Name: Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a analizar los perfiles proteómicos de macrófagos M1 y M2 humanos mediante electroforesis 2D diferencial en gel. Esta técnica detecta variaciones proteicas con alta sensibilidad usando solo cinco microgramos de proteína.

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Este trabajo fue apoyado por Inserm. Marion Bouvet es miembro del Ministerio de Investigación y Tecnología de Francia. Annie Turkieh es becaria del FP7 HOMAGE (305507) de la Unión Europea.

El protocolo sigue las directrices de nuestro comité de instituciones de ética de la investigación humana. Capa de donantes humanos sanos Buffy se obtuvieron de la Transfusión de Sangre del Centro Regional (Lille, Francia). Las muestras obtenidas de las capas leucocitarias se declaran como una colección Inserm (n ° DC2010-1209). 1. Material y Cultura Preparación de Medios <ol><li> Diluir 10 veces de tampón fosfato salino (PBS) en agua destilada estéril para obtener PBS 1x. </li><li> Hacer RPMI 1640 suplementado con gentamicina (40 mg / ml) y L-glutamina (2 mM), con y sin 10% de suero humano agrupado. </li></ol> 2. Los cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos (MDM) <ol><li> Diluir buffycoat (25 ml) con 1x PBS. Coloque con cuidado en un / tubo Leucosep Ficoll y se centrifuga a 1600 xg durante 20 min, a temperatura ambiente. </li><li> Recoge los monocitos en la interfaz en un nuevo tubo. Lavar 3 veces con 10 ml de PBS 1X que contiene 0,1% etilendiaminotetraacéticoácido acético (EDTA) por centrifugaciones sucesivas a 1000 xg, 370 xg y 160 xg durante 10 min cada uno, y luego una vez en 1X PBS solo a 160 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 5 ml de medio RPMI-1640 sin suero y sembrar las células en placas de 35 mm a una densidad de 1 x 10 6 células por plato. </li><li> Después de la sedimentación durante 90 min en la incubadora, descartar el sobrenadante que contiene las células no adherentes. Lavar las células adherentes, que consiste en monocitos, 3x con 1 ml de PBS; a continuación, añadir 1 ml de medio fresco que contiene 10% (v / v) de suero humano a las células previamente libres de suero. </li><li> Después de 6 días de cultivo, para producir los macrófagos diferenciados alternativos (M2), añadir recombinante humano IL-4 (15 ng / ml) y mantener durante 6 días. A continuación, tratar macrófagos diferenciados con lipopolisacárido (100 ng / ml) en el día 12 durante 4 horas para obtener los macrófagos M1. </li></ol> 3. Extracción de M1 y M2 macrófagos Proteínas de electroforesis 2D <ol><li> Lave macrophedades tres veces con 25 mM Tris, pH 7,4, y desechos en tampón que contenía 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato (CHAPS), 2 M tiourea y 7 M urea. </li><li> Lyse células utilizando un mezclador adecuado para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga durante 5 min en hielo y se almacena a -20 ° C. </li><li> Determinar la concentración de proteína usando un reactivo de Bradford comercial. Almacenar 100 ml de alícuotas de las proteínas a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 4. isoelectroenfoque NOTA: Lleve a cabo todos los procedimientos de etiquetado en la oscuridad. <ol><li> Reducir 5 g de cada muestra (M1 y M2 macrófagos) ajustado a 9 l con tampón de lisis con 2 mM de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Añadir cianina 3 (Cy3) para extraer M1 y el extracto de colorante reactivo sulfhidrilo M2 a una concentración de 0,8 de proteína / g nM. Añadir cianina 5 (Cy5) para M1 y M2 extrae a una concentración de 0,8 nM de proteína / g e incubardurante 30 min a 37 ° C. </li><li> Detener la reacción con la adición de un volumen igual de tampón de muestra que contiene 7 M urea, 2 M tiourea, 4% de CHAPS, ditiotreitol 130 mM (DTT) y 2% pharmalytes. </li><li> Mix Cy3-etiquetados muestras M1 M2 con muestras marcadas con Cy5 en una mano y Cy3-etiquetados muestras M2 con muestras M1 etiquetados con Cy5 en otra parte. </li><li> Rehidratar un gradiente de pH inmovilizado (IPG) tira (240 mM, pH 3-10 gradiente lineal) con 450 l de muestras mezcladas marcadas en tampón que contenía 7 M urea, 2 M de tiourea y 4% de CHAPS en un sistema de células de enfoque isoeléctrico (IEF) durante 24 horas sin aplicar ninguna corriente. </li><li> Realizar el enfoque a 300 voltios (V) durante 3 horas, y luego en un gradiente a 1000 V durante 6 horas, en un gradiente a 8000 V durante 3 horas y finalmente a 8000 V durante 3 horas. </li></ol> 5. segunda dimensión NOTA: Lleve a cabo todos los procedimientos de electroforesis en la oscuridad. <ol><li> Incubar las tiras IPG en tampón de equilibrio contienening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M urea, 2% (w / v) de dodecil sulfato de sodio (SDS) y 30% (v / v) de glicerol durante 10 min. </li><li> Transferencia de las tiras IPG equilibradas para la segunda dimensión (electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE)) en 12,5% en geles de PAGE y sellar con bajo punto de fusión de agarosa. </li><li> Llevar a cabo la electroforesis a 20 ° C utilizando un sistema Ettan-Daltsix a un voltaje constante de 70 V durante la noche seguido por 300 V hasta que el azul de bromofenol frontal alcanza la parte inferior del gel. </li></ol> Análisis Adquisición y bioinformático 6. Imagen <ol><li> Geles de exploración emitidos entre las dos placas de vidrio de baja fluorescencia con un escáner DIGE Imager en longitudes de onda de excitación / emisión de 532/580 nm para Cy3 y 633/670 nm para Cy5 para producir imágenes con un tamaño de píxel de 100 micras. </li><li> Realizar análisis de imágenes con software comercial como se detalla anteriormente 12. </li><li> Calcular y normalizar los volúmenes puntuales en cada imagen. Asigne un volumen normalizado lugar como apoyoortion del valor total de cada mancha detectada en el gel. </li><li> Analizar las diferencias de volúmenes disponibles para cada tipo de proteína de los macrófagos mediante la comparación del valor de volumen normalizado punto entre los dos grupos (M1 y M2). Tenga en cuenta la diferencia entre los volúmenes disponibles para ser significativo si el cambio es de 1,5 veces (p &lt;0,05, de un solo sentido el análisis de ANOVA). </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

