Name: Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende a cuantificar la fagocitosis y la polimerización de actina en macrófagos mediante un método fluorométrico de alto rendimiento. Esta técnica permite evaluar el efecto de agonistas y antagonistas de forma eficiente.

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Los autores desean agradecer a las siguientes fuentes de financiación: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (a S.R) y F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (a J.N.).

NOTA: Este protocolo se puede utilizar para múltiples aplicaciones tales como la cuantificación de la polimerización de la fagocitosis y la actina, como se usa en nuestro trabajo publicado previamente 12. El protocolo se presta a una variedad de modificación, y los tipos Tabla 1 listas de células y partículas utilizado con éxito en estudios anteriores. Uso estándar de este protocolo para la cuantificación de la polimerización fagocitosis o actina se ilustra en el diagrama 1. <img alt="Diagrama 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600"> Diagrama 1:. Diagrama de ensayo fluorométrico para la cuantificación de la polimerización de actina Después de la fagocitosis y las células se sembraron, se trata y se dejaron adherir, partículas marcadas con fluorescencia verde (FITC) se añaden a las células durante la fagocitosis. La reacción se detiene por tripano o antibilavado ótico (para eliminar las partículas no internalizadas) y la fijación se realiza con 4% de paraformaldehído. Las células son posteriormente teñidas con etiqueta de color rojo fluorescente actina (rodamina phalloidin) y marcador fluorescente azul (DAPI). Índices de la fagocitosis y la polimerización de actina se cuantifican como una relación de unidades relativas de fluorescencia de verde / azul (FITC / DAPI) o azul (rodamina / DAPI) fluorescencia roja /. 1. Chapado y Pilas de Tratamiento NOTA: Antes de comenzar, considere la posibilidad de ejecutar los tratamientos con al menos 4 repeticiones técnica, e incluyen los siguientes controles en el diseño de la placa: sólo las células (sin manchas, con DAPI solo o rodamina solo) y de partículas solamente. <ol><li> Llevar a cabo todas adición de reactivos en los pasos 1-4 en una campana de cultivo celular estéril con el fin de proteger las muestras de la contaminación. </li><li> Macrófagos placa (línea celular murina J774) en una placa de 96 pocillos a 1-5 x 10 4 células en 50 l (por pocillo) de los medios de comunicación complementado precalentado. Placas ideales para este método son placas de 96 pocillos de color negro con fondos transparentes o negro, dependiendo de las capacidades del lector. <ol><li> Por medio suplementado, utilizar 10% FBS inactivado por calor para evitar la interferencia de la cascada del complemento, y 1% de penicilina / estreptomicina (si no se utiliza bacterias vivas para la fagocitosis). Si se utilizan células adherentes permiten 1-2 horas para la adhesión, y para las células no adherentes, girar hacia abajo la placa con las células durante 10 min a 500 x g. </li></ol></li><li> Añadir deseados agonistas / antagonistas o vehículo de control a una concentración 2x ​​(resuspendieron en PBS o más preferiblemente, en medio suplementado) en 50 l para un volumen final de 100 l (1x) y se incuba durante una cantidad de tiempo deseado. Pipeta multicanal y reactivos embalses facilitar el procesamiento más rápido. </li></ol> 2. Opsonización de partículas fluorescentes ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/&gt; Tabla 1: Probado tipos de células y partículas fluorescentes en el análisis fluorométrico de la Tabla 1 ilustra combinaciones de tipos de células (líneas celulares, y células primarias) que nuestro grupo ha utilizado a través del método fluorométrico la fagocitosis y la polimerización de actina.. Además de observar la fagocitosis y la polimerización de actina por células de tipo salvaje, también hemos utilizado algunas de estas partículas para el examen de la fagocitosis por las células transfectadas que expresan un GFP (proteína fluorescente verde). La fluorescencia de las células transfectadas con plásmidos que contienen los reporteros fluorescentes también se puede utilizar como un marcador celular además de DAPI leyenda de la tabla:. A - polimerización de la actina; P - fagocitosis; PT - fagocitosis por células transfectadas GFP marcado; OPDex - opsonizado cordón de dextrano; HKOP - calor mató opsonizó. <ol><li> Asegúrese de que las partículas fluorescentes y etiquetas se protegen de la luz en todo momento, during tratamiento, el lavado, así como durante la incubación con el fin de evitar photobleaching <ol><li> Para partículas secas, pesar bacterias calor fluorescente muertos opsonizadas (HKOP) (E2861: E. coli K-12 