Name: Protocolo para el Estudio de la extinción del miedo condicionado en ratas hembras Naturalmente Ciclismo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende a estudiar la extinción del miedo condicionado en ratas hembras mediante el monitoreo del ciclo estral y administración de estradiol. Este protocolo permite analizar cómo las hormonas gonadales modulan la memoria y el comportamiento.

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Mohammed R. Milad cuenta con el apoyo de la subvención R01 del NIMH MH097880 y fondos institucionales del Departamento de Psiquiatría del MGH.

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo han sido aprobados por el Subcomité de Investigación Animal Care, que sirve como el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) para el Hospital General de Massachusetts, y cumplen con los Institutos Nacionales de Salud. 1. Animal Vivienda y Procedimiento para el Manejo <ol><li> A su llegada, la casa del adulto Sprague Dawley hembras de 8-10 semanas de edad (con un peso 200-225 g) en grupos de cubos de plástico 3.4 pulgadas con ropa de cama de viruta de madera. Mantenerlas en una dieta de acceso ad libitum al perro chino y el agua y un 12 horas de luz / oscuridad ciclo. Deja ratas para aclimatarse a las condiciones de vivienda y de los animales instalación por un mínimo de 1 semana. NOTA: Todos los procedimientos de este manuscrito se llevan a cabo durante el ciclo de luz. </li><li> Después de este período de aclimatación, manejar todos los animales durante 5 min cada uno durante 2-3 días. Correctamente recoger el ratas de uno en uno (apoyado por el torso y no por la cola),mantener de forma segura, y acariciarlos durante este tiempo. Manipular los animales que aparecen más estresado, nervioso o ansioso por períodos más largos de tiempo. Haga esto para minimizar el manejo de estrés, lo que podría afectar a los siguientes pasos de este protocolo. NOTA: El número de días y cantidad de la manipulación de los animales pueden variar entre diferentes laboratorios tiempo; sin embargo, éstas deben ser coherentes entre los experimentos dentro del mismo laboratorio. </li></ol> 2. Monitoreo del ciclo estral: torunda vaginal Smearing y Procedimiento de tinción <ol><li> Hacer solución salina al 0,9% (cloruro de sodio disuelto en agua destilada). Humedezca un aplicador con punta de algodón en esta solución. Seque la punta con una toalla de papel para evitar la sobresaturación, que podría conducir a la recogida de muestras inadecuadas o pérdida de células. La celebración de la cola hacia arriba fuera de la abertura vaginal, introduzca suavemente la punta de algodón en el canal vaginal y rodar alrededor de los muros para capturar las células vaginales flojas. </li><li> Si el animal se orina en la camaTip Ton, sustituya por uno nuevo, ya que la contaminación de la orina será más difícil para la identificación de fase. Tenga mucho cuidado de no causar trastornos a los animales durante este procedimiento debido a la exposición al estrés interrumpirá el ciclo estral. Cuando limpiando, el objetivo de lograr una inserción rápida y retirada que no es demasiado profunda como para minimizar la estimulación extra para el cuello del útero, lo que puede inducir pseudopreñez. NOTA: pseudopreñez puede ser identificado como un ciclo estral acíclico que típicamente dura alrededor de 12 días, es decir, días consecutivos de 25 diestro. </li><li> Retire con cuidado la punta del aplicador y rodar en un portaobjetos de microscopio pre-etiquetados. Evite presionarlos demasiado duro como demasiado líquido en el portaobjetos puede hacer la identificación de fase difícil una vez seco. NOTA: Una diapositiva puede contener varios días para cada animal, aunque esto se puede hacer de acuerdo a las preferencias individuales. </li><li> Asegúrese de que las transferencias de la muestra en el portaobjetos. Recoger muestras para cortarcol días consecutivos en una diapositiva para poder efectuar un mejor seguimiento e identificar diarias fases de estro cambios. NOTA: Si es posible, también es ideal si las personas que recolectan muestras siguen siendo los mismos para todos los animales. </li><li> Una vez que la diapositiva es seca, comenzar el protocolo de tinción para la identificación de fase. Usando el kit de tinción (véase la Tabla de Materiales), sumerja las diapositivas de 