No hay conflicto de intereses declarado.

El protocolo se describe en el presente documento detalla un método para analizar el impacto de diversos estímulos de los dos subtipos de macrófagos, M1 (pro-inflamatoria) y M2 (anti-inflamatorio). Los cultivos primarios de macrófagos M1 y M2 se obtuvieron de la diferenciación de los monocitos según lo publicado previamente 7. El procedimiento de la electroforesis en gel 2D DIGE requiere materiales y equipos especializados, tales como células IEF para placas isoelectroenfoque, baj...

Los macrófagos son células heterogéneas y de plástico que son capaces de adquirir fenotipos funcionales distintos. In vivo, estas células responden a una gran variedad de signalssuch ambiental micro como productos microbianos, citoquinas, etc. 1. In vitro, el fenotipo pro-inflamatoria (M1) de macrófagos puede ser inducida por lipopolisacárido (LPS) y el fenotipo anti-inflamatoria (M2) por algunas citoquinas tales como la interleuquina-4 (IL-4). Además, los macrófagos pueden cambiar de un M1 a M2 fenotipo activado, y por el contrario, de las señales específicas 2. Dependiendo del fenotipo, macrófagos tendrán diferentes funciones. Macrófagos M1 son células que producen citoquinas pro-inflamatorias, como el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), para matar microorganismos o células tumorales 3. En contraste, los macrófagos M2 prevenir estas respuesta inflamatoria como en la curación de heridas y la fibrosis mediante la producción de anti-inflammatorY factores tales como TGF-β 3,4. Células mononucleares de sangre periférica humanos de donantes sanos se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll como se describió anteriormente 5 utilizando una técnica adaptada de Boyum 6. Los macrófagos en cultivo pueden diferenciarse en M1 o M2 fenotipo después de 6 días de cultivo primaria 7. Análisis de la expresión de proteínas o cambios en las proteínas entre los dos subtipos de macrófagos en virtud de diversos estímulos controlados, tales como la patogenicidad de host o toxinas microbianas, será útil para descifrar la funcionalidad de la pro- y anti-macrófagos inflamatorios. Proteómica son herramientas únicas para la supervisión directa de las proteínas que son específicamente altura o hacia abajo-regulada en los macrófagos humanos cultivados bajo diferentes estímulos. Los tintes fluorescentes han resuelto algunas de las limitaciones de la electroforesis en gel de 2D, tales como una baja sensibilidad y análisis de imagen 8 &lt;<html> / Sup&gt;. Los colorantes que reaccionan con residuos de cisteína han aumentado la sensibilidad de detección en comparación con los reaccionar con residuos de lisina 9. En un estudio anterior, hemos demostrado la utilidad del etiquetado saturación DIGE para el análisis de los escasos 10 muestras en comparación con el teñido de plata clásica electroforesis 2D 11. Esta tecnología es útil para analizar rápidamente modificaciones de la proteína entre los dos subtipos de macrófagos o entre los macrófagos no tratados y tratados del mismo subtipo. Las ventajas de esta técnica proteómica están teniendo acceso a la información de tamaño de la proteína y las modificaciones posteriores a la traducción mediante el análisis del gel 2D 12. Debe tenerse en cuenta que esta no es una técnica de alto rendimiento, lo que limita el número de muestras que se pueden analizar. El desarrollo de ensayos de alto rendimiento basados ​​en espectrometría de masas como revisado recientemente 13 puede mejorar esto. _content &quot;&gt; Aquí presentamos cómo realizar análisis DIGE 2D a partir de la extracción de proteínas de los macrófagos en cultivo a través de los procesos de electroforesis, isoelectroenfoque y SDS-PAGE, así como información sobre la utilidad de software 2D adecuada.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>suero humano</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1.077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; placa de 6 pocillos PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>lipopolisacárido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Investigación Orgánica&nbsp;</td><td>3.00E+01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro 0.22 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de 100 ml</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reactivo</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-colorante reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>Tira IPG 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protean Célula IEF</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Ettan-Daltsix</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Escáner de imágenes</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot Dinámica</td><td></td><td></td><td>no lineal</td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>cualquier proveedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>cualquier proveedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>su&eacute; e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute; e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Limpieza 2D GE</td><td>Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Oscuro; tilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>mechas de electrodo</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2d

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

El objetivo del protocolo de electroforesis bidimensional (2D) descrito aquí es mostrar cómo analizar el fenotipo de macrófagos humanos cultivados. Se ha demostrado el papel clave de los macrófagos en diversos trastornos patológicos como enfermedades inflamatorias, inmunológicas e infecciosas. En este protocolo, utilizamos cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos humanos que se pueden diferenciar en el fenotipo M1 (proinflamatorio) o M2 (antiinflamatorio). Este modelo in vitro es fiable para estudiar las actividades biológicas de los macrófagos M1 y M2 y también para un enfoque proteómico. Las técnicas proteómicas son útiles para comparar el fenotipo y el comportamiento de los macrófagos M1 y M2 durante la patogenicidad del huésped. La electroforesis en gel 2D es una potente técnica proteómica para mapear un gran número de proteínas o polipéptidos simultáneamente. Describimos el protocolo de electroforesis 2D mediante colorantes fluorescentes, denominado Electroforesis en Gel Diferencial 2D (DIGE). Las proteínas de los macrófagos M1 y M2 se marcan con colorantes de cianina antes de su separación por enfoque isoeléctrico, de acuerdo con su punto isoeléctrico en la primera dimensión, y su masa molecular, en la segunda dimensión. A continuación, se utilizan puntos polipeptídicos o de proteínas separados para detectar diferencias en los niveles de expresión de proteínas o polipéptidos. Los enfoques proteómicos descritos aquí permiten la investigación de los cambios en las proteínas de los macrófagos asociados con diversos trastornos como la patogenicidad del huésped o las toxinas microbianas.

Para realizar el análisis proteómico diferencial apropiado, el procesamiento de las muestras para ser analizadas debe ser verificada. En el ejemplo presentado, la calidad de cultivo celular de los macrófagos se requiere para los aspectos morfológicos y moleculares según lo publicado previamente 5. La diferenciación de los monocitos en macrófagos y la homogeneidad de la cultura fue seguido por microscopía de fase. Figura 1 mostró un ejemplo de cultivos primarios de...

