Name: Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal En Vivo Imágenes de la médula espinal de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende a implantar una cámara óptica en la médula espinal dorsal de ratón para imagen longitudinal sin cirugías repetidas. Este método permite estudiar la dinámica celular con microscopía de fluorescencia multiphoton.

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Agradecemos al Dr. Joseph R. Fetcho por su aporte a lo largo del desarrollo del procedimiento. Nos gustaría agradecer la financiación de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (R01 EB002019 a C.B.S y DP OD006411 a Joseph R. Fetcho) y al Consejo Nacional de Ciencia e Investigación de Canadá (a M.J.F.) por su apoyo financiero.

NOTA: El cuidado y la manipulación experimental de todos los ratones de este documento fue aprobado por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Cornell. 1. Configuración de Cirugía <ol><li> Esterilizar todos los instrumentos necesarios utilizando un autoclave o procedimientos de esterilización aprobados. Como mínimo, incluir un bisturí, tijeras, tijeras Vanna, pinzas, desarmador de joyero, hisopos de algodón, un conjunto de retractores, el implante (Figura 1A) y su sistema de entrega (Figura 1 D, E). </li><li> Limpie todas las superficies, incluyendo cualquier perillas estereoscopio, con etanol al 70% y / o desinfectantes adecuados. </li><li> Crear un campo estéril sobreponiendo el stereotax personalizado (Figura 1D) y los alrededores de sobremesa con paños estériles. Una almohadilla térmica (preferiblemente realimentación controlada) debe ser colocado en la parte superior de la stereotax y bajo los paños estériles. </li></ol> 2. Preparaciónel ratón de Cirugía <ol><li> Anestesiar un ratón debajo del 5% de isoflurano / oxígeno en una cámara de inducción hasta que la frecuencia respiratoria disminuye a aproximadamente 1 respiración / seg. </li><li> Transferencia de ratón a un área de ensayo fuera del campo estéril, usando un cono de la nariz para continuar la exposición isoflurano. Reducir isoflurano al 2%. Aplicar colirio para prevenir la sequedad de la córnea. </li><li> Administrar glicopirrolato (un fármaco anticolinérgico) a 0,05 mg / 100 g de ratón por vía intramuscular en los miembros posteriores utilizando 29-30 agujas G y 3/10 cc jeringa, la entrega de aproximadamente el 50% del volumen de inyección por extremidad. NOTA: Glycopyrrolate sirve para evitar la acumulación de líquido en los pulmones, mientras que el ratón está bajo anestesia. </li><li> El uso de máquinas de cortar eléctricos, afeitarse una porción de la cara dorsal del ratón, aproximadamente 3 cm de largo por 2 cm de ancho y centrado en el arco torácico. Limpie cualquier pelo recortado bien lejos de la zona afeitada. </li><li> Administrar las siguientes inyecciones por vía subcutánea y distal a la afeitadaparche con 29 a 30 agujas G 3/10 y jeringas CC: 1 ml / 100 g de ratón 5% de glucosa en solución salina (para la hidratación), 5 mg / kg ketoprofeno ratón (un AINE para la analgesia), 0,2 mg / kg de dexametasona ratón ( un esteroide antiinflamatorio para reducir la inflamación). </li><li> El uso de bastoncillos de algodón, realizar tres lavados alternados de yodo y etanol al 70%, 1 min de espera entre lavados. </li><li> Administrar 100 l de bupivacaína al 0,125% (un bloqueo nervioso periférico) por vía subcutánea usando 29 a 30 agujas G y 3/10 cc jeringa para el centro del parche de afeitado para reducir el dolor en el sitio de la incisión. </li><li> Transferencia de ratón para el stereotax personalizado (Figura 1D), inserte el termómetro rectal, y esperar aproximadamente 10 minutos para bupivicaína surta efecto. </li></ol> 3. Exponer y Limpie el dorsal Láminas de 3 Adyacente Vértebras torácicas <ol><li> Uso de la hoja de bisturí, crear un pequeño (5 mm o menos) de la incisión por encima de las vértebras de interés (Figura 2A). </li><li&gt; Uso de fórceps o mediante la inserción de la punta de tijeras quirúrgicas y la difusión de las asas, aumentar el tamaño de la abertura en la piel por disección roma. </li><li> El uso de un bisturí o unas tijeras quirúrgicas, disociar suavemente fascia conectivo entre la piel y el músculo subyacente. </li><li> Use retractores de contener la piel, permitiendo tan grande un área de trabajo como sea posible (Figura 2B). Tener cuidado de no aumentar la carga en el pecho y de ese modo obstruir la respiración. </li><li> El uso de un par de pinzas, agarre el rostral-más vértebra que estará expuesta a través del músculo suprayacente. Usando un bisturí, el tejido cortado a ambos lados del proceso dorsal de todo 3 vértebras (Figura 2c). </li><li> El uso de cualquier combinación de una hoja de bisturí, hisopos de algodón, y / o un raspador de hueso, eliminar todo el tejido que recubre a partir de las láminas dorsal (Figura 2D). </li><li> Con unas tijeras quirúrgicas, corte con cuidado tendones unidos a las vértebras en ambos lateral bordes de la columna vertebral (Figura 2E). </li><li> Utilizando el bisturí, eliminar suavemente mayor cantidad de tejido a partir de los bordes laterales de la columna vertebral como sea posible a fin de proporcionar una superficie de sujeción limpio. </li><li> Desbridar suavemente las vértebras de cualquier tejido blando restante usando un raspador de hueso y / o hisopo de algodón. Recorte cualquier tejido incongruente en otro lugar utilizando tijeras quirúrgicas (Figura 2F). NOTA: Es esencial tanto para sujeción y la realización de la laminectomía dorsal que las vértebras están expuestos limpiamente. A cauterizador puede ser útil en el control de la hemorragia posterior. </li><li> Shift retractores para contener el tejido que rodea la columna vertebral, además de la piel (Figura 2F). </li><li> Coloque las barras laterales de implantes a las púas en los postes de entrega y cargar estos en los post-titulares (como en la figura 1E). </li><li> Sujete el 3 vértebras usando las barras laterales, aplicando la presión suficiente para mantener securely (Figura 2G, H). El uso de fórceps para ayudar a asegurar una sujeción nivel del 3 vértebras. Tenga en cuenta que varios intentos pueden ser necesarios. Asegúrese de que las barras laterales son tanto a nivel y paralelo antes de realizar la laminectomía. </li><li> Con cuidado, limpie y seque la superficie dorsal de las vértebras sujetada mediante hisopos de algodón. </li></ol> 4. Realizar una laminectomía dorsal <ol><li> Inserte la punta de las tijeras Vannas en el espacio epidural de la vértebra sujetada medial y los apriete a la ligera; si el hueso está seca, debe grieta a lo largo de la longitud de la lámina dorsal. Repita este procedimiento en el lado contralateral para liberar la lámina. </li><li> Agarre suavemente la lámina suelta por el proceso dorsal con fórceps, cuidadosamente cortar cualquier tejido conectivo en los extremos rostral y caudal de la lámina y levante a la basura. </li><li> El