cepa), utilizando las especificaciones del fabricante. Tenga cuidado para asegurarse de que las cuentas de masas de 10: 1 a 20: 1 bacterias: proporción de células (o al menos una proporción de 10: 1 - comúnmente utilizado en la cuantificación de la fagocitosis) 13,14. Número de partículas puede ser proporcionado por el fabricante o determinarse mediante couting diluciones en serie de 1 mg solución / ml. </li><li> Resuspender en 50 l de PBS y agitar durante 1 minuto en la posición más alta. Asegurar vórtex adecuada (aquí y en todo el protocolo) como las partículas tienden a agregarse que pueden afectar a la eficacia de opsonización. </li><li> Para las partículas en suspensión tales como perlas de dextrano marcados con fluorescencia (cuentas DEX), vórtice la solución madre de 1 min, tomar 50 l de suspensión o dependiendo de la concentración del talón en el volumen dmontaje etermine de cuentas para facilitar 10: 1 del grano: proporción de células. </li></ol></li><li> Añadir un volumen igual de reactivo de opsonización de las partículas y agitar vigorosamente durante otro minuto. </li><li> Se incuban las partículas con opsonizantes reactivo a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Después de la incubación, centrifugar las partículas durante 5 min a 500 xg, y retire el sobrenadante que contiene exceso de reactivo opsonizante. Lavar las partículas mediante la adición de 100 l de PBS, vórtice para resuspender el pellet, y centrifugado durante 5 min a 500 x g. <ol><li> Repita estos pasos dos veces para asegurar la opsonización y eliminación de anticuerpo no unido adecuada. </li></ol></li><li> Preparar la solución de trabajo de partículas opsonizadas por resuspensión en 5 ml de medio (suficiente para una placa de 96 pocillos) y almacenar lejos de la luz hasta la adición a las células. </li></ol> 3. La fagocitosis <ol><li> Coloque la solución de trabajo de partículas en un depósito de reactivo estéril. Desde aquí, añadir 5056; l de partículas opsonizadas a las células preparadas en el paso 1 (para una concentración final de 50 ng / ml) y dejar que se produzca la fagocitosis en condiciones de cultivo celular estándar. A continuación se ilustran dos métodos de fagocitosis que se pueden evaluar mediante este método (Diagrama 2). </li></ol><img alt="Diagrama 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600"> Diagrama 2:. Comparación de la continua versus sincronizar la fagocitosis fagocitosis continuas indica internalización continua de partículas con el tiempo a medida que lentamente llegar a las células en la parte inferior del pozo. Un paso de sincronización de contraste (centrifugación) obliga a que las partículas se hunden hasta el fondo, mejorando el contacto de las partículas con la célula, y lleva a la internalización inmediata por las células. Fagocitosis sincronizada es un proceso más rápido que interioriza más rápidamente parteicles debido al aumento de células: el contacto de las partículas. <ol><li><ol><li> Para el método de la fagocitosis continua (Diagrama 2) que permiten a las células fagocitan las bacterias opsonizadas continuamente a medida que lentamente se hunden hasta el fondo y entran en contacto con las células, utilizan marcos de tiempo más largos para permitir que las bacterias alcanzan la parte inferior del pozo y obtener en tocar con las células. Si la realización de un experimento de transcurso de tiempo, añadir bacterias a diferentes intervalos de tiempo y detener toda la placa de reacciones al mismo tiempo para mejorar la velocidad de procesamiento. </li><li> Para el método sincronizado fagocitosis (Diagrama 2) que mejora la partícula: el contacto célula a través de centrifugación, de girar toda la placa que contiene las células y partículas (5 min a 500 xg) tan pronto como se añaden las partículas, para facilitar la sincronización de todos los puntos de tiempo y para acelerar la partícula: interacción celular. <ol><li> Mida el curso de tiempo a partir justo después de la finalización de la centripaso fugation. Si la realización de un experimento de curso de tiempo, detener cada punto de tiempo independientemente en diferentes intervalos de tiempo como se describe a continuación. </li></ol></li></ol></li></ol> NOTA: El método de la fagocitosis sincronizada es algo más laborioso de la anterior, pero proporciona mayor índice fagocítico en un tiempo más corto. 