Los macrófagos son las células clave implicadas en la patogenicidad del huésped. Los macrófagos muestran una diversidad fenotípica y funcional que puede ser analizada y detectada mediante análisis proteómico. Este artículo describe cómo realizar electroforesis 2D de cultivos primarios de macrófagos humanos diferenciados en fenotipo M1 o M2.

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar el fenotipo de los subconjuntos de macrófagos M1 proinflamatorios y M antiinflamatorios humanos mediante diferenciales 2D en electroforesis en gel. Esto se logra marcando primero las proteínas extraídas de los cultivos primarios de macrófagos M1 y M dos con colorantes sinusoidales. En el segundo paso, las proteínas se mezclan entre sí y se lleva a cabo un electroenfoque ISO por rehidratación en las muestras.En la siguiente segunda dimensión, la electroforesis se realiza con un gradiente de pH movilizado o tiras de IPG en la oscuridad, y luego los geles se escanean con el diferencial en el escáner de electroforesis en gel. En última instancia, se realiza un análisis de las imágenes numeradas para detectar las diferencias en las manchas pépticas de los pólipos entre los subconjuntos de dos macrófagos M1 y M. La principal ventaja de esta técnica entre los métodos existentes, como la electroforesis clásica en gel de todi, es que esta técnica es más sensible, requiriendo solo cinco microgramos de proteínas, lo cual es muy importante para muestras obtenidas de pacientes humanos.Para demostrar el procedimiento estarán Mario Bove, estudiante de doctorado, Olivia Beza y técnico de Magac de mi laboratorio Para preparar cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos, comience diluyendo 25 mililitros de capa de Buffy en 25 mililitros de PBS. A continuación, cargue cuidadosamente la sangre diluida en un gradiente de separación y centrifugue las células durante 20 minutos a 1600 Gs y a temperatura ambiente cuando las células hayan terminado de girar. Recoja los monocitos en la capa de interfaz, seguido de tres lavados sucesivos de las células recolectadas en 10 mililitros de PBS que contengan 0,1% de EDTA después del tercer lavado.Gire las células una vez más solo en PBS y luego vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio RPMI 1640 sin semilla de suero. Las células en placas de 35 milímetros a una densidad de uno por 10 a las seis células por placa, y luego, después de una sedimentación de 90 minutos en la incubadora, desechan el sobrenadante y lavan los monocitos adherentes tres veces con un mililitro de PBS. A continuación, las células en 10 mililitros de medio fresco que contenían un 10% de volumen por volumen de suero humano durante seis días a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono.Luego, para producir macrófagos M dos antiinflamatorios, complemente algunos de los cultivos con 15 nanogramos por mililitro de IL cuatro en el día seis de cultivo para producir macrófagos proinflamatorios en el día 12. Tratar los otros cultivos de macrófagos diferenciados con 100 nanogramos por mililitro de LPS durante cuatro horas para aislar los subconjuntos de macrófagos para la electroforesis 2D. A continuación, lave el cultivo de interés tres veces con 25 milimolares tris y luego libere las células de la parte inferior de las placas con tampón de extracción de chaparreras.A continuación, transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y átelas a cuatro grados centígrados. Después de cinco minutos, transfiera las células