uso de solución salina 0,9% y / o líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), lave la basura cualquier overlyi sangreng de la médula espinal. Use hisopos de algodón para absorber el exceso de líquido. </li><li> Con unas tijeras Vannas, recorte cuidadosamente los bordes laterales de la columna vertebral a las barras laterales del implante. Una vez más, lavar y controlar el sangrado mediante hisopos de algodón y solución salina / ACSF. </li><li> En el caso de que una parte del periostio se ha separado y se superpone a la médula espinal, eliminar suavemente este tejido usando hisopos de algodón y / o un 29 - aguja de 30 G. Tenga cuidado de no dañar la médula espinal en esta parte del procedimiento. No hay que confundir el periostio suelto con la duramadre tapados. </li><li> Con cuidado, sellar los bordes expuestos restantes del hueso con uno o ambos de acrílico y cianoacrilato dental (Figura 2I). Tenga especial cuidado de no permitir que las colas fluyan a la médula espinal expuesta. </li></ol> 5. Selle la Cámara <ol><li> Coloque la placa superior con cuidado para que las 4 ranuras se alinean con los 4 agujeros en los paneles laterales y la apertura se superpone a la vuelta expuestaal cable (Figura 1B y 2J). </li><li> Usando un destornillador de joyero, iniciar cuidadosamente el primer tornillo, estabilizando el eje del destornillador con otro par de pinzas. No apriete el tornillo en esta etapa, pero la inserta de manera que las primeras roscas están comprometidos. Repita este proceso para los otros 3 tornillos. NOTA: Es útil el uso de titanio u otros fórceps no magnetizables para ayudar a colocar los tornillos en esta etapa. </li><li> Con los 4 tornillos en su lugar, apriete cada tornillo, alternativamente, por la misma cantidad en pequeños incrementos hasta que los tornillos están bien sujetos (Figura 2C). Tenga en cuenta que no es inusual para la placa superior se flexione durante este proceso. Tenga cuidado de no apretar demasiado los tornillos, ya que la cabeza del tornillo puede romper y excesiva presión a la baja va a desalojar a la abrazadera y / o resultar en lesiones de la médula espinal. </li><li> Utilice un elastómero de silicona para llenar el espacio entre la médula espinal y la ventana de vidrio. Porque doeNO producir ácido acético durante el curado, utilice KwikSil elastómero marca y puntas de mezcla. Aplicar una porción liberal de la silicona a la médula espinal expuesta. Tenga cuidado para deshacerse de cualquier silicona que contiene burbujas de aire de la punta de mezcla antes de la aplicación a la médula espinal. </li><li> Trabajando rápidamente, presione suavemente a 5 mm # 0 cubreobjetos en la inserción en la placa superior. Aplicar suficiente presión para apretar gradualmente el elastómero líquido para rodear la médula espinal, pero no resultar en compresión de la médula espinal (Figura 2L). Ajuste de tiempo para que el elastómero es de aproximadamente 90 segundos, así que asegúrese de que el cubreobjetos se aplica rápidamente. </li><li> En el caso de un cierre fallido, espere hasta que el elastómero se ha puesto, retire con cuidado desde el implante con fórceps, y repetir 05.04 a 05.05. </li><li> Cubrir los bordes de elastómero exudado con dental acrílico / de cianoacrilato y adherirse al hueso circundante tanto como sea posible para evitar que el elastómero se desplace sobre la superficie de la médula espinal. </li><li> Retire retractores y tire de la piel alrededor del borde del implante. Uso de cianoacrilato, se adhieren a la piel a los bordes del implante (Figura 2 M, N). </li><li> Inserte # 0-80 - 1/4 &quot;set tornillos en las alas de la placa superior (Figura 1C y 2 O). </li><li> El uso de acrílico dental, sellar los huecos en las ranuras de los tornillos de la placa superior (Figura 2P). </li></ol> 6. Cuidado posoperatorio <ol><li> Retire los animales de la anestesia y el lugar en una gran jaula limpia. Asegúrese de que la jaula es suficientemente grande para que la cámara no se pega en nada (como la inmersión en forma de V para una botella de agua y / o alimentos) durante el curso de la locomoción normal a lo largo de la jaula. NOTA: Una jaula de ratas estándar es ideal. </li><li> Coloque la jaula en una superficie calentada mientras el animal se recupere. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li><li> Compruebe beha animalesVior dentro de 1 - 2 horas después de la operación para detectar signos de dolor o angustia y la integridad del implante. NOTA: En condiciones normales, el animal debe ser capaz de deambular con perturbaciones modestos a la circulación. </li><li> Continúe revisando animales cada 8-12 h durante las primeras 72 horas, la medición de peso y el monitoreo del comportamiento. Compruebe que los animales son activos y móvil durante la noche. Alimento húmedo en forma de suelo Chow mezcla con agua o geles nutricionales, pellets de perro chino, y el agua potable debe ser proporcionada a nivel del suelo. Hidratación adicional mediante inyecciones subcutáneas o intraperiotoneal debe proporcionar según sea necesario. </li><li> Administrar 5 mg / kg ketoprofeno ratón y 0,2 mg / kg por vía subcutánea dexametasona ratón a las 24 y 48 puntos de tiempo hr, después de la operación. Además, desde 0,005 hasta 0,010 mg / 100 g de ratón debe administrarse cada 8 h por inyección subcutánea durante 72 h. </li></ol> 7. En Vivo Imaging <ol><li> Anestesiar un ratón bajo5% de isoflurano / oxígeno en una cámara de inducción hasta que la frecuencia respiratoria disminuye a aproximadamente 1 respiración / seg. </li><li> Traslado del ratón a la stereotax personalizado (Figura 1D) con realimentación controlada almohadilla térmica e insertar un termómetro rectal. Reducir isoflurano al 2%. </li><li> Administrar glicopirrolato 0,05 mg / 100 g por vía intramuscular ratón en los miembros posteriores utilizando 29-30 agujas G y 3/10 cc jeringa, la entrega de aproximadamente el 50% del volumen de inyección por extremidad. </li><li> Administrar 1 ml / 100 g de ratón 5% de glucosa (para la hidratación en solución salina) por vía subcutánea una vez por hora. </li><li> Inserte los soportes de cámara roscados en los post-titulares utilizados para la cirugía (Figura 1F). Ajuste la altura y torcer los puestos en los tornillos de ajuste en la placa superior. </li><li> Con ambos titulares unidos, elevar los titulares de los puestos titulares hasta el pecho puede expandirse libremente en la inspiración. NOTA: Tanto el firme compromiso de los titulares y la libre expansión del significativos llevados pechoTLY reducir los artefactos de movimiento debido a la respiración. </li><li> Realizar las imágenes si lo deseas. </li><li> Cuando la imagen se haya completado, los puestos más bajos, retorcer, los titulares de la cámara, retire el termómetro rectal, y el lugar del ratón sobre una superficie caliente para recuperarse. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li></ol>

