Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal En Vivo Imágenes de la médula espinal de ratón

En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados ​​y demostraron.

El objetivo general de este procedimiento es implantar una cámara de imágenes sobre la médula espinal dorsal de un ratón para permitir la obtención de imágenes ópticas longitudinales sin la necesidad de repetir las convulsiones quirúrgicas. Esto se logra exponiendo primero tres vértebras torácicas y eliminando el tejido blando por encima de la columna vertebral. El segundo paso es pinzar las vértebras expuestas utilizando las piezas laterales de la cámara y realizar una laminectomía dorsal.

A continuación, la placa superior de la cámara se fija firmemente sobre la médula espinal expuesta y se sella con elastómero de silicona y un cubreobjetos. El paso final es sellar la piel alrededor del implante con adhesivos y permitir que el animal se recupere. En última instancia, la microscopía de fluorescencia multifotónica se utiliza para obtener imágenes del comportamiento celular y la estructura del tejido en la médula espinal con resolución subcelular a lo largo del tiempo.

La principal ventaja de nuestra nueva metodología sobre los métodos existentes, como la apertura quirúrgica repetida de la médula espinal, es la capacidad de tener un número casi arbitrario de puntos de tiempo de imagen distribuidos durante un largo período de tiempo sin las complicaciones asociadas con la cirugía repetida, como una posible infección, un trauma quirúrgico o el estrés de los animales. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando estábamos considerando el éxito previo de las imágenes longitudinales después de una lesión de la médula espinal en el pez cebra transparente. Entonces decidimos expandir este paradigma al modelo de mamíferos.

Comience este procedimiento afeitando el área del arco torácico de un ratón anestesiado con flúor. A continuación, retira el pelo recortado. A continuación, administre la mezcla de solución salina, ketoprofeno y dexametasona al ratón por vía subcutánea.

Usando bastoncillos de algodón. Realice tres lavados alternos de yodo y etanol al 70%, y espere un minuto entre lavados. Después de eso, administre 100 microlitros de bupivacaína al 0,125% en el centro del parche afeitado por vía subcutánea para reducir el dolor en el sitio de la incisión.

A continuación, transfiere el ratón a los ataques estéreo personalizados. Inserte el termómetro rectal y espere aproximadamente 10 minutos para que la bupivacaína haga efecto bajo el microscopio. Haz una incisión de cinco milímetros por encima de las vértebras de interés con una hoja de bisturí.

Después de eso, aumente el tamaño de la abertura en la piel mediante una disección roma. A continuación, disocie suavemente la fascia conectiva entre la piel y el músculo subyacente. Sujete la piel hacia atrás para obtener un área de trabajo más grande con los retractores y tenga cuidado de no aumentar el peso en el pecho y obstruir la respiración.

A continuación, agarre la rostral, la mayor parte de la vértebra que quedará expuesta a través del músculo suprayacente, con un par de fórceps. Corta el tejido a ambos lados de la apófisis dorsal lejos de tres vértebras. Posteriormente, retire todo el tejido suprayacente de la lámina dorsal.

Después, corte con cuidado los tendones unidos a las vértebras en ambos bordes laterales de la columna vertebral. Retire suavemente la mayor cantidad posible de tejido de los bordes laterales de la columna de vértebras para proporcionar una superficie de sujeción limpia. A continuación, desbride suavemente las vértebras de cualquier tejido blando restante.

Con un raspador de huesos y un hisopo de algodón, recorte cualquier tejido incongruente con las tijeras quirúrgicas. A continuación, ajuste los retractores para retener el tejido que rodea la columna de vértebras. Junto con la piel, fije las barras laterales del implante a las puntas de los postes de entrega y colóquelas en los soportes de los postes.

A continuación, sujete las tres vértebras. Usar las barras laterales aplicando la presión suficiente para sujetarlas de forma segura. A continuación, utilice las pinzas para ayudar a asegurar un pinzamiento nivelado de las tres vértebras.

Asegúrese de que las barras laterales estén niveladas y paralelas antes de realizar la laminectomía. Después de eso, limpie y seque cuidadosamente la superficie dorsal de las vértebras pinzadas con hisopos de algodón. En este procedimiento, inserte las puntas de las tijeras Vana en el espacio epidural de la vértebra pinzada medial y apriete ligeramente los mangos.