10 veces en el fijador (azul claro), 10 veces en solución de tinción (rosa), y 5 veces en solución de contraste (púrpura). Enjuague desliza suavemente con agua corriente. Deje que se desliza completamente seco aire antes de ver bajo el microscopio. NOTA: El ciclo estral largo típicamente 4-5 días consta de (en este orden): estro (E), metaestro (M), el diestro (D), y el proestro (P) 26. El estro se caracteriza por azules, células cornificadas, metaestro por los leucocitos y una combinación de células cornificadas y nucleadas, diestro es similar a metaestro en presencia de tipos de células excepto que son muy escasos, y proestro por agregados-púrpura manchadocélulas nucleadas de (Figura 1). Hay varios procedimientos de tinción, además de los descritos anteriormente, que son igualmente eficaces para la citología de frotis vaginal. </li><li> Recoger muestras durante al menos dos ciclos completos (~ 8-10 días) con el fin de controlar las fases con precisión antes de la experimentación. Sea consistente con la hora del día se toman las muestras. Recoger muestras de frotis vaginales a diario durante todo y hasta el final del experimento. </li></ol> 3. Pre-exposición <ol><li> Antes de la iniciación del experimento, pre-exponer a los animales a la acondicionado cámaras permiten que los animales se aclimaten al contexto (cámaras de acondicionamiento) antes de cualquier prueba de comportamiento. <ol><li> Pre-exponer las hembras a las cámaras de acondicionamiento (ubicados en cajas que atenúan el sonido) con las luces de la casa por 20 a 30 minutos por día durante 3 días antes de cualquier experimentación. Asignar la caja que son pre-expuesto a como su cámara para el estudio. Limpiar a fondo tél cajas (paredes y bandejas) entre las sesiones y los animales para eliminar los olores, ya que pueden afectar el comportamiento y el ciclo estral. </li></ol></li></ol> 4. Día 1: La habituación / temor acondicionado <ol><li> Una vez que los animales han sido verificados para estar en la fase de estro de sus ciclos de celo, comenzará la fase de habituación / acondicionado del experimento de 3 días. <ol><li> Tome tono previo medidas basales de congelación antes del primer tono de estímulo condicionado (EC) presentaciones en cada día del experimento. Para ello, la adquisición de calificaciones por ciento de congelación (calculados dividiendo los segundos empleados inmóvil por la duración del juicio, multiplicado por 100) durante el intervalo de tiempo de estímulo ausente al comienzo de la primera prueba CS-alone antes de la aparición CS. NOTA: Estas medidas pueden utilizarse para evaluar y comparar los niveles de congelación de línea de base con los que durante la habituación, condicionamiento, la extinción, y el recuerdo. </li><li> Para llevar a cabo la extinción de formación durante la fase metaestro,condicionar las ratas en su último día del estro. Fase Swab e identificar estral (paso 2) todos los días antes de iniciar el protocolo experimental (acondicionado / extinción / recuperación). A medida que la fase de estro puede durar más de un día, el uso de la historia del ciclo para predecir la duración de las fases para determinar cuando los animales están listos para comenzar el entrenamiento. </li></ol></li><li> En las cámaras de acondicionamiento, conecte el suelo de rejilla pies choque a un generador de estimulación eléctrica. Utilice un nivel de estimulación de 0.5-0.6 mA como el estímulo incondicionado (EI). Use un 4 kHz, el tono de 80 dB como el estímulo condicionado (CS). NOTA: Estos parámetros pueden variar a través de laboratorios y puede ser modificado para el acondicionamiento óptimo. <ol><li> Si el programa de análisis de congelación requiere señales visuales (en oposición a temporal), co-activar una luz LED con el tono. Coloque la luz en el exterior de la cámara operante, dentro de la trama de vídeo. Al inicio de cada ensayo, activar la luz LED y mantenerlo iluminado hasta el final del XIXjuicio e. NOTA: Esta luz no es visible por el animal y sólo sirve como un marcador para el inicio y final de la prueba dentro de los archivos de vídeo grabados (para ser usado para medir el comportamiento de congelación). </li></ol></li><li> Coloque los animales en las cámaras de acondicionamiento para 5 ensayos CS-alone de habituación. Inmediatamente después de la sesión de habituación, realizar 7 pares de