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<li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081(2013).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826(2013).</li>
<li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular%2C+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar y no tienen intereses financieros en competencia.

La técnica ha demostrado aquí permite repetida, lapso de tiempo, las imágenes en vivo del ratón dorsal SC a muchas semanas después de la operación sin necesidad de procedimientos quirúrgicos posteriores. Este procedimiento representa una mejora sustancial sobre los estudios de imagen de repetición de la cirugía o más de los enfoques histológicos portmortem, donde se pierde la información sobre la dinámica celular. Tenemos previamente 30 demostraron el valor de esta técnica para el estudio de la patología SCI en vivo. La extensión longitudinal máxima de formación de imágenes se determinó mediante el crecimiento de un tejido denso y fibroso sobre la superficie dorsal de la SC. Con el tiempo, este crecimiento resultó en la pérdida de contraste y resolución de imagen. Este crecimiento también se ha visto en las preparaciones quirúrgicas alternativas 31. Anecdóticamente, hemos observado que este crecimiento puede ser minimizado mediante el lavado cuidadosamente la superficie dorsal SC para eliminar productos de la sangre, el sellado de la superficie deel hueso cortado con cianoacrilato, sellando los bordes de la cámara de bien con elastómero de silicona, y minimizando el espacio intersticial entre el SC dorsal y el vidrio de cubierta. Recientemente, otro enfoque similar a nuestro propio uso de una cámara de policarbonato se ha demostrado 32. El uso de policarbonato es ventajoso puesto que es compatible con rayos X y las modalidades de formación de imágenes acústicas, que no es el caso para nuestras piezas de acero inoxidable. Sin embargo, con la tecnología ahora ubicua de las impresoras 3D, partes de la cámara se pueden fabricar a partir de una amplia variedad de materiales para adaptarse a necesidades específicas. Hemos impreso recientemente todas nuestras partes en un fotopolímero clara. Una desventaja clave de una cámara cerrada es la incapacidad para administrar dosis repetidas de drogas o colorantes exógenos adecuados para la formación de imágenes 34 SC. Sin embargo, mediante la capitalización de la estabilidad mecánica de nuestro sistema actual, ya hemos utilizado nuestra cámara presente para el éxitoLy anclar un catéter intratecal conectado a un puerto de inyección implantado subcutáneamente, lo que permitió la administración de fármacos en múltiples puntos de tiempo incluso en un sistema de cámara cerrada (trabajo no publicado). Además, debido a la naturaleza modular de la placa superior, las futuras versiones de esta preparación se incluir una cámara de resellable para permitir la aplicación repetida de ambos agentes terapéuticos y etiquetas fluorescentes. También es posible prever placas superiores con estuches para la grabación de electrodos, insertos ópticos y puertos para suministro de fármacos. Tales adiciones probablemente serían más difíciles de poner en práctica el uso del sistema más minimalista de Fenrich et al., 31. En conclusión, nuestro cámara proporciona una plataforma de puerta de enlace sobre el cual se pueden basar diversos experimentos.