4. La fagocitosis Detención <ol><li> Para las células adherentes, eliminar el sobrenadante y añadir 50 l de azul de tripano diluido con PBS (dilución 1: 2), con el fin de extinguir la fluorescencia de las bacterias no internalizadas. </li><li> Para las células no adherentes, de girar la placa y eliminar el sobrenadante. Añadir 50 l de azul de tripano diluida. Asegúrese de centrifugar la placa a (5-10 min a 500 xg) entre cada lavado a fin de minimizar la pérdida de células y permitir un lavado adecuado. </li><li> Después de la incubación de tripano, lavar las células dos veces con PBS para eliminar cualquier tripano residual (hasta que el PBS retira del pozo se vuelve clara). Trypan se ha demostrado que apagar la fluorescencia 15,16 de calor mató, partículas bacterianas no internalizados marcado con fluorescencia, pero no para las bacterias vivas o perlas OPDex. Para bacterias vivas, incluir un lavado con antibióticos tales como penicilina, estreptomicina, gentamicina o en lugar del lavado de tripano para evitar efectos de confusión de la fluorescencia de las partículas no internalizadas. </li><li> Fijar las células con 100 l de paraformaldehído al 4%, y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente, a continuación, lavar con PBS (a 100 l por pocillo para cada lavado). En este paso, salvar a las células a 4 ° C durante un máximo de una semana, o ir directamente a la tinción y cuantificación. NOTA: Todos los pasos posteriores forman este punto prólogo se puede hacer fuera de la campana de cultivo celular. </li><li> Quite todo el líquido y añadir 50 l de DAPI a 5 ng / ml reconstituido en PBS. Permitir 5 min para la tinción, y lavar dos veces con PBS. Después de la etapa de lavado, se añaden 50 l de PBS a cada fagocitosis bien y registro. 5. La actina tinción NOTA: Además de la fagocitosis, el método fluorométrico permitirá la cuantificación de la polimerización de actina mediante la medición de la intensidad de la actina, que se reduce durante la inhibición de lamellipodia, pseudopodiae, y la membrana plasmática como resultado de tratamiento con un inhibidor (Figura 1A). Este es un paso opcional si está interesado en la cuantificación de la polimerización de actina, además de la fagocitosis. Si la polimerización de actina es la meta final, utilizando partículas fluorescentes para la fagocitosis es opcional. <ol><li> Después de la fijación de paraformaldehído (paso 4.3), lavar la placa dos veces con PBS a 100 l por pocillo para cada lavado. Añadir 50 l de 0,1% de Triton X-100 en PBS para la permeabilización e incubar durante -5 min a TA. </li><li> Lave 0,1% de Triton X-100 2 veces con PBS (como anteriormente), y bloquear con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 20 min para evitar la unión no específica de la label. </li><li> Después del bloqueo, retire la solución de BSA y añadir inmediatamente rodamina phalloidin. Para preparar la solución de trabajo de tinción de rodamina, utilice 100 l de solución de metanoico (proporcionado por el fabricante) en 5 ml de PBS (suficiente para una placa). De la solución de trabajo añadir 50 l por pocillo e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. NOTA: Después de las etapas de lavado y tinción DAPI como en el paso 4.4 células estará listo para su cuantificación. </li></ol> 6. Cuantificación <ol><li> Para cuantificar la fagocitosis usando un lector de placas fluorescente, la fluorescencia verde registro usando el filtro de excitación a λ = 488 nm y filtro de emisión de fluorescencia a λ = 518 nm, y azul usando el filtro de excitación a λ = 355 nm y filtro de emisión a λ = 460 nm. </li><li> Para cuantificar la polimerización de la actina usando un lector de placas fluorescente, la fluorescencia azul registro a través de λ = 355 nm y λ = 460 nm (como anteriormente), y rojo de la gripeorescence a través de filtro de excitación a λ = 584 nm y filtro de emisión λ = 620 nm. NOTA: Orbital o detección central es aceptable para la grabación. Algunos tipos de células se reúnen más hasta el borde del pozo que el centro, en el que la grabación orbital caso puede ser ventajoso. En particular, promedio de tres puntos alrededor de la órbita también podría ser usada para obtener resultados más precisos. </li><li> Divida la RFU total de fluorescencia verde o roja por lectura de fluorescencia azul (de DAPI), dependiendo de la etiqueta de partículas o fagocítica vs. cuantificación actina (Diagrama 1). Debido a la alta variación de placa a placa, utilizar índices relativos (tales como relativa a t = 0 control), para ilustrar mejor las tendencias observadas y para facilitar el análisis estadístico más fiable. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las principales limitaciones de la técnica fluorométrica son varianza experimental, así como la pérdida de células asociada con un lavado extensivo y el uso de células no adherentes. Varianza se observa en gran parte debido a la variación en partículas fluorescentes como pesaje y de pipeteado durante la preparación de la solución madre no es una manera exacta de mantener números idénticos de partículas de experimento a experimento. Para abordar el problema de la varianza entre los experiment...

