Protocolo para el Estudio de la extinción del miedo condicionado en ratas hembras Naturalmente Ciclismo

El objetivo general de este procedimiento es examinar los efectos de las hormonas gonadales en el comportamiento de extinción del miedo en las mujeres durante los estados hormonales bajos y altos del ciclo de Esra y el papel del estradiol cuando se administra exógenamente. Esto se logra monitoreando primero el ciclo de ESRA de ratas hembras adultas e identificando en qué fase se encuentran antes de la experimentación. A continuación, los animales que están en la fase de celo se colocan en sus cámaras asignadas para que los habiten y acondicionen el miedo.

Al día siguiente, cuando los animales están en celo, a las hembras se les inyecta estradiol o vehículo y se les somete a un entrenamiento de extinción por miedo. Finalmente, el tercer día, los animales se colocan de nuevo en la misma cámara para probar el recuerdo de la sesión de extinción del día anterior. En última instancia, el hisopado vaginal para la identificación de la strase EST permite a los investigadores manipular las fluctuaciones naturales de las hormonas gonadales para estudiar su influencia en la memoria de extinción del miedo.

Este protocolo se puede utilizar para ayudar a responder preguntas clave en el campo de las diferencias sexuales, como ¿son diferentes los procesos de extinción del miedo en hombres y mujeres? Y si es así, ¿cuáles son los mecanismos hormonales y neurobiológicos que satisfacen estas diferencias? La principal ventaja de este protocolo es que puede ayudar a promover el estudio de la feminidad en la extinción del miedo al compartir métodos para hacerlo.

Los investigadores nuevos en estos métodos a menudo tienen dificultades para monitorear de manera confiable el ciclo de eser porque el procedimiento puede llevar mucho tiempo y depender en gran medida de la técnica adecuada. Las implicaciones de estos estudios pueden contribuir a las opciones de tratamiento específicas por sexo para los trastornos relacionados con el miedo y la ansiedad. Esto puede ser importante dado que las mujeres tienen el doble de probabilidades que los hombres de desarrollar estas psicopatologías.

Lisa Man, una postdoc en el laboratorio y encubierta de cuidados. Un asistente de investigación en el laboratorio mostrará el procedimiento para recolectar muestras para monitorear el ciclo del celo. Después de preparar una solución salina al 0,9%, sumerja un aplicador con punta de algodón en el líquido y use una toalla de papel para secar la punta del exceso de solución sosteniendo la cola de una rata hacia arriba y teniendo cuidado de no causar angustia.

Inserte suavemente la punta de algodón en el canal vaginal no demasiado profundo y gírela alrededor de las paredes para capturar las células vaginales sueltas antes de hacerlo rápidamente. Retire la punta sin transferir demasiado líquido, haga rodar suavemente la punta del aplicador sobre un portaobjetos de microscopio preetiquetado, asegurándose de que la muestra se transfiera al portaobjetos. Recoja muestras durante al menos dos ciclos completos y transfiéralas varios días consecutivos en un portaobjetos para poder realizar un mejor seguimiento e identificar los extras diarios de EST.

Cambios de fase Una vez que los portaobjetos estén secos, sumérjalos 10 veces en el fijador y luego 10 veces en la solución de tinción. Y finalmente, cinco veces en solución de contratinte. Enjuague suavemente con agua.

Deje que los portaobjetos se sequen completamente al aire antes de verlos bajo un microscopio antes del inicio del experimento de acondicionamiento, preexponga a las hembras a las cámaras de acondicionamiento con las luces de la casa encendidas durante 20 a 30 minutos por día durante tres días para permitirles aclimatarse al medio ambiente. Asigne la caja a la que están preexpuestos como su cámara para el estudio. Limpie a fondo las cajas entre sesiones y animales para eliminar los olores, ya que pueden afectar el comportamiento y el ciclo de estrés EST.

Una vez comprobado que los animales se encuentran en la fase estral del ciclo extra EST, se inicia la fase de condicionamiento de habituación. Tome medidas de referencia de congelación antes del estímulo de la condición de primer tono midiendo los segundos que el animal pasa un móvil durante el estímulo. Intervalo de tiempo ausente, calcule la puntuación de congelación porcentual dividiendo el segundo que pasó inmóvil por la duración del ensayo.