ensayos CS-estadounidenses de condicionamiento del miedo. Asegúrese de que el tono de CS tiene una duración de 30 segundos y coterminates con el 0,5 seg choque de Estados Unidos. Efectuar ensayos clínicos en todas las sesiones (habituación, condicionamiento, la extinción, y recuperación) con un intervalo entre ensayos variable de una mediana de 3 minutos. </li><li> Al final de la sesión de acondicionamiento, devolver los animales a sus jaulas y para la instalación de los animales hasta el día siguiente. </li></ol> 5. Día 2: Preparación Estradiol <ol><li> Swab e identificar la fase de estro de todos los animales que se sometieron a día 1 de este protocolo. Preparar estradiol (también conocida como E2, 17beta-estradiol, obeta-estradiol) para una dosis de 15 mg / kg inyección subcutánea utilizando aceite de sésamo o 0,9% de solución salina como vehículo. </li><li> Para calcular la cantidad de estradiol para prepararse para las inyecciones, utilice los pesos corporales de todos los animales, los cuales fueron medidos y registrados cuando se acondicionaron en el día 1 de este protocolo. </li><li> Realizar cálculos para estandarizar el volumen administrado de estradiol (es decir, 0,2 ml) por rata. Dado que el estradiol es difícil de disolver debido a su insolubilidad en agua y requiere un gran volumen de disolvente para la dosis pequeña, preparar una solución de stock de mezcla de estradiol en aceite de sésamo a fuego hasta que se disuelva. La solución puede entonces hacerse pasar a través de un filtro de 0,22 micras para eliminar los contaminantes. Por ejemplo, añadir un volumen calculado de a / 1 ml solución de aceite de sésamo stock 3,000 g estradiol total el volumen necesario de aceite de sésamo con el fin de lograr un / kg dosis 15 mg en un volumen de 0,2 ml por inyección por animal. NOTA: Como alternativa, utilice otras formas de Tha estrógeno<html> t son solubles en agua y más fácil de disolver. </li></ol> 6. Día 2: Administración Estradiol / Formación Extinción <ol><li> Administrar la vía subcutánea estradiol. Levante la piel suelta entre la escápula por el cuello en un sujetador suave e inserte la aguja de la jeringa en el triángulo que se forma por los pliegues de la piel. </li><li> 30 minutos después de las inyecciones subcutáneas de estradiol, colocan a los animales en las cámaras de acondicionamiento de nuevo y comienzan entrenamiento de extinción. En esta sesión de extinción, realizar 20 ensayos CS-solamente, con cada ensayo que consiste en un 30 seg, 4 kHz, el tono de 80 dB, presentado en un intervalo entre la variable promedio de 3 min. NOTA: El efecto de estradiol en el recuerdo se produce cuando estradiol se administra antes de la extinción de formación o inmediatamente después de la extinción. El efecto no se observa 4 horas después de la extinción, por lo que se recomienda inyectar cerca en el tiempo al principio o al final de la sesión de entrenamiento de 15. </li></ol>. le &quot;&gt; 7 Día 3: Extinction Recall <ol><li> 24 horas después de la extinción de formación, talle los animales que completaron el día 1 y 2 de este protocolo. </li><li> Coloque los animales en sus cámaras de acondicionamiento asignados (igual que el día 1 y 2). Comienza la sesión de recuerdo de la extinción mediante la presentación de 3 ensayos CS-solos (los tres ensayos de recuerdo de la extinción), que consta de sólo 3,80 dB ensayos CS-solas con intervalos entre ensayos similares a los 20 ensayos administrados para entrenamiento de extinción como se describe en el paso 6.2. </li><li> Al término de la sesión de recuperación, devolver los animales a sus jaulas. </li></ol> Análisis 8. Datos <ol><li> Adquirir datos de comportamiento a través de video y analizarlos utilizando los programas informáticos. NOTA: Congelación puntuaciones también pueden ser contados manualmente por un experimentador que está ciego para el tratamiento de drogas cronometrando episodios de congelación durante la presentación CS de cada ensayo, expresada como porcentaje del tiempo dedicado a la congelación durante el tono. La congelación esdefinido por completo la falta de movimiento con la excepción de la respiración durante los 30 ensayos seg CS-estadounidenses. Calcular ciento congelación dividiendo los segundos empleados congelación (inmóvil) por 30 segundos (la duración de la prueba), multiplicado por 100. </li></ol>