La cuantificación de la señal fluorescente ha sido ampliamente utilizado en una multitud de métodos científicos que van desde PCR, citometría de flujo, microscopía confocal, y el análisis FRET para multiplexar ELISA. Imágenes de fluorescencia y cuantificación tiene una amplia aplicación y puede ser una gran herramienta para el análisis cuantitativo de diversos procesos celulares. El uso de marcadores fluorescentes y su señal se ha revolucionado en la última década, y la aparición de lectores de placas fluorescentes ha facilitado la cuantificación de alto rendimiento de la fluorescencia emitida durante los procesos celulares. Análisis Fluorométrico puede servir como una gran herramienta en la cuantificación de la fagocitosis. La fagocitosis se ha estudiado desde el descubrimiento de los fagocitos por Metchnikoff en 1800 1. A través de los años, una variedad de métodos se han utilizado para examinar este importante proceso esencial para la defensa inmune innata contra la invasión bacteriana, viral, fúngica y parásitos patógenos 2-5. Los métodos anteriores de cuantificación utilizado técnicas de microscopía y estereológicos el fin de visualizar las células que se phagocytosing, que luego se cuantificó por recuento de partículas internalizadas (manualmente o con el uso de software) 6-8. Algunas desventajas en el uso de microscopía solo para el análisis cuantitativo son que el recuento manual de las bacterias es una labor intensiva y más propenso a sesgo del observador. Otro método utilizado en la cuantificación de la fagocitosis es la técnica microbiológica de chapado de bacterias de lisados ​​celulares (siguientes fagocitosis) en placas de cultivo de bacterias, pero este método puede fallar para dar cuenta de los mecanismos bactericidas y presencia de bacterias parcialmente internalizadas. Este método es intensivo incluso más mano de obra en comparación con la microscopía y lleva varios días para analizar. La citometría de flujo parece ser la forma más rápida, más eficaz para cuantificar la fagocitosis y ha sido utilizado por muchos grupos de 9-11, pero el alto costo asociado comúnmente con el eninstrumento necesario para el análisis hace que sea el método más caro en comparación con los ensayos mencionados anteriormente. El método fluorométrico es una buena alternativa a la citometría de flujo para el análisis de la internalización de partículas, ya que ofrece la cuantificación insesgada de fluorescencia utilizando equipo que no es tan costo prohibitivo. Otros beneficios añadidos de fluorometría son de alta eficiencia, y las capacidades de alto rendimiento para la cuantificación de la fluorescencia emitida por las partículas internalizadas etiquetados. Beneficios de la fluorometría pueden extrapolarse a la cuantificación de los procesos distintos de la fagocitosis. Por ejemplo, el análisis fluorométrico se puede aplicar para estudiar cualquier proceso que conduce a cambios en la expresión intracelular o de receptores unidos a membrana, los cambios en la permeabilidad celular / viabilidad, la eficacia de la transfección, y la modulación en la polimerización de actina. Una desventaja de la técnica fluorométrica es que, dependiendo de las etiquetas utilizadas, puede haber un altoexperimento para experimentar la variabilidad que por lo general puede ser resuelto mediante la demostración de los datos a través de la cuantificación relativa, como el cambio veces o por ciento de aumento de control.