Time-lapse en microscopía vivo en organismos intactos permite la visualización directa de los procesos biológicos complejos que son inaccesibles para el análisis tradicional punto de una sola vez, como la inmunohistoquímica. Específicamente, la microscopía de múltiples fotones (MPM) 1 permite la formación de imágenes en la dispersión de tejido, tal como el neocórtex roedor, donde se ha logrado de formación de imágenes hasta 2,3 y en exceso de 4 1 mm. Cuando se combina con las preparaciones quirúrgicas 5-7 en los que un procedimiento permite acceso óptico al cerebro durante semanas a meses, estos enfoques de microscopía se han utilizado para estudiar los procesos dinámicos en el cerebro en estados sanos y enfermos 8-11. Además, los protocolos se han desarrollado 12,13 que proporcionan para formación de imágenes in vivo en animales despiertos (es decir, no anestesiados), lo que permite la imagen funcional celular resolución durante ensayos de comportamiento. Estos protocolos se han utilizado para Comparisons de correlacionado la actividad neuronal 14, calcio astrocito señalización 15 en animales anestesiados y despiertos, la identificación de los grupos neuronales específicos de la tarea 16, y la capacidad de las neuronas para discriminar la localización de objetos a la estimulación de la barba 17. Dado el potencial de este enfoque para elucidar los mecanismos sanos y patológicos, de lapso de tiempo de imágenes in vivo se aplicó a la médula espinal de ratón (SC), lo que permite la identificación de la degeneración axonal aguda (AAD) como un mecanismo de la enfermedad 18. Estudios posteriores efectos de las lesiones periféricos en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) axón de regeneración 19, el papel de los vasos sanguíneos en la regeneración de axones 20, quimiotaxis glial en respuesta a la lesión 21, la migración de células T en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) 22, la actividad investigados de la microglia y astrocitos 23,24 25 en respuesta a amyotrophesclerosis ic lateral (ALS), el papel de STAT-3 en crecimiento axonal después de la lesión SC (SCI) 26, y un mecanismo de pérdida de axón y recuperación de la EAE 27. A pesar del éxito de estos enfoques, todos estos estudios se limitaron a ya sea una sola sesión de imágenes, limitando así los estudios de dinámica de corto plazo, o de lo requerido repetida aberturas quirúrgicas de los animales en cada punto de tiempo de formación de imágenes, limitando el número de puntos de tiempo accesibles y el aumento de la probabilidad de artefactos experimentales de confusión. Los protocolos para estas cirugías han sido publicados anteriormente 28,29. Recientemente, publicamos una técnica 30 para la implantación de una cámara de médula crónica que permitió time-lapse de imágenes MPM en el SC ratón sobre varias semanas sin necesidad de reintervenciones. Brevemente, esta preparación quirúrgica incluyó la realización de la laminectomía en la columna torácica inferior y la implantación de una cámara de cuatro partes. La cámara incluyetres piezas a medida mecanizadas de acero inoxidable que se ligan las vértebras que rodea la laminectomía y un cubreobjetos de vidrio colocada sobre el SC y asegurado con elastómero de silicona. Esta técnica permitió la proyección de imagen de rutina a más de 5 semanas de la operación en los estados sanos y heridos sin la necesidad de reintervenciones. El número de puntos de tiempo de formación de imágenes se limita solamente por la frecuencia a la que el animal puede tolerar la inducción anestésica. Curso de la vida Imaging estaba limitado por el crecimiento de un tejido denso y fibroso sobre la superficie de la SC. Además, hemos comprobado que el implante quirúrgico no tuvo ningún efecto a largo plazo sobre la función motora. Desde nuestra publicación inicial, los enfoques alternativos que permitan también la imagen a largo plazo en el SC se han descrito en otra parte 31-33. Este protocolo demuestra nuestro procedimiento para la implantación de la cámara de la médula desarrollamos.