Si el hueso está seco, debe agrietarse a lo largo de la lámina dorsal. Repita este procedimiento en el lado contralateral para liberar la lámina mientras agarra la lámina suelta. Suavemente por la apófisis dorsal con fórceps, corte cuidadosamente cualquier tejido conectivo en los extremos rostral y mimado de la lámina. A continuación, lave a fondo la sangre que recubre la médula espinal con solución salina al 0,9% o espinal cerebral artificial, absorba el exceso de líquido con bastoncillos de algodón.

Después de eso, recorte los bordes laterales del hueso y proceda a las barras laterales del implante. Posteriormente, controle el sangrado con hisopos de algodón y solución salina. En el caso de que una parte del periostio se haya desprendido y se superponga a la médula espinal, retire suavemente el tejido con hisopos de algodón y una aguja de calibre 29 a 30.

Tenga cuidado de no lesionar la médula espinal y no confunda el periostio suelto con un dator bien envuelto. Al final. Selle los bordes expuestos restantes del hueso con dientes dentales, acrílico y cianoacrilato.

Tenga especial cuidado para evitar que el pegamento entre en contacto con la médula espinal expuesta. Ahora, coloque la placa superior en el animal con cuidado para que las cuatro ranuras se alineen con los cuatro orificios de las barras laterales y la abertura se superponga a la médula espinal expuesta. Con un destornillador de joyería, comience con cuidado con el primer tornillo, estabilizando el eje del destornillador con otro par de pinzas.

No apriete el tornillo en esta etapa, sino insértelo de modo que las primeras roscas queden enganchadas. Repita este proceso para los otros tres tornillos. Con los cuatro tornillos en su lugar, apriete cada tornillo alternativamente en los mismos incrementos pequeños hasta que todos los tornillos estén firmemente asegurados.

A continuación, utilice el elastómero de silicona de la marca quick sill para rellenar el espacio entre la médula espinal y la ventana de vidrio y aplíquelo sobre la médula espinal expuesta. Asegúrese de deshacerse de cualquier silicona que contenga burbujas de aire de la punta de mezcla antes de su aplicación. A continuación, coloque rápidamente un cubreobjetos de cinco milímetros en el inserto de la placa superior.

Aplique suficiente presión para exprimir gradualmente el elastómero líquido para rodear la médula espinal, pero sin provocar la compresión de la médula espinal. Después, cubra los bordes del elastómero exudado con material dental, acrílico y cianoacrilato, y utilice los adhesivos para adherir el elastómero al hueso circundante tanto como sea posible para evitar que el elastómero se desplace sobre la superficie de la médula espinal. A continuación, retire los retractores y tire de la piel hacia arriba alrededor del borde del implante.

Utilice el cianoacrilato para adherir la piel a los bordes del implante. Después de eso, inserte los tornillos en las alas de la placa superior. Posteriormente, selle los espacios en las ranuras de los tornillos de la placa superior con acrílico dental antes de volver a colocar al animal en la jaula para su recuperación.

Antes de las sesiones de imagen, anestesiar el ratón de nuevo y fijar los tornillos expuestos del implante a los postes roscados para su estabilización. Esta figura muestra que una cámara espinal crónica permanece ópticamente transparente durante varias semanas. Se trata de imágenes de la médula espinal de color blanco a claro que van desde varios minutos hasta tres semanas después de la operación.

Los puntos de referencia vasculares son identificables en todos los puntos de tiempo. Se observan pocos cambios un día después de la cirugía. El sobrecrecimiento fibroso denso está presente en parte de la ventana a partir de los tres días y da lugar a una ofuscación parcial del área de la imagen.

También hay neovascularización leve, pero no oscurece la vasculatura original con luz blanca o dos imágenes de PEF. La cámara espinal crónica permite la repetición de imágenes multifotónicas sin necesidad de cirugías repetidas. Aquí están las imágenes de un ratón transgénico que expresa YFP en un subconjunto de axones DRG en los fii dorsales de la médula espinal.

La vasculatura se marcó mediante inyección de tinte intravascular que se muestra en rojo. La actividad de la microglía también se puede rastrear a lo largo del tiempo en el muslo, un YFP CX, tres CR, un ratón transgénico doble GFP, mientras que los axones y la microglía permanecen visibles. El contraste y la resolución disminuyen modestamente con el tiempo.

Una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente después de su desarrollo. Esta técnica nos allanó el camino para explorar la heterogeneidad temporal y espacial de la muerte regresiva de los axones después de una lesión de la médula espinal.

Y ratones.