Para llevar a cabo el entrenamiento de extinción durante la fase estral de EM, acondicionar a las ratas en su último día de ESTRO según lo determinado por hisopado. Colocar a los animales en la cámara de acondicionamiento y realizar una prueba de habituación con CS sola. Induzca un tono CS durante 30 segundos.

Después de esperar un promedio de tres minutos antes de la siguiente prueba, repita la prueba de CS sola cuatro veces más para un total de cinco pruebas antes del acondicionamiento. Conecte el suelo de la rejilla de choque del pie a un generador de estimulación eléctrica. Utilice un nivel de estimulación de 0,5 a 0,6 miliamperios como estímulo incondicionado o US y un tono de cuatro kilohercios y 80 decibelios como CS inmediatamente después de la sesión de habituación.

Comience las pruebas emparejadas de CS US de condicionamiento del miedo presentando un tono CS 32, seguido de un choque US de 0,5 segundos separados por un intervalo entre pruebas de aproximadamente tres minutos. Repita la prueba emparejada seis veces más al final de la sesión de acondicionamiento. Regrese a los animales a sus jaulas domésticas y a la instalación de animales hasta el día siguiente el segundo día.

Después de tomar muestras e identificar la fase estral de EM para todos los animales que se sometieron al primer día del protocolo, prepare suficiente estradiol en aceite de sésamo o solución salina al 0,9% para que cada animal reciba una dosis de 15 microgramos por kilogramo para administrar la hormona por vía subcutánea. Levante la piel suelta entre la escápula por el cuello con un pellizco suave e inserte la jeringa en el triángulo formado por los pliegues de la piel. 30 minutos después de que los animales reciban sus inyecciones, colóquelos en las cámaras de acondicionamiento y comience el entrenamiento de extinción realizando 20 CS solos.

Cada uno de los ensayos consta de un tono de 32 cuatro kilohercios y 80 decibelios con aproximadamente tres minutos entre ensayos 24 horas después. Día tres, hisopar a los animales que completaron las sesiones en los días uno y dos después de colocar a los animales en sus cámaras de acondicionamiento asignadas. Comience la sesión de retiro de extinción llevando a cabo tres ensayos de Cs solos con aproximadamente tres minutos entre ensayos al finalizar la sesión de retiro, devuelva a los animales a sus jaulas domésticas y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto en este protocolo de extinción por miedo.

Los animales que se extinguieron bien y conservaron la memoria del entrenamiento de extinción mostraron poco miedo en el último día de pruebas de comportamiento durante el retiro de la extinción. Como se demostró aquí, las ratas macho y hembra no difieren significativamente en la expresión del miedo condicionado. Durante cada fase, se hace evidente una diferencia de sexo cuando los animales se analizan por separado como grupos de fase ES con alto y bajo contenido de estrógenos.

Este gráfico muestra el efecto de la fase de estro en la memoria de extinción del miedo, ratas hembras que se someten a un entrenamiento de extinción durante la fase de mées de estrógeno bajo del ciclo extra de EST. No recuerden la memoria de extinción del tercer día tan bien como los entrenados en PROEs. Sin embargo, cuando a las hembras metri se les inyecta por vía subcutánea una dosis de 15 microgramos por kilogramo de estradiol antes de la extinción, el aprendizaje, la consolidación de la memoria de extinción del miedo parece mejorar, como lo demuestra el recuerdo de la baja congelación durante la extinción.

Por lo tanto, estos datos indican que las hormonas gonadales pueden modular el recuerdo de la extinción del miedo, y también mediar las diferencias sexuales en las conductas de extinción del miedo condicionado. Se pueden realizar procedimientos adicionales, como la cirugía de canulación y la inmunohistoquímica, junto con el método descrito aquí para responder a preguntas como: ¿dónde actúa el estradiol en el cerebro para modular el miedo, la extinción, la consolidación de la memoria y cómo altera el estradiol la actividad neuronal dentro de estas regiones? Después de ver este video, debe tener una comprensión clara de cómo estudiar el reciclaje natural de ratas hembras y la influencia del estradiol en una clara exextensión.