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Los autores de este manuscrito no tienen que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses a revelar.

Extinción miedo ha sido ampliamente estudiado en ratas macho con los mecanismos neurales que median condicionado extinción miedo identificado y evaluado bajo diversas manipulaciones. Relativamente pocos estudios han examinado las ratas hembras o el papel de las hormonas gonadales en el miedo extinción. Para estudiar específicamente los efectos del estrógeno en el miedo extinción, que completan un ciclo natural ratas hembras son sometidos a un paradigma de comportamiento de tres días. Este procedimiento consiste en fases...

Diferencias sexuales inherentes se observan a través de diversos comportamientos cognitivos y paradigmas de aprendizaje tanto en humanos y roedores. Por ejemplo, se ha informado de que las mujeres tienen en general las habilidades verbales y orientado a los detalles más fuertes, mientras que los hombres tienen mejores habilidades espaciales 1-3. Estas diferencias sexuales pueden deberse en parte a la influencia de las hormonas gonadales. Los niveles altos de estradiol mejorar el rendimiento en las tareas en las que las mujeres son mejores, pero empeoran el rendimiento en tareas que los hombres por lo general hacen bien 4-6. Aunque esta evidencia es convincente, la capacidad limitada para controlar completamente entornos experimentales en estudios humanos hace que sea difícil determinar si estos efectos en el comportamiento pueden ser atribuidos específicamente a las hormonas. Los estudios en animales, en cambio, permiten circunstancias totalmente controladas. Aunque los mecanismos neurales básicos del miedo extinción han sido identificados y se ha estudiado bien en los machos, no está claro siestos sistemas son los mismos en las hembras o cómo cambian a través del ciclo estral. Condicionamiento del miedo y la extinción son ampliamente utilizados paradigmas conductuales en roedores y humanos para llevar a cabo estudios relacionados con los trastornos de ansiedad. Dado que las mujeres tienen un mayor riesgo de trastornos de ansiedad, así como una mayor duración de los síntomas y la gravedad 7-13, es fundamental para incluir mujeres en estos estudios. La escasa representación de las mujeres en esta investigación se puede atribuir a los desafíos de monitoreo fase estral y contabilización de los efectos en el comportamiento de las hormonas sexuales. Los laboratorios que hacen examinar las hembras en este sentido cuestiones encuentro que muchas veces no se denuncian ni se describen en los métodos para sus estudios. Nuevas pruebas en roedores sugiere que las diferencias sexuales en el miedo extinción son moduladas por las hormonas gonadales 14-18. En el condicionamiento del miedo, los animales son entrenados para temer un estímulo particular. Después de una serie de presentaciones no reforzadas deel estímulo, los animales aprenden a no temer el momento justo, un proceso llamado extinción. ¿Qué tan bien el animal aprende y refuerza la memoria de aprendizaje de esta tarea se puede observar durante una prueba de recuerdo de la extinción dado algún tiempo después del entrenamiento de extinción. Menos expresión miedo durante la llamada de extinción demuestra una buena consolidación de la memoria extinción. Los resultados recientes de nuestro laboratorio sugieren que los estrógenos pueden modular la consolidación de la memoria de extinción miedo y mejorar recuerdo de la extinción. En concreto, las ratas hembras que se extinguen en proestro, la fase del ciclo estral durante el cual circula máximo los niveles de estrógeno, exhibir una mayor retención de la memoria de extinción. Por el contrario, las mujeres que se extinguen en la pantalla fase metaestro bajo estrógeno relativamente pobre recuerdo de la extinción, que se pueden mejorar con la administración de estradiol exógeno antes o inmediatamente después de la extinción de formación 15,16. Los mecanismos neurales de la consolidación de la memoria de extinción (including el papel de las hormonas gonadales) en las mujeres no están claras. En animales de laboratorio, el papel de las hormonas puede ser investigada usando procedimientos de eliminación quirúrgicos invasivos tales como la castración y la ovariectomía. Después de la recuperación de la cirugía, las hormonas gonadales a menudo son manipulados de forma exógena durante la realización de una tarea de comportamiento 19. Este enfoque ha proporcionado información crítica acerca de las hormonas sexuales y es útil porque permite manipulaciones bien controlados de hormonas gonadales (en términos de tiempo y de la dosis) 20-23. Este enfoque, sin embargo, no evaluar la influencia de las fluctuaciones de origen natural que se producen en todo el ciclo estral ni representan animales &quot;normales&quot;, limitando así el potencial de traslación a los estudios humanos. Ha sido bien documentado que los niveles de hormona sexual femenina pico y el declive en fases específicas del ciclo estral, y cambios en la expresión del receptor de estrógeno dentro del ciclo,y 24 después de la ovariectomía. Por lo tanto, existe la necesidad de llevar a cabo estudios sobre las hembras con gónadas intactas y perfeccionar los diseños experimentales para estudiar de forma fiable los efectos de que los estados de alta y baja de estrógeno pueden tener sobre las mujeres a lo largo de su vida útil. Este protocolo se centra en el efecto de los estrógenos sobre los sistemas neurobiológicos implicados en el miedo extinción. En él se describe cómo: 1) controlar cuidadosamente el ciclo estral, 2) preparar las dosis efectivas de estradiol para la administración sistémica, y 3) siguen un paradigma de comportamiento que incluye el condicionamiento del miedo, la extinción, y recordar en el ciclismo de forma natural las ratas hembras. Este protocolo se puede modificar con otras manipulaciones farmacológicas y herramientas celulares y moleculares para ayudar a estudios para comprender mejor las diferencias de sexo que se observan en el comportamiento condicionado temer la extinción. Tenga en cuenta que los procedimientos descritos a continuación son los utilizados dentro de nuestro laboratorio, y existen un número de variaciones de estos procedimientos in la literatura.