<table><tbody><tr><td>1 y mu; m Fluorescentes de color amarillo verdoso fluorescentes;</td><td>Las sondas moleculares</td><td>F8852</td><td>combinan 50&mu; l con 50&mu; l reactivo opsonizante durante 30 min a 37oC antes de su uso</td></tr><tr><td>Muerte por calor E. coli BioParticles fluoresceína conjugada</td><td>Sondas moleculares</td><td>E2861</td><td>reconstituyen (5 mg) en 50 &mu; l de PBS y combinar con 50 &mu; l reactivo de opsonización durante 30 min a 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Reactivo Opsonizante</td><td>Sondas Moleculares</td><td>E2870</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamina Faloidina</td><td>Sondas Moleculares</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Azul Trypan</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Los siguientes artículos están disponibles en muchas marcas, pero los artículos que utilizamos en este estudio son de los siguientes fabricantes:</td></tr><tr><td>Medios de crecimiento celular RPMI</td><td>Gibco</td><td></td><td>Suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina; caliente en 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Lector de placas fluorescentes - Fluostar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (16%)</td><td>Fischer Scientific</td><td>AA433689M</td><td>diluir al 4% antes de usar placas</td></tr><tr><td>de 96 pocillos</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>transparente o negro o fondo transparente - placas negras</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (8 - 12 canales)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Depósitos de</td><td></td> reactivos<td></td><td></td></tr><tr><td>1x Tubos</td> de microfuga PBS <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(0,6 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conicles (10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