<table><tbody><tr><td>Tijeras Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td></td></tr><tr><td>pinzas, tijeras, bisturí, etc.</td><td>Herramientas de Fine Science</td><td>múltiples&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>kit de retractor -fijador magnético</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-02</td><td></td></tr><tr><td>kit de retractor -retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td>también se pueden utilizar otros retractores</td></tr><tr><td>kit de retractor -elastómero</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-07</td><td></td></tr><tr><td>manta calefactora con control de retroalimentación</td><td>CWE Inc.</td><td>Modelo: TC-1000 Mouse&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; N.º de pieza 08-13000</td><td></td></tr><tr><td>estereotaxis</td><td></td><td>véase Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Suplemento (en línea)</td><td></td></tr><tr>cámara <td></td><td>espinal</td><td>véase Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Suplemento (en línea)</td><td></td></tr><tr>Soportes <td></td> de <td>cámara espinal</td><td>véase Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Suplemento (en línea)</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>Loctite Loctite</td><td>495</td><td>múltiple proveedores</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Coral Powder (polvo acrílico dental)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Parte: 8101</td><td>múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Liquid (líquido acrílico dental)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Parte: 8501</td><td>múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>MWI Veterinary Supply MWI</td><td>SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaína</td><td>MWI Suministro Veterinario</td><td>MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>MWI Suministro Veterinario</td><td>MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>MWI Suministro Veterinario MWI</td><td>SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Elastomer</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Consejos de mezcla World Precision</td><td>Inc.</td><td>KWIKMIX</td><td></td></tr></tbody></table>

un procedimiento para el implante cámara espinal para longitudinal en vivo imágenes de la médula espinal de ratón

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

estudios en el neocórtex de mamíferos han permitido una resolución sin precedentes de la estructura cortical, la actividad y la respuesta a las agresiones neurodegenerativas mediante imágenes repetidas in vivo de lapso de tiempo en roedores vivos. Estos estudios fueron posibles gracias a procedimientos quirúrgicos sencillos, que permitieron el acceso óptico durante un período prolongado de tiempo sin repetir los procedimientos quirúrgicos. Por el contrario, los estudios análogos de la médula espinal se han limitado anteriormente a solo unas pocas sesiones de imágenes, cada una de las cuales requirió una cirugía invasiva. Como se describió anteriormente, hemos desarrollado una cámara espinal que permite el acceso óptico continuo durante más de 8 semanas, preserva la estabilidad mecánica de la columna vertebral, se estabiliza fácilmente externamente durante la obtención de imágenes y requiere una sola cirugía. Aquí, se revisa el diseño de la cámara espinal con sus implementos quirúrgicos asociados y se demuestra en detalle el procedimiento quirúrgico. Brevemente, este video demostrará la preparación del área quirúrgica y el ratón para la cirugía, la exposición de la vértebra espinal y el desbridamiento adecuado del tejido, la entrega del implante y el pinzamiento vertebral, la finalización de la cámara, la extracción del sistema de administración, el sellado de la piel y, finalmente, el cuidado postoperatorio. También se demostrará el procedimiento para la obtención de imágenes crónicas in vivo mediante microscopía no lineal. Finalmente, se discuten los resultados, las limitaciones, la variabilidad típica y una guía para la resolución de problemas.