<table><tbody><tr><td>Cámara de acondicionamiento del miedo</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphic State</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caja atenuadora del sonido</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>NIR-022MD</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1024</td><td>En aceite de sésamo para inyección subcutánea</td></tr><tr><td>Aceite de sésamo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Freezescan</td><td>Cleversys, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinción rápida por inmersión</td><td>Jorgensen Laboratories, Inc.</td><td>J0322A1, J0322A2, J0322A3</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td> de <td>6 pulgadas, solución salina estéril</td></tr><tr><td>al 0,9 %</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC23460-2</td><td>Cloruro de sodio con</td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio Selectfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Virex II 256</td><td>Diversey, Inc.</td><td>5019317</td><td>Diluir 1:256 con agua</td></tr><tr><td>Jeringas Luer-Lok Tip 1ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Agujas desechables hipodérmicas</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26402</td><td>Calibre 26</td></tr></tbody></table>

protocolo para el estudio de la extinción del miedo condicionado en ratas hembras naturalmente ciclismo

Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

La extinción del miedo condicionado se ha estudiado extensamente en roedores machos. Recientemente, ha habido un creciente número de estudios que indican que los mecanismos neuronales para ciertas tareas de comportamiento y conductas de respuesta son diferentes en mujeres y hombres. Usando a las mujeres en los estudios de investigación puede representar un desafío debido a la variación de las hormonas gonadales durante su ciclo estral. Este protocolo describe procedimientos bien establecidos que son útiles en la investigación del papel de los estrógenos en el miedo consolidación de la memoria extinción en ratas hembras. Fase del ciclo estral y la administración exógena de estrógenos antes de la extinción de formación puede influir en recuerdo de la extinción 24 horas más tarde. La técnica de hisopado vaginal para la identificación de fase estral descrito aquí ayuda al examen y manipulación de ciclismo naturalmente las hormonas gonadales. El uso de este modelo básico de roedores pueden definir con mayor precisión los mecanismos por los que los estrógenos pueden modular la memoria de extinción miedo enhembras.

En este protocolo de recordatorio miedo extinción, por ciento de congelación se midió como un indicador de miedo. Los animales que se extinguen bien y conservan el recuerdo de la extinción de formación exhibieron bajo el miedo en el último día de la prueba de comportamiento durante la llamada de extinción. Las ratas macho y hembra no difieren significativamente en la expresión condicionada miedo durante el condicionamiento, la extinción, y recuerdan fases (Figura 2). Sin embargo, una diferencia de sexo ...

Las hormonas gonadales como el estrógeno modulan la formación de la memoria en una serie de paradigmas experimentales, incluyendo el miedo, la extinción, la memoria. Este protocolo describe un conjunto de métodos para investigar la influencia de las hormonas gonadales específicamente durante la extinción en hembras de ciclo natural, incluido el monitoreo del ciclo estral y la administración de estrógenos exógenos.