alto rendimiento fluorométrico técnica de evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

El objetivo del análisis fluorométrico es servir como un costo efectivo, método rendimiento eficiente, de alta de analizar la fagocitosis y otros procesos celulares. Esta técnica se puede utilizar en una variedad de tipos de células, tanto adherentes y no adherentes, para examinar una variedad de propiedades celulares. Al estudiar la fagocitosis, la técnica fluorométrica utiliza tipos de células fagocíticas tales como macrófagos, y las partículas opsonizadas marcados con fluorescencia, cuya fluorescencia se puede extinguir en presencia de azul de tripano. Después de chapado de macrófagos adherentes en placas de 96 pocillos, partículas fluorescentes (verde o rojo) se administran y las células se les permite fagocitar por cantidades variadas de tiempo. Después de la internalización de las partículas fluorescentes, las células se lavan con azul de tripano, lo que facilita la extinción de la señal fluorescente a partir de bacterias que no se internalizan, o son simplemente se adhieren a la superficie de la célula. A continuación del lavado de tripano, las células se lavaron con PBS, se fijaron, unand teñidas con DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que sirve para etiquetar núcleos de las células. Por una sencilla cuantificación fluorométrico través de la lectura de la placa nuclear (azul) o de partículas (verde / rojo) de fluorescencia que puede examinar la relación de unidades relativas de fluorescencia de color verde azul y determinar un índice de fagocitosis indicativo de la cantidad de bacterias fluorescentes internalizadas por célula. La duración del ensayo utilizando un método y multicanal 96 pocillos pipetas para el lavado, desde el extremo de la fagocitosis hasta el final de la adquisición de datos, es menos de 45 min. La citometría de flujo podría ser utilizado de una manera similar pero la ventaja de fluorometría es su alto rendimiento, rápido método de evaluación con una mínima manipulación de las muestras y cuantificación rápida de intensidad de fluorescencia por célula. Estrategias similares se pueden aplicar a las células no adherentes, bacterias marcadas en vivo, la polimerización de actina, y esencialmente cualquier proceso que utiliza fluorescencia. Por lo tanto, fluorometría es un método prometedor para su bajo costo, alta throughpcapacidades ut en el estudio de procesos celulares.

