Aislamiento de Miofibroblastos de Mouse y Esófago Humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar miofibroblastos primarios de esófago humano y de ratón. Esto se logra recolectando primero todo el esófago del ratón recién nacido donante con tejido humano. La mucosa está separada de la muscular propia.

El segundo paso es picar el tejido y lavarlo varias veces en HBSS. A continuación, el tejido se digiere con colagenasa y se pica aún más, liberando las células mesenquimales junto con el epitelio adherido. A continuación, la población celular heterogénea se cultiva en medios de miofibroblastos en los que los miofibroblastos se adhieren, mientras que las células epiteliales no sobreviven y son arrastradas.

En última instancia, la inmunoquímica y la citometría de flujo se utilizan para confirmar que las células en cultivo primario son miofibroblastos. Demostradoremos los procedimientos Matthew Gargas, un técnico, y chow new, un postdoc de mi laboratorio, Tori. Después de sacrificar a un ratón de ocho a 12 días de edad, sujete el lado dorsal del animal y humedezca la superficie ventral con etanol al 70%.

A continuación, con unas pinzas, agarre y levante la piel anterior a la abertura uretral. Corta a lo largo de la línea media ventral desde la abertura uretral hasta el mentón. Solo corta la piel.

A continuación, haga incisiones desde la abertura uretral hasta las rodillas, formando una Y invertida. Después de las incisiones hasta las rodillas, haga incisiones a ambos lados de la caja torácica. Después de completar las incisiones, retire con cuidado la piel y déjela a un lado. Ahora levante el peritoneo y córtelo hasta el diafragma y la caja torácica.

Mantenga las tijeras apuntando hacia arriba para evitar daños en el contenido intratorácico y abdominal. Luego, levante suavemente el lóbulo izquierdo del hígado para exponer el estómago subyacente, la unión gástrica esofágica y la porción abdominal del esófago con tijeras quirúrgicas cortadas a lo largo de la línea media del esternón y la caja torácica hasta la cintura cervical. Otra vez. Al hacer esto, mantenga las tijeras en ángulo alejado de los órganos subyacentes.

A continuación, aparta la caja torácica para exponer el contenido de la cavidad torácica. Ahora retire suavemente el corazón y ambos lóbulos de los pulmones. Use aplicadores de algodón para absorber el sangrado según sea necesario.

El esófago torácico es un tubo estrecho y flexible posterior a la tráquea y anterior a la vértebra torácica. En los neonatos, encuentra la unión gástrica esofágica para identificar el esófago desde el estómago. Sin rodeos, diseccionar la vasculatura que rodea el esófago, incluyendo la grasa y el tejido mesenterio, hasta el origen esofágico en la cavidad cervical.

Ahora reseca toda la longitud del esófago y transfiérelo a HBSS enfriado si lo deseas. Además, extraiga una parte del estómago con fines de orientación. Comience este protocolo picando fragmentos de mucosa obtenidos de tejido de ratón o humano en HBSS en un tubo de micro fuga de 1,7 mililitros o un tubo de cinco mililitros respectivamente.

Ahora, al obtener células estromales esofágicas humanas, es importante separar la mucosa de la muscular propia subyacente mediante una disección aguda. Ahora, en el tubo, acuña aún más el tejido en pedazos de dos a tres milímetros con unas tijeras finas. Después del sedimento del fragmento de la mucosa esofágica, decantar lentamente el HBSS, teniendo cuidado de no desechar inadvertidamente el tejido.

También puede utilizar una pipeta de punta grande para eliminar el HBSS adicional. A continuación, añada el HBSS fresco. Mezcle el tubo con un movimiento suave y deje que el pañuelo se asiente.

Una vez asentado, decantar de nuevo el HBSS y repetir este lavado. Da el paso ocho veces en total. Después de los ocho lavados, incubar el tejido con colagenasa 11 y desincubar el tejido murino hasta 25 minutos en una batidora oscilante ajustada a velocidad lenta y a temperatura ambiente.