Protocolo para el Estudio de la extinción del miedo condicionado en ratas hembras Naturalmente Ciclismo

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar los efectos de las hormonas gonadales en el comportamiento de extinción del miedo en las mujeres durante los estados hormonales bajos y altos del ciclo de Esra y el papel del estradiol cuando se administra exógenamente. Esto se logra monitoreando primero el ciclo de ESRA de ratas hembras adultas e identificando en qué fase se encuentran antes de la experimentación. A continuación, los animales que están en la fase de celo se colocan en sus cámaras asignadas para que los habiten y acondicionen el miedo.Al día siguiente, cuando los animales están en celo, a las hembras se les inyecta estradiol o vehículo y se les somete a un entrenamiento de extinción por miedo. Finalmente, el tercer día, los animales se colocan de nuevo en la misma cámara para probar el recuerdo de la sesión de extinción del día anterior. En última instancia, el hisopado vaginal para la identificación de la strase EST permite a los investigadores manipular las fluctuaciones naturales de las hormonas gonadales para estudiar su influencia en la memoria de extinción del miedo.Este protocolo se puede utilizar para ayudar a responder preguntas clave en el campo de las diferencias sexuales, como ¿son diferentes los procesos de extinción del miedo en hombres y mujeres? Y si es así, ¿cuáles son los mecanismos hormonales y neurobiológicos que satisfacen estas diferencias? La principal ventaja de este protocolo es que puede ayudar a promover el estudio de la feminidad en la extinción del miedo al compartir métodos para hacerlo.Los investigadores nuevos en estos métodos a menudo tienen dificultades para monitorear de manera confiable el ciclo de eser porque el procedimiento puede llevar mucho tiempo y depender en gran medida de la técnica adecuada. Las implicaciones de estos estudios pueden contribuir a las opciones de tratamiento específicas por sexo para los trastornos relacionados con el miedo y la ansiedad. Esto puede ser importante dado que las mujeres tienen el doble de probabilidades que los hombres de desarrollar estas psicopatologías.Lisa Man, una postdoc en el laboratorio y encubierta de cuidados. Un asistente de investigación en el laboratorio mostrará el procedimiento para recolectar muestras para monitorear el ciclo del celo. Después de preparar una solución salina al 0,9%, sumerja un aplicador con punta de algodón en el líquido y use una toalla de papel para secar la punta del exceso de solución sosteniendo la cola de una rata hacia arriba y teniendo cuidado de no causar angustia.Inserte suavemente la punta de algodón en el canal vaginal no demasiado profundo y gírela alrededor de las paredes para capturar las células vaginales sueltas antes de hacerlo rápidamente. Retire la punta sin transferir demasiado líquido, haga rodar suavemente la punta del aplicador sobre un portaobjetos de microscopio preetiquetado, asegurándose de que la muestra se transfiera al portaobjetos. Recoja muestras durante al menos dos ciclos completos y transfiéralas varios días consecutivos en un portaobjetos para poder realizar un mejor seguimiento e identificar los extras diarios de EST.Cambios de fase Una vez que los portaobjetos estén secos, sumérjalos 10 veces en el fijador y luego 10 veces en la solución de tinción. Y finalmente, cinco veces en solución de contratinte. Enjuague suavemente con agua.Deje que los portaobjetos se sequen completamente al aire antes de verlos bajo un microscopio antes del inicio del experimento de acondicionamiento, preexponga a las hembras a las cámaras de acondicionamiento con las luces de la casa encendidas durante 20 a 30 minutos por día durante tres días para permitirles aclimatarse al medio ambiente. Asigne la caja a la que están preexpuestos como su cámara para el estudio. Limpie a fondo las cajas entre sesiones y animales para eliminar los olores, ya que pueden afectar el comportamiento y el ciclo de estrés EST.Una vez comprobado que los animales se encuentran en la fase estral del ciclo extra EST, se inicia la fase de condicionamiento de habituación. Tome medidas de referencia de congelación antes del estímulo de la condición de primer tono midiendo los segundos que el animal pasa un móvil durante el estímulo. Intervalo de tiempo ausente, calcule la puntuación de congelación porcentual dividiendo el segundo que pasó inmóvil por la duración del ensayo.Para llevar a cabo el entrenamiento de extinción durante la fase estral de EM, acondicionar a las ratas en su último día de ESTRO según lo