Dos de las principales formas de cuantificar la fagocitosis y la polimerización de la actina posterior a través de la utilización de este protocolo es observar la fagocitosis continuo o sincronizado. El análisis microscópico (Figura 1B) ilustra imágenes fluorescentes comparables a lo que está grabando el fluorómetro (también ver Diagrama 1). En la Figura 1B son fluorescencia roja de actina, verde 268 de fluorescencia de FITC etiquetas HKOP <...

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar los cambios en el proceso fagocítico o actuar en la polimerización tras la adición de agonistas o antagonistas. Esto se logra mediante la adición de partículas marcadas con fluorescencia a las células fagocíticas y dejando tiempo suficiente para que se produzca la fagocitosis. Como segundo paso para detener la fagocitosis, las células se tratan con azul de triam para extinguir la fluorescencia de las partículas no internalizadas, lavadas y posteriormente fijadas con paraldehído.Lo siguiente es la tinción y la cuantificación. Con el fin de facilitar la detección fluorescente de células y partículas, células sostenidas con DPI o actina, los resultados muestran el efecto del tratamiento sobre la fagocitosis y la polimerización de actina cuantificado a través de una relación de fluorescencia verde-roja a azul basada en un análisis fluorométrico. La principal ventaja de la técnica fluorométrica sobre los métodos existentes es que es un método rentable y de alto rendimiento para la evaluación de la fagocitosis.Permite una manipulación mínima de la muestra y una cuantificación rápida de la intensidad fluorescente por célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología y la biología celular, como la eficacia y la rapidez de esta eliminación de patógenos. Acción de la polimerización que cambia durante la fagocitosis y cómo se modula la fagocitosis o polimerización axonal por agonistas o antagonistas.Para comenzar la placa de procedimiento, los macrófagos de la línea celular murina J 7 74 en una placa de 96 pocillos con un fondo transparente o negro incuban las células de adherencia a 37 grados Celsius durante una o dos horas para permitir que el adion llegue a la placa. A continuación, añada los agonistas o antagonistas deseados o el control del vehículo a las células a una concentración de dos x en 50 microlitros de PBS o medios suplementados e incube durante la cantidad de tiempo deseada. En este paso, asegúrese de que las partículas fluorescentes y las etiquetas estén protegidas de la luz en todo momento durante el procesamiento, el lavado y la incubación.Para evitar el fotoblanqueo, utilice las partículas en suspensión, como las perlas de dextra marcadas con fluorescencia, o explique la solución madre durante un minuto. A continuación, añada una cantidad igual de reactivo opsonizante a las partículas fluorescentes y agite vigorosamente el vórtice durante otro minuto. Posteriormente, se incubó la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora después de la centrifugación de las partículas, que estuvo cinco minutos en la centrifugación.A 500 veces G.Eliminar el sobrenadante S que contiene el exceso de reactivo opsonizante. Después de eso, lave las partículas con 100 microlitros de PBS. Agite la muestra para resuspender el gránulo y centrifugue durante cinco minutos de 500 a veces G. Repita estos pasos dos veces más para asegurar la optimización adecuada y la eliminación del anticuerpo no unido.Para preparar la solución de trabajo de partículas ionizadas, vuelva a suspender las partículas en cinco mililitros de medio. A continuación, guárdelo lejos de la luz hasta que se siga utilizando. Ahora coloque la solución de trabajo de partículas en un depósito de reactivo estéril.Agregue 50 microlitros de partículas de opsonizado a las células preparadas anteriormente hasta una concentración final de 15 nanogramos por mililitro, y permita que la fagocitosis ocurra en condiciones estándar de cultivo celular. Para el método de fagocitosis continua, espere de 30 minutos a una hora para que las partículas fluorescentes lleguen al fondo del pocillo y entren en contacto con las células. Si realiza un experimento de curso de tiempo, agregue bacterias en diferentes intervalos de tiempo y detenga toda la placa de reacciones al mismo tiempo.Para mejorar la velocidad de procesamiento de las células de adherencia, retire el sennet y agregue 50 microlitros de azul de triam diluido con PBS para extinguir la fluorescencia de las bacterias no internalizadas después de la incubación de trian. Lave la placa dos veces con PBS para eliminar cualquier trian residual. A continuación, fije las células con 50 microlitros de paraldehído al 4% e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.A continuación, lave la placa con PBS. Retire todo el líquido y agregue 50 microlitros de DPI Después de cinco minutos de tinción, lave la placa dos veces con PBS. Posteriormente, se añadan 50 microlitros de PBS a cada pocillo y se registre la fagocitosis tras la fijación con paraldehído.Lave la placa dos veces con 100 microlitros de PBS por pocillo para cada lavado. A continuación, añada 50 microlitros de Triton X 100 en PBS al 0,1% a las células para que penetren y colévelas durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave el 0.1%Triton X con PBS dos veces.A continuación, bloquee las células con 1%BSA durante 20 minutos para evitar la unión inespecífica de la etiqueta. Ahora prepare la solución de trabajo de la tinción de Rod Domine agregando 100 microlitros de solución madre de metanol en cinco mililitros de PBS. Después del bloqueo, retire la solución BSA inmediatamente.Agregue 50 microlitros de foid ruminal y solución de trabajo a cada pocillo e incube las células en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para cuantificar la fagocitosis, coloque la placa en un lector de placas fluorescentes Registre la fluorescencia verde utilizando un filtro de excitación a una longitud de onda de 488 nanómetros y un filtro de emisión a una longitud de onda de 518 nanómetros y la fluorescencia azul utilizando un filtro de excitación a una longitud de onda de 355 nanómetros y un filtro de emisión a una longitud de onda de 460 nanómetros. Para cuantificar la polimerización de actina utilizando un lector de placas fluorescentes, registre la fluorescencia roja a través de un filtro de excitación a una longitud de onda de 584 nanómetros y un filtro de emisión a una longitud de onda de 620 nanómetros y fluorescencia azul.Filtro de fuego y excitación a una longitud de onda de 355 nanómetros y un filtro de emisión a una longitud de onda de 460 nanómetros. A continuación, divida la RFU total de fluorescencia verde o roja por la lectura de fluorescencia azul en función de la etiqueta de partículas o la cuantificación fagocítica frente a la actina debido a la placa alta. Para determinar la varianza, utilice índices relativos para ilustrar mejor las tendencias observadas y facilitar un análisis estadístico más fiable.Esta imagen ilustra los cambios en la polimerización de actina después de la adición de un inhibidor. Estos son la formación de seudópodos y aquí están los cambios en el ondulamiento de la membrana. En esta imagen, se permitió a las células internalizar cuentas X conjugadas en una proporción de 20 a una cuenta por celda durante 60 minutos.Luego, las células se lavarán con trian y PBS fijados con paraldehído, permeables con acetona y se teñirán para F actin Usando rod domine, F loin y dpi, la fagocitosis continua de partículas opsonizadas y no oxidadas es bastante comparable. Donde J 7 74 células están interiorizando cuentas dextra. Curiosamente, la polimerización de actina después de la fagocitosis aumenta, desacelerándose en puntos de tiempo posteriores, mientras que la polimerización de actina después de la internalización de partículas unop no aumenta, ni los métodos fagocíticos que usan partículas dextra dan como resultado cambios en la viabilidad celular Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una o dos horas con múltiples placas a la vez si se realiza correctamente.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo utilizar el análisis métrico de fluor como un método eficiente y rentable de alto rendimiento para analizar la fagocitosis y otros procesos celulares.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, estudiamos la interacción tumor-macrófago utilizando un ensayo de interacción de macrófagos transpocillos basado en fluorescencia. El ensayo consiste en el análisis de la migración de macrófagos a través de quimiotaxis inducida químicamente.

Ensayo de atracción de macrófagos transpocillos basado en fluorescencia: un método in vitro para estudiar la interacción tumor-macrófago a través de la quimiotaxis inducida químicamente

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

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Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando la fluorescencia verde mayor expresando proteínas de Escherichia coli.

Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

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Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

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Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

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Aprende a cuantificar la fagocitosis y la polimerización de actina en macrófagos mediante un método fluorométrico de alto rendimiento. Esta técnica permite evaluar el efecto de agonistas y antagonistas de forma eficiente.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

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