Siguiendo el procedimiento anterior, cada etapa de la cirugía debe imitar los resultados de cada etapa de la cirugía se indica en la figura 2. Especial cuidado debe tenerse cuando se aplica el elastómero de silicona para eliminar las burbujas de aire bajo el cristal o al menos garantizar que se encuentren situado en la periferia de la zona de interés (Figura 2 l). Para un cirujano experimentado, las complicaciones quirúrgicas que requieren la eutanasia, ya sea durante la cirugía o después de la cirugía dentro de la primera 24 hr ocurren en aproximadamente el 20% de las operaciones. Estas complicaciones más frecuentemente surgen de hemorragia excesiva de tejidos blandos o el fracaso para fijar firmemente la cámara a la columna vertebral. En cámaras implantadas con éxito, la ventana permanece normalmente ópticamente transparente para varias semanas (Figura 3). A pesar de los mejores esfuerzos, una opaco, fibroso, crecimiento neoplásico a menudo se forma dentro de unos pocos días, resultando en Obscurio parcialng de la ventana (Figura 3C - F, línea discontinua negro). Estructuras fluorescentes son difíciles de ver mediante microscopía 2PEF debajo de este tejido fibroso. Nos encontramos con una distribución bimodal de los resultados, con aproximadamente el 50% de las ventanas implantados con éxito restante claro durante más de 5 semanas de la operación, y aproximadamente el 50% convirtiendo ofuscado en 1-3 semanas. Para las ventanas que quedan claras, la mayoría de los lugares dentro de la experiencia de visualización de la ventana sólo un modesto grado de neovascularización en o por encima de la duramadre (Figura 3D - F, asteriscos verde), que no obstaculice la imagen 2PEF. Nuestro estudio anterior 30 mostró un aumento en la densidad de microglia, pero no de astrocitos debajo de la ventana y las vértebras adyacentes, lo que indica inflamación leve análoga a la observada en la ventana preparaciones craneales 5. En ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) en un subconjunto de la raíz dorsal Ganglia (DRG), las neuronas (línea YFPH; Jackson Labs), los axones eran claramente distinguibles por semana después de la operación (Figura 4A y B) y hasta cuatro meses en un animal (datos no mostrados). Los vasos sanguíneos (Figura 4A y B) se hacen visibles por fluorescente retro-orbital inyección de dextrano marcado con Texas Red en el plasma sanguíneo. La microglía también se visualizaron en ratones que expresan GFP en un CX3CR1 ratón knock-in (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) cruzaron la línea YFPH (Figura 4C). Contraste y la resolución se deterioraron modestamente con el tiempo (Figura 4C) debido a la formación de un sobrecrecimiento fibroso descrito previamente 30. Rutinariamente Imaged durante 3 horas en una sola sesión y sin mortalidad y con la frecuencia que cada 12 horas. Duración de la sesión y la frecuencia está limitada por la tolerancia del animal para la inducción anestésica, concomitante con las consideraciones éticas que acompañan el dolor y la angustia de los animales de laboratorio. &lt; p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg"> Figura 1. Una suite personalizado quirúrgica facilita la entrega de cámara durante la implantación y estabiliza la cámara durante las sesiones de formación de imágenes posteriores. Dos barras laterales y una placa superior (A) se ensamblan (B) con los tornillos pequeños en la cámara de la columna vertebral (C). Una mesa de operaciones con mensajes extensibles (D) permite la entrega y la sujeción de las barras laterales a las vértebras usando pasadores de retención (E). Sesiones de formación de imágenes posteriores en lugar de utilizar mensajes roscados internamente para adjuntar a la cámara a través de los tornillos de fijación en las alas del implante (F). El panel B de esta figura ha sido modificado desde Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 con permiso de Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg "target =" _ blank "&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg"> Figura 2. Una laminectomía dorsal y se realiza una cámara de imágenes crónica se implanta para proporcionar acceso óptico a la médula espinal. El procedimiento se describe en el montaje. En primer lugar, la piel (paneles A, B; secciones de protocolo 3.1 a 3.4) y los músculos (C; 3,5) se retraen para exponer las tres vértebras subyacente. Se retira el tejido que recubre estos tres vértebras (D, E, F; 03/06 a 03/10) y de los procesos laterales se raspan limpia antes de que se sujetan por ambos lados (G, H; 3,12). Con cuidado, la lámina dorsal de la vértebra central es eliminado y los bordes de la médula sellado (I (J; 5,1) y los tornillos fijado en su posición (K; 5,3) para asegurar la cámara antes de sellar la cámara con elastómero de silicona y cubierta de vidrio (L; 5,5). Después se retiran los pasadores de entrega (M; 5,8), la piel se pega a los lados de la cámara (M, N; 5,8) y los tornillos de fijación se insertan en las alas (O; 5,9). Por último, las ranuras de los tornillos están sellados con acrílico dental (P; 5.10). Y el ratón se coloca en una jaula limpia para recuperar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg"> Figura 3. Una cámara espinal crónica sigue siendo ov ópticamente transparenteer varias semanas. Imágenes de luz blanca de la médula espinal, que van desde varios minutos (A) y tres semanas después de la operación (F). Hitos vasculares son identificables en todos los puntos (flechas amarillas). Pocos cambios se ve en uno después de la cirugía día (B). Sobrecrecimiento denso fibroso (C - F, delimitada por la línea discontinua en la parte inferior derecha) está presente tan pronto como tres días y los resultados en la ofuscación parcial del área de imagen. Neovascularización leve (D, E, F, asteriscos verdes) también está presente, pero no oculta la vasculatura originales con luz blanca o de imágenes 2PEF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg"><pclass>Figura 4. Una cámara de médula crónica permite la formación de imágenes multi-fotón repetido sin la necesidad de cirugías repetidas. de formación de imágenes repetidas de ratones transgénicos que expresan YFP en un subconjunto de los axones DRG (verde) en las funiculi dorsales de la médula espinal y la vasculatura (rojo) marcado por inyección intravascular de colorante (A, B). La actividad de la microglia (malva) también se puede seguir a través del tiempo en Thy1-YFP / CX3CR1-GFP ratones dobles transgénicos (C). Mientras que los axones y microglia permanecen visibles, contraste y resolución disminución modesta en el tiempo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </pclass>

En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados ​​y demostraron.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal En Vivo Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