determinado por hisopado. Colocar a los animales en la cámara de acondicionamiento y realizar una prueba de habituación con CS sola. Induzca un tono CS durante 30 segundos.Después de esperar un promedio de tres minutos antes de la siguiente prueba, repita la prueba de CS sola cuatro veces más para un total de cinco pruebas antes del acondicionamiento. Conecte el suelo de la rejilla de choque del pie a un generador de estimulación eléctrica. Utilice un nivel de estimulación de 0,5 a 0,6 miliamperios como estímulo incondicionado o US y un tono de cuatro kilohercios y 80 decibelios como CS inmediatamente después de la sesión de habituación.Comience las pruebas emparejadas de CS US de condicionamiento del miedo presentando un tono CS 32, seguido de un choque US de 0,5 segundos separados por un intervalo entre pruebas de aproximadamente tres minutos. Repita la prueba emparejada seis veces más al final de la sesión de acondicionamiento. Regrese a los animales a sus jaulas domésticas y a la instalación de animales hasta el día siguiente el segundo día.Después de tomar muestras e identificar la fase estral de EM para todos los animales que se sometieron al primer día del protocolo, prepare suficiente estradiol en aceite de sésamo o solución salina al 0,9% para que cada animal reciba una dosis de 15 microgramos por kilogramo para administrar la hormona por vía subcutánea. Levante la piel suelta entre la escápula por el cuello con un pellizco suave e inserte la jeringa en el triángulo formado por los pliegues de la piel. 30 minutos después de que los animales reciban sus inyecciones, colóquelos en las cámaras de acondicionamiento y comience el entrenamiento de extinción realizando 20 CS solos.Cada uno de los ensayos consta de un tono de 32 cuatro kilohercios y 80 decibelios con aproximadamente tres minutos entre ensayos 24 horas después. Día tres, hisopar a los animales que completaron las sesiones en los días uno y dos después de colocar a los animales en sus cámaras de acondicionamiento asignadas. Comience la sesión de retiro de extinción llevando a cabo tres ensayos de Cs solos con aproximadamente tres minutos entre ensayos al finalizar la sesión de retiro, devuelva a los animales a sus jaulas domésticas y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto en este protocolo de extinción por miedo.Los animales que se extinguieron bien y conservaron la memoria del entrenamiento de extinción mostraron poco miedo en el último día de pruebas de comportamiento durante el retiro de la extinción. Como se demostró aquí, las ratas macho y hembra no difieren significativamente en la expresión del miedo condicionado. Durante cada fase, se hace evidente una diferencia de sexo cuando los animales se analizan por separado como grupos de fase ES con alto y bajo contenido de estrógenos.Este gráfico muestra el efecto de la fase de estro en la memoria de extinción del miedo, ratas hembras que se someten a un entrenamiento de extinción durante la fase de mées de estrógeno bajo del ciclo extra de EST. No recuerden la memoria de extinción del tercer día tan bien como los entrenados en PROEs. Sin embargo, cuando a las hembras metri se les inyecta por vía subcutánea una dosis de 15 microgramos por kilogramo de estradiol antes de la extinción, el aprendizaje, la consolidación de la memoria de extinción del miedo parece mejorar, como lo demuestra el recuerdo de la baja congelación durante la extinción.Por lo tanto, estos datos indican que las hormonas gonadales pueden modular el recuerdo de la extinción del miedo, y también mediar las diferencias sexuales en las conductas de extinción del miedo condicionado. Se pueden realizar procedimientos adicionales, como la cirugía de canulación y la inmunohistoquímica, junto con el método descrito aquí para responder a preguntas como: ¿dónde actúa el estradiol en el cerebro para modular el miedo, la extinción, la consolidación de la memoria y cómo altera el estradiol la actividad neuronal dentro de estas regiones? Después de ver este video, debe tener una comprensión clara de cómo estudiar el reciclaje natural de ratas hembras y la influencia del estradiol en una clara exextensión.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Los modelos animales de recaída, conocidos como procedimientos de reintegro, se han utilizado ampliamente para estudiar el papel del estrés en la recaída en la búsqueda de drogas. Aquí, nos informe sobre un método para inducir el restablecimiento de la cocaína que buscan en ratas de laboratorio a través de las exposiciones agudas al estímulo eléctrico plantar leve, eléctrico intermitente.