en alícuotas de 100 microlitros a menos 20 grados Celsius de almacenamiento hasta el análisis de concentración de proteínas para el electroenfoque ISO de los subconjuntos de macrófagos. Primero, ajuste las muestras a alícuotas de nueve microlitros y luego reduzca las soluciones celulares con tampón de lisis suplementado con dos milimolares de TCEP a 37 grados Celsius.Después de una hora, incubar los extractos con S SI tres y S SI cinco a 37 grados centígrados, deteniendo la reacción después de 30 minutos con la adición de un volumen igual de tampón de muestra. A continuación, cree dos mezclas separadas de volúmenes iguales de S SI, tres proteínas M1 marcadas con SCI cinco proteínas M marcadas, dos. A continuación, rehidrate una tira de IPG con 450 microlitros de las muestras mezcladas marcadas en tampón de extracción en un sistema de celda de enfoque isoeléctrico durante 24 horas sin aplicar ninguna corriente.Al día siguiente, inicie el enfoque a 300 voltios durante tres horas, luego configure un gradiente a 1000 voltios durante seis horas, seguido de dos gradientes de 8.000 voltios durante tres horas cada uno para realizar electroforesis de segunda dimensión e incubar las tiras de IPG en tampón de equilibrio. Después de 10 minutos, transfiera las tiras a geles de 12,5% de página y séllelas con aros de bajo punto de fusión. A continuación, utilice un sistema edin dsic a un voltaje constante de 70 voltios para realizar la electroforesis a 20 grados centígrados durante la noche, seguida de una carrera de 300 voltios hasta que el frente de azul de fenol bromo llegue al fondo del gel para adquirir imágenes de los geles.Colóquelos entre las dos placas de vidrio de baja fluorescencia de un escáner de imágenes de electroforesis diferencial y de gel, y escanee los geles a longitudes de onda de emisión de excitación de 5 32, 5 80 nanómetros para tres y 6 33 6 70 nanómetros para cinco para producir imágenes con un tamaño de píxel de 100 micrómetros. Analice el con el software adecuado y luego calcule y normalice los volúmenes puntuales en cada imagen, asignando un volumen puntual normalizado como proporción del valor total de cada punto detectado en el gel. Analice las diferencias en los volúmenes puntuales de proteínas para cada tipo de macrófagos comparando el valor normalizado del volumen puntual entre los dos grupos de macrófagos, considerando que la diferencia entre los volúmenes puntuales es significativa si el cambio es 1,5 veces.En este experimento. Los patrones proteicos 2D de los dos subtipos de macrófagos M1 proinflamatorios y M dos antiinflamatorios se determinaron por diferencial 2D. En la electroforesis en gel, se observó el mismo patrón de proteínas para M1 o M dos, independientemente de los colorantes cian utilizados.Curiosamente, el análisis bioinformático del gel reveló 20 áreas que contenían manchas, se cuantificaron los aumentos y disminuciones entre los volúmenes de manchas, según lo visualizado por la coloración amarilla, azul y verde. Se consideró que las manchas tenían una expresión diferencial significativa si el cambio de pliegue del volumen de manchas normalizado era mayor que 1.5 con un valor de P menor que 0.05. Siguiendo esta CHE, se pueden realizar métodos como la cuantitativa, la espectrometría de masas o el análisis proteómico adicional para responder a preguntas adicionales, como qué tipo de proteínas se expresan diferencialmente entre los dos subconjuntos de macrófagos en respuesta a diversos estímulos.