El objetivo general de este procedimiento es implantar una cámara de imágenes sobre la médula espinal dorsal de un ratón para permitir la obtención de imágenes ópticas longitudinales sin la necesidad de repetir las convulsiones quirúrgicas. Esto se logra exponiendo primero tres vértebras torácicas y eliminando el tejido blando por encima de la columna vertebral. El segundo paso es pinzar las vértebras expuestas utilizando las piezas laterales de la cámara y realizar una laminectomía dorsal.A continuación, la placa superior de la cámara se fija firmemente sobre la médula espinal expuesta y se sella con elastómero de silicona y un cubreobjetos. El paso final es sellar la piel alrededor del implante con adhesivos y permitir que el animal se recupere. En última instancia, la microscopía de fluorescencia multifotónica se utiliza para obtener imágenes del comportamiento celular y la estructura del tejido en la médula espinal con resolución subcelular a lo largo del tiempo.La principal ventaja de nuestra nueva metodología sobre los métodos existentes, como la apertura quirúrgica repetida de la médula espinal, es la capacidad de tener un número casi arbitrario de puntos de tiempo de imagen distribuidos durante un largo período de tiempo sin las complicaciones asociadas con la cirugía repetida, como una posible infección, un trauma quirúrgico o el estrés de los animales. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando estábamos considerando el éxito previo de las imágenes longitudinales después de una lesión de la médula espinal en el pez cebra transparente. Entonces decidimos expandir este paradigma al modelo de mamíferos.Comience este procedimiento afeitando el área del arco torácico de un ratón anestesiado con flúor. A continuación, retira el pelo recortado. A continuación, administre la mezcla de solución salina, ketoprofeno y dexametasona al ratón por vía subcutánea.Usando bastoncillos de algodón. Realice tres lavados alternos de yodo y etanol al 70%, y espere un minuto entre lavados. Después de eso, administre 100 microlitros de bupivacaína al 0,125% en el centro del parche afeitado por vía subcutánea para reducir el dolor en el sitio de la incisión.A continuación, transfiere el ratón a los ataques estéreo personalizados. Inserte el termómetro rectal y espere aproximadamente 10 minutos para que la bupivacaína haga efecto bajo el microscopio. Haz una incisión de cinco milímetros por encima de las vértebras de interés con una hoja de bisturí.Después de eso, aumente el tamaño de la abertura en la piel mediante una disección roma. A continuación, disocie suavemente la fascia conectiva entre la piel y el músculo subyacente. Sujete la piel hacia atrás para obtener un área de trabajo más grande con los retractores y tenga cuidado de no aumentar el peso en el pecho y obstruir la respiración.A continuación, agarre la rostral, la mayor parte de la vértebra que quedará expuesta a través del músculo suprayacente, con un par de fórceps. Corta el tejido a ambos lados de la apófisis dorsal lejos de tres vértebras. Posteriormente, retire todo el tejido suprayacente de la lámina dorsal.Después, corte con cuidado los tendones unidos a las vértebras en ambos bordes laterales de la columna vertebral. Retire suavemente la mayor cantidad posible de tejido de los bordes laterales de la columna de vértebras para proporcionar una superficie de sujeción limpia. A continuación, desbride suavemente las vértebras de cualquier tejido blando restante.Con un raspador de huesos y un hisopo de algodón, recorte cualquier tejido incongruente con las tijeras quirúrgicas. A continuación, ajuste los retractores para retener el tejido que rodea la columna de vértebras. Junto con la piel, fije las barras laterales del implante a las puntas de los postes de entrega y colóquelas en los soportes de los postes.A continuación, sujete las tres vértebras. Usar las barras laterales aplicando la presión suficiente para sujetarlas de forma segura. A continuación, utilice las pinzas para ayudar a asegurar un pinzamiento nivelado de las tres vértebras.Asegúrese de que las barras laterales estén niveladas y paralelas antes de realizar la laminectomía. Después de eso, limpie y seque cuidadosamente la superficie dorsal de las vértebras pinzadas con hisopos de algodón. En este procedimiento, inserte las puntas de las tijeras Vana en el espacio epidural de la vértebra pinzada medial y apriete ligeramente los mangos.Si el hueso está seco, debe agrietarse a lo largo de la lámina dorsal. Repita este procedimiento en el lado contralateral para liberar la lámina mientras agarra la lámina suelta. Suavemente por la apófisis dorsal con fórceps, corte cuidadosamente cualquier tejido conectivo en los extremos rostral y mimado de la lámina. A continuación, lave a fondo la sangre que recubre la médula espinal con solución salina al 0,9% o espinal cerebral artificial, absorba el exceso de líquido con bastoncillos de algodón.Después de eso, recorte los bordes laterales del hueso y proceda a las barras laterales del implante. Posteriormente, controle el sangrado con hisopos de algodón y solución salina. En el caso de que una parte del periostio se haya desprendido y se superponga a la médula espinal, retire suavemente el tejido con hisopos de algodón y una aguja de calibre 29 a 30.Tenga cuidado de no lesionar la médula espinal y no confunda el periostio suelto con un dator bien envuelto. Al final. Selle los bordes expuestos restantes del hueso con dientes dentales, acrílico y cianoacrilato.Tenga especial cuidado para evitar que el pegamento entre en contacto con la médula espinal expuesta. Ahora, coloque la placa superior en el animal con cuidado para que las cuatro ranuras se alineen con los cuatro orificios de las barras laterales y la abertura se superponga a la médula espinal expuesta. Con un destornillador de joyería, comience con cuidado con el primer tornillo, estabilizando el eje del destornillador con otro par de pinzas.No apriete el tornillo en esta etapa, sino insértelo de modo que las primeras roscas queden enganchadas. Repita este proceso para los otros tres tornillos. Con los cuatro tornillos en su lugar, apriete cada tornillo alternativamente en los mismos incrementos pequeños hasta que todos los tornillos estén firmemente asegurados.A continuación, utilice el elastómero de silicona de la marca quick sill para rellenar el espacio entre la médula espinal y la ventana de vidrio y aplíquelo sobre la médula espinal expuesta. Asegúrese de deshacerse de cualquier silicona que contenga burbujas de aire de la punta de mezcla antes de su aplicación. A continuación, coloque rápidamente un cubreobjetos de cinco milímetros en el inserto de la placa superior.Aplique suficiente presión para exprimir gradualmente el elastómero líquido para rodear la médula espinal, pero sin provocar la compresión de la médula espinal. Después, cubra los bordes del elastómero exudado con material dental, acrílico y cianoacrilato, y utilice los adhesivos para adherir el elastómero al hueso circundante tanto como sea posible para evitar que el elastómero se desplace sobre la superficie de la médula espinal. A continuación, retire los retractores y tire de la piel hacia arriba alrededor del borde del implante.Utilice el cianoacrilato para adherir la piel a los bordes del implante. Después de eso, inserte los tornillos en las alas de la placa superior. Posteriormente, selle los espacios en las ranuras de los tornillos de la placa superior con acrílico dental antes de volver a colocar al animal en la jaula para su recuperación.Antes de las sesiones de imagen, anestesiar el ratón de nuevo y fijar los tornillos expuestos del implante a los postes roscados para su estabilización. Esta figura muestra que una cámara espinal crónica permanece ópticamente transparente durante varias semanas. Se trata de imágenes de la médula espinal de color blanco a claro que van desde varios minutos hasta tres semanas después de la operación.Los puntos de referencia vasculares son identificables en todos los puntos de tiempo. Se observan pocos cambios un día después de la cirugía. El sobrecrecimiento fibroso denso está presente en parte de la ventana a partir de los tres días y da lugar a una ofuscación parcial del área de la imagen.También hay neovascularización leve, pero no oscurece la vasculatura original con luz blanca o dos imágenes de PEF. La cámara espinal crónica permite la repetición de imágenes multifotónicas sin necesidad de cirugías repetidas. Aquí están las imágenes de un ratón transgénico que expresa YFP en un subconjunto de axones DRG en los fii dorsales de la médula espinal.La vasculatura se marcó mediante inyección de tinte intravascular que se muestra en rojo. La actividad de la microglía también se puede rastrear a lo largo del tiempo en el muslo, un YFP CX, tres CR, un ratón transgénico doble GFP, mientras que los axones y la microglía permanecen visibles. El contraste y la resolución disminuyen modestamente con el tiempo.Una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente después de su desarrollo. Esta técnica nos allanó el camino para explorar la heterogeneidad temporal y espacial de la muerte regresiva de los axones después de una lesión de la médula espinal.Y ratones.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar...