Un procedimiento para el estudio de la reposición de estímulo eléctrico plantar inducido por la cocaína Buscando en ratas de laboratorio

Miedo condicionado se puede disminuir a través de un proceso inhibidor llama extinción, pero pueden resurgir en condiciones tales como el paso del tiempo o la exposición al estrés. Nuestro protocolo presenta una forma novedosa de prevenir la recuperación miedo por la introducción de la extinción durante la ventana de reconsolidación (la fase de re-almacenamiento de una memoria reactivado).

Formación extinción durante la ventana de reconsolidación impide una recuperación del Miedo

Fuente: Childs, J. E., et al. Estimulación del nervio vago como herramienta para inducir plasticidad en vías relevantes para el aprendizaje de extinción. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el método de estimulación del nervio vago (VNS) en un modelo de rata para reducir el comportamiento de congelación. Las ratas condicionadas al miedo reciben ENV durante la reexposición al sonido, lo que reduce la congelación y revela su potencial terapéutico.

Estimulación del nervio vago en un modelo de rata para reducir el comportamiento de congelación

En el siguiente experimento se describe un protocolo para rastrear el miedo acondicionado en ratones. Este tipo de memoria asociativa incluye un período de seguimiento que separa el estímulo neutro y el estímulo no condicionado.

Traza el condicionamiento del miedo en ratones

La estimulación del nervio vago (VNS) se ha convertido en una herramienta para inducir plasticidad sináptica específica en el cerebro anterior para modificar una serie de comportamientos. Este protocolo describe cómo implementar VNS para facilitar la consolidación de la memoria miedo extinción.

La estimulación del nervio vago como una herramienta para inducir plasticidad en vías pertinentes para el Aprendizaje Extinción

Aquí describimos la metodología detallada necesaria para llevar a cabo experimentos de aprendizaje (SEFL) miedo estrés mejorada, un modelo preclínico de trastorno de estrés postraumático, en ratas y ratones. El modelo utiliza aspectos del miedo pavloviana acondicionado y congelar como un índice de mayor miedo en los roedores.

Miedo estrés mayor aprendizaje, un modelo de roedor robusto del trastorno por estrés postraumático

Describimos un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido que produce sobreentrenamiento e incubación del miedo en ratas. Este protocolo implica una sola sesión de entrenamiento con 25 emparejamientos de choque de tono (es decir, sobreentrenamiento) y una comparación de las respuestas de congelación condicionadas durante las pruebas de contexto y cue 48 h (corto plazo) y 6 semanas (a largo plazo) después del entrenamiento.

La incubación del miedo utilizando un protocolo de acondicionamiento del miedo extendido para ratas

Las respuestas conductuales defensivas están supeditadas a la intensidad de la amenaza, la proximidad y el contexto de exposición. Basándonos en estos factores, desarrollamos un paradigma de acondicionamiento clásico que provoca transiciones claras entre la congelación condicionada y el comportamiento de vuelo dentro de sujetos individuales. Este modelo es crucial para entender las patologías implicadas en la ansiedad, el pánico y los trastornos de estrés postraumáticos.

Un nuevo paradigma de acondicionamiento del miedo pavloviano para estudiar la congelación y el comportamiento del vuelo

Para estudiar las conductas de vuelo en un contexto de miedo, introducimos un protocolo modificado de condicionamiento del miedo. Este protocolo garantiza que los ratones exhiban consistentemente comportamientos de vuelo durante la presentación de la señal en el condicionamiento del miedo.

Condicionamiento del miedo modificado para inducir comportamientos de vuelo en ratones

El paradigma del miedo observacional evalúa la congelación vicaria en roedores como modelo de empatía afectiva. Este procedimiento consiste en exponer a los roedores observadores a demostradores conespecíficos que reciben descargas aversivas en los pies para provocar respuestas empáticas de congelación. Mediante el empleo de ensayos observacionales del miedo, los investigadores pueden investigar los mecanismos neuronales que subyacen a la empatía afectiva.

El miedo observacional como modelo de empatía afectiva en ratones

Aprende a estudiar la extinción del miedo condicionado en ratas hembras mediante el monitoreo del ciclo estral y administración de estradiol. Este protocolo permite analizar cómo las hormonas gonadales modulan la memoria y el comportamiento.

Protocolo para el Estudio de la extinción del miedo condicionado en ratas hembras Naturalmente Ciclismo

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