proteomic-profiling-of-macrophages-by-2d-electrophoresis

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.

Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Este protocolo describe el uso de la espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras en células eucariotas. Aquí, ilustramos la precisión de esta técnica mediante el análisis de los múltiples estados de activación de los macrófagos en respuesta a su microentorno.

La espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa es un método preciso y rápido para analizar diferentes modos de activación de macrófagos

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Aquí se describe un protocolo que las parejas de dos técnicas de proteómica, es decir, de 2 dimensiones electroforesis (2DE) y espectrometría de masas (MS), para identificar expresados ​​diferencialmente / proteínas modificadas después de la traducción entre dos o más grupos de muestras primarias. Este enfoque, junto con los experimentos funcionales, permite la identificación y caracterización de los marcadores de pronóstico / dianas terapéuticas.

Desde un 2DE-Gel Spot para Función de Proteínas: Lección aprendida de HS1 en la leucemia linfocítica crónica

La reprogramación metabólica es una característica y un requisito previo para la polarización de los macrófagos M1 y M2. Este manuscrito describe un ensayo para la medición de los parámetros fundamentales de la glucólisis y la función mitocondrial en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón. Esta herramienta se puede aplicar para investigar cómo factores particulares afectan el metabolismo y el fenotipo del macrófago.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

Este protocolo permite un investigador aislar y caracterizar tejido residente macrófagos en varios sello inflamado los tejidos extraídos de modelos inducida por la dieta de los trastornos metabólicos.

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Aquí, presentamos una electroforesis en gel bidimensional (2DE) acoplada con espectrometría de masas (MS) para separar e identificar adenoma pituitario humano tejido proteoma, que presenta un patrón de 2DE buena y reproducible. Muchas proteínas se observan en cada punto de 2DE al analizar el proteoma del complejo del cáncer con el uso de MS de alta sensibilidad.

Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario

Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Describimos nuestro protocolo para medir