Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

El objetivo general de este procedimiento es obtener células endoteliales microvasculares cerebrales primarias murinas o MBX. Esto se logra primero aislando y luego homogeneizando los prosencéfalos libres de meninges de ratones adultos. En el segundo paso, el homogeneizado del tejido se procesa posteriormente mediante digestión enzimática.

Luego, en el paso final, las células endoteliales se separan por densidad, gradiente, centrifugación y se colocan en placas para el cultivo celular. En última instancia, la tinción inmunofluorescente de las células aisladas para la expresión de CD 31 se puede utilizar para confirmar la pureza del cultivo de MB mech. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como el uso de cerebros inmortalizados, líneas celulares endoteliales, es que los resultados obtenidos con células primarias proporcionan una mejor transferibilidad a la situación in vivo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la búsqueda de la barrera hematoencefálica, por ejemplo, qué vías están involucradas en el pensamiento de las células inmunitarias. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades neurovasculares, infecciosas, inflamatorias o degenerativas del sistema nervioso central. Como la disfunción de la barrera hematoencefálica está críticamente involucrada en el patógeno de tales enfermedades.

Este procedimiento será demostrado por Lisa Eeping, una estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Después de aislar los cerebros de 10 8 a 12 semanas de edad, C 57 BL, seis ratones almacenan los tejidos en cinco mililitros de PBS estéril. A continuación, utilice una pinza para extraer los troncos encefálicos, el cerebelo y el thalami, y luego enrolle cuidadosamente cada cerebro sobre papel secante estéril.

Para eliminar las meninges, agrupe los cerebros en un tubo de halcón de 50 mililitros y agregue 13,5 mililitros de DM em, luego pique el tejido primero con una pipeta de 25 mililitros y luego con una pipeta de 10 mililitros hasta que el medio se vuelva lechoso. Digiere el tejido en colagenasa y ADN a 37 grados centígrados en un agitador orbital a 180 RPM. Después de una hora, agregue 10 mililitros de DM em a la suspensión de tejido y centrifugue las células durante 10 minutos a 1000 Gs y cuatro grados Celsius.

Deseche el sobrenadante teniendo cuidado de no alterar el pellet suelto, y luego use una pipeta de 25 mililitros para probar el pellet aproximadamente 25 veces en 25 mililitros de B-S-A-D-M-E-M. Después de volver a centrifugar las células, utilice una pipeta de vidrio roto de gran diámetro para eliminar la capa superior de mielina lechosa. A continuación, retire la capa BSA con un PE normal o una pipeta.

Vuelva a suspender el pellet en nueve mililitros de DM em y luego agregue un mililitro de espacio de disco de colagenasa y 0,1 mililitros de ADN a las células. Digiera la solución a 37 grados centígrados en el agitador orbital a 180 RPM. Durante la digestión, establezca un gradiente de densidad de perca en una ultracentrífuga.

Después de una hora, agregue 10 mililitros de DM E em a la suspensión celular digerida para detener la reacción y luego gire las celdas y vuelva a suspender el pellet En dos mililitros de DM E em, agregue la suspensión celular con cuidado sobre el gradiente por llamada y luego separe las celdas por centrifugación. Después de la separación, las celdas pueden ser visibles como una interfaz nublada. Sumerja con cuidado la aguja estéril en la interfaz en un ángulo de 30 grados y recoja aproximadamente 12 mililitros de la solución.

La interfaz a menudo no es visible para obtener la mayor cantidad de células con la menor contaminación posible. Se debe aspirar una pequeña cantidad de la interfaz. Además de eso, la punta de la aguja estéril debe moverse con cuidado y continuamente a cada parte de la interfaz, transfiera las células a un nuevo halcón de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de DM em, y luego, después de girar las células nuevamente, reus, suspenda el paladar en 0,2 mililitros de medio de células endoteliales por un centímetro cuadrado de superficie de una placa de cultivo celular.

A continuación, retire la solución de recubrimiento de las placas de cultivo celular recubiertas y enjuague cada pocillo con PBS estéril en dos pasos de lavado consecutivos. Finalmente, mantener los cultivos celulares en medio de células endoteliales a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora estéril. Cambiar el medio cada dos o tres días inmediatamente después del aislamiento.

Las células murinas y contaminantes forman conglomerados que se pueden observar flotando en el cultivo celular. El tratamiento medio con micina conduce a la selección de BMAX murino, ya que las células contaminantes son mucho más susceptibles a la citotoxicidad mediada por purmicina y el BM E no afectado comienza a adherirse al colágeno cuatro placas de cultivo celular recubiertas de fibronectina hasta que el quinto día, el BME prolifera a una densidad de aproximadamente 80 a 90% formando una monocapa de partículas compactas. células inhibidas por contacto alineadas longitudinalmente y no superpuestas caracterizadas por su apariencia típica en forma de huso mediante la selección de micina puram, se alcanza una alta pureza de hasta el 99% de BMAX murina, como lo confirma el marcador de células endoteliales CD 31. Las BM E forman monocapas herméticamente selladas interconectadas por proteínas de unión estrecha.

Después de siete a ocho días de cultivo, estas capas celulares acumulan valores estables de resistencia eléctrica entre 20 a 30 ohmios por centímetro cuadrado y una capacitancia abundante en este momento, se pueden realizar ensayos funcionales como experimentos de migración celular o pruebas de permeabilidad con azul de Evans o dextrano una vez dominados. Esta técnica se puede realizar en cuatro o cinco horas después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como ensayos de migración, experimentos de permeabilidad o mediciones electrofisiológicas, para abordar esas preguntas visionarias, por ejemplo, ¿cómo se altera el tráfico de células inmunitarias en determinadas condiciones experimentales?

¿O cómo están involucrados los canales de hierro en la regulación de la barrera hematoencefálica? Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar la orina, las células endoteliales microvasculares del cerebro mediante homogeneización mecánica, enzimática, digestión y centrifugación en gradiente de densidad.