En las mismas condiciones, incubar tejido humano durante seis horas. Después de la digestión, mezcle aún más el tejido con unas tijeras finas y luego centrifugue el tejido a 200 G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y decante el pañuelo granulado en un tubo limpio de 1,7 mililitros.

Luego, bajo la campana de cultivo de tejidos, lave las células cinco veces en DMEM con sorbitol al 2% para eliminar las células no viables y otros desechos. Para cada lavado, deje que las células se asienten por gravedad y decanten la solución de lavado. Después de los lavados, siembre las células en tres pocillos de seis.

Pocillos en placa y cultivo en DMEM suplementado filtrado al vacío. El tejido humano puede requerir más pocillos o placas, dependiendo del tamaño del cultivo de la muestra, las células, hasta que los pocillos tengan un 80% de confluentes. Luego pase primero las células de adherencia a los matraces T 25, use 0.05% de tripsina en EDTA para desalojar las células.

A continuación, añada medios para neutralizar la reacción. Recoja las células desprendidas en un tubo de centrífuga. A continuación, haga girar las células a 400 g para recogerlas bajo un microscopio.

Observe la morfología en forma de huso de las células adherentes para distinguir las células estromales cultivadas de las células musculares y teñirlas inmunológicamente para Desmond. Utilizando un protocolo estándar, se colocan brevemente 15.000 células en cuatro portaobjetos de cámara de pocillos y se cultivan en medios de miofibroblastos durante 24 horas. Al día siguiente, fije las células y luego, antes de aplicar el anticuerpo primario, bloquee las células fijadas con suero de cabra al 5% en PBS, tanto los anticuerpos primarios como los secundarios también deben diluirse en suero de cabra al 5%.

Incubar con el anticuerpo primario a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, enjuague las células tres veces con PBS después de los lavados. Agregue los anticuerpos secundarios e incube las células durante una hora.

A temperatura ambiente, use tres lavados en PBS para eliminar los anticuerpos secundarios. A continuación, se pueden analizar las células teñidas después de los lavados. Aplique DPI con medios de montaje y cubreobjetos para establecer la pureza de las células esofágicas.

Examínelos en busca de marcadores de superficie de células hematopoyéticas y endoteliales. Uso de citometría de flujo. Cultive cantidades suficientes en matraces de cultivo hasta que estén listos para recolectar.

A continuación, separar las células estromales esofágicas de ratón cultivadas utilizando una solución de disociación celular no enzimática a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Siguiendo su recolección. Lave las celdas con el búfer de fax dos veces y cuente las celdas.

Ahora, utilizando un procedimiento de tinción estándar, tiñe con CD 45 para identificar las células inmunitarias y teñe con CD 31 para identificar las células endoteliales, luego pasa las células a través del citómetro de flujo. Las células estromales esofágicas se aislaron mediante digestión mecánica y enzimática y se cultivaron en placas de seis pocillos a las pocas horas de la siembra. Las celdas estaban en una suspensión mixta adherida a la placa.

Durante las siguientes 24 horas, las células en forma de huso brotaron de la suspensión celular y se adhirieron firmemente al fondo de la placa. Estas células cubrieron todo el pozo en cinco días y fueron conducidas con éxito conservando su morfología durante al menos 15 conductos vistos aquí, las células están en una densidad baja. Estas son las células fusiformes cerca de la cofluidez, tinción inmunológica de cultivos primarios de células estromales esofágicas.

Los cultivados en portaobjetos de cámara demostraron una expresión abundante de marcadores citoesqueléticos de miofibroblastos. La pureza del cultivo de alfa, SMA y mentón se evaluó mediante citometría de flujo. Se estableció la dispersión frontal y lateral para las células estromales esofágicas murnas primarias, seguidas de la compuerta y el análisis de las células vivas para las proteínas de la superficie celular.

Las células estromales esofágicas murnas primarias carecían de expresión de CD 45 hematopoyético y carecían de expresión de marcadores de superficie de células endoteliales CD 31. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer cultivos primarios de miofibroblastos de esófago humano y de ratón. Sí.