendimiento para la evaluación de la fagocitosis.

Permite una manipulación mínima de la muestra y una cuantificación rápida de la intensidad fluorescente por célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología y la biología celular, como la eficacia y la rapidez de esta eliminación de patógenos. Acción de la polimerización que cambia durante la fagocitosis y cómo se modula la fagocitosis o polimerización axonal por agonistas o antagonistas.

Para comenzar la placa de procedimiento, los macrófagos de la línea celular murina J 7 74 en una placa de 96 pocillos con un fondo transparente o negro incuban las células de adherencia a 37 grados Celsius durante una o dos horas para permitir que el adion llegue a la placa. A continuación, añada los agonistas o antagonistas deseados o el control del vehículo a las células a una concentración de dos x en 50 microlitros de PBS o medios suplementados e incube durante la cantidad de tiempo deseada. En este paso, asegúrese de que las partículas fluorescentes y las etiquetas estén protegidas de la luz en todo momento durante el procesamiento, el lavado y la incubación.

Para evitar el fotoblanqueo, utilice las partículas en suspensión, como las perlas de dextra marcadas con fluorescencia, o explique la solución madre durante un minuto. A continuación, añada una cantidad igual de reactivo opsonizante a las partículas fluorescentes y agite vigorosamente el vórtice durante otro minuto. Posteriormente, se incubó la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora después de la centrifugación de las partículas, que estuvo cinco minutos en la centrifugación.

A 500 veces G.Eliminar el sobrenadante S que contiene el exceso de reactivo opsonizante. Después de eso, lave las partículas con 100 microlitros de PBS. Agite la muestra para resuspender el gránulo y centrifugue durante cinco minutos de 500 a veces G. Repita estos pasos dos veces más para asegurar la optimización adecuada y la eliminación del anticuerpo no unido.

Para preparar la solución de trabajo de partículas ionizadas, vuelva a suspender las partículas en cinco mililitros de medio. A continuación, guárdelo lejos de la luz hasta que se siga utilizando. Ahora coloque la solución de trabajo de partículas en un depósito de reactivo estéril.

Agregue 50 microlitros de partículas de opsonizado a las células preparadas anteriormente hasta una concentración final de 15 nanogramos por mililitro, y permita que la fagocitosis ocurra en condiciones estándar de cultivo celular. Para el método de fagocitosis continua, espere de 30 minutos a una hora para que las partículas fluorescentes lleguen al fondo del pocillo y entren en contacto con las células. Si realiza un experimento de curso de tiempo, agregue bacterias en diferentes intervalos de tiempo y detenga toda la placa de reacciones al mismo tiempo.

Para mejorar la velocidad de procesamiento de las células de adherencia, retire el sennet y agregue 50 microlitros de azul de triam diluido con PBS para extinguir la fluorescencia de las bacterias no internalizadas después de la incubación de trian. Lave la placa dos veces con PBS para eliminar cualquier trian residual. A continuación, fije las células con 50 microlitros de paraldehído al 4% e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, lave la placa con PBS. Retire todo el líquido y agregue 50 microlitros de DPI Después de cinco minutos de tinción, lave la placa dos veces con PBS. Posteriormente, se añadan 50 microlitros de PBS a cada pocillo y se registre la fagocitosis tras la fijación con paraldehído.

Lave la placa dos veces con 100 microlitros de PBS por pocillo para cada lavado. A continuación, añada 50 microlitros de Triton X 100 en PBS al 0,1% a las células para que penetren y colévelas durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave el 0.1%Triton X con PBS dos veces.

A continuación, bloquee las células con 1%BSA durante 20 minutos para evitar la unión inespecífica de la etiqueta. Ahora prepare la solución de trabajo de la tinción de Rod Domine agregando 100 microlitros de solución madre de metanol en cinco mililitros de PBS. Después del bloqueo, retire la solución BSA inmediatamente.

Agregue 50 microlitros de foid ruminal y solución de trabajo a cada pocillo e incube las células en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para cuantificar la fagocitosis, coloque la placa en un lector de placas fluorescentes Registre la fluorescencia verde utilizando un filtro de excitación a una longitud de onda de 488 nanómetros y un filtro de emisión a una longitud de onda de 518 nanómetros y la fluorescencia azul utilizando un filtro de excitación a una longitud de onda de 355 nanómetros y un filtro de emisión a una longitud de onda de 460 nanómetros. Para cuantificar la polimerización de actina utilizando un lector de placas fluorescentes, registre la fluorescencia roja a través de un filtro de excitación a una longitud de onda de 584 nanómetros y un filtro de emisión a una longitud de onda de 620 nanómetros y fluorescencia azul.

Filtro de fuego y excitación a una longitud de onda de 355 nanómetros y un filtro de emisión a una longitud de onda de 460 nanómetros. A continuación, divida la RFU total de fluorescencia verde o roja por la lectura de fluorescencia azul en función de la etiqueta de partículas o la cuantificación fagocítica frente a la actina debido a la placa alta. Para determinar la varianza, utilice índices relativos para ilustrar mejor las tendencias observadas y facilitar un análisis estadístico más fiable.

Esta imagen ilustra los cambios en la polimerización de actina después de la adición de un inhibidor. Estos son la formación de seudópodos y aquí están los cambios en el ondulamiento de la membrana. En esta imagen, se permitió a las células internalizar cuentas X conjugadas en una proporción de 20 a una cuenta por celda durante 60 minutos.

Luego, las células se lavarán con trian y PBS fijados con paraldehído, permeables con acetona y se teñirán para F actin Usando rod domine, F loin y dpi, la fagocitosis continua de partículas opsonizadas y no oxidadas es bastante comparable. Donde J 7 74 células están interiorizando cuentas dextra. Curiosamente, la polimerización de actina después de la fagocitosis aumenta, desacelerándose en puntos de tiempo posteriores, mientras que la polimerización de actina después de la internalización de partículas unop no aumenta, ni los métodos fagocíticos que usan partículas dextra dan como resultado cambios en la viabilidad celular Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una o dos horas con múltiples placas a la vez si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo utilizar el análisis métrico de fluor como un método eficiente y rentable de alto rendimiento para analizar la fagocitosis y otros procesos celulares.