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

Breve descripción visual de la técnica quirúrgica y el dispositivo utilizado para la entrega de genes (y célula) terapias en la médula espinal. La técnica se muestra en el animal, pero es totalmente trasladable y actualmente se utiliza para la aplicación humana.

Técnica quirúrgica para la entrega de la Médula Espinal de Terapias: Demostración de Procedimiento en Göttingen minipigs

Fuente: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomía e implantación de ventana de la médula espinal en el ratón. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la implantación de una ventana de la médula espinal en un ratón anestesiado para imágenes in vivo. El protocolo estabiliza la médula espinal expuesta utilizando una cubierta de vidrio de borosilicato y una placa posterior impresa en 3D. Este método permite la microscopía de dos fotones de alta resolución para estudiar la dinámica de la barrera...

Implantación de ventana de la médula espinal en un ratón para imágenes in vivo

Describimos un método para implantar y mantener ventanas de vidrio sobre la médula espinal expuesta de ratones adultos para estudiar la encefalomielitis autoinmune experimental. Estas ventanas proporcionan acceso óptico crónico a la médula espinal para monitorear la dinámica celular a nivel subcelular en animales vivos utilizando microscopía de dos fotones.

Implante de ventanas de vidrio de la médula espinal en ratones adultos con encefalomielitis autoinmune experimental

Presentamos un protocolo que utiliza microscopía de lapso de tiempo de excitación de dos fotones para visualizar simultáneamente la dinámica de las lesiones de axones y mielinas en tiempo real. Este protocolo propuesto permite estudiar los factores intrínsecos y extrínsecos que pueden influir en el destino de los axones mielinizados centrales después de una lesión y contribuir a la discapacidad clínica permanente.

Una Ex Vivo Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Las enfermedades desmielinizantes se pueden modelar en animales mediante la aplicación focal de lisolecitina en el SNC. Una sola inyección de lisolecitina en la médula espinal del ratón produce una lesión que se repara espontáneamente con el tiempo. El objetivo es estudiar los factores implicados en la desmielinización y la remielinización, y probar agentes para mejorar la reparación.

Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

Este protocolo describe la implantación de una ventana de vidrio en la médula espinal de un ratón para facilitar la visualización mediante microscopía intravital.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Este protocolo detalla un procedimiento quirúrgico para realizar una cirugía de la médula espinal y para implantar y asegurar un vástago óptico sobre la médula espinal en roedores.

Implantación de dispositivos optoelectrónicos en la médula espinal de los roedores

Este protocolo describe un sistema de fijación del transductor de ultrasonido diseñado específicamente para la estimulación por ultrasonido de la médula espinal en ratones despiertos. El método emplea un sistema de fijación para garantizar un posicionamiento preciso del transductor de ultrasonido y, al mismo tiempo, permitir que los sujetos experimentales se muevan libremente sin comprometer la precisión de la estimulación.

Fijación de transductores de ultrasonido para la neuromodulación de la médula espinal en ratones

Aprende a implantar una cámara óptica en la médula espinal dorsal de ratón para imagen longitudinal sin cirugías repetidas. Este método permite estudiar la dinámica celular con microscopía de fluorescencia multiphoton.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal En Vivo Imágenes de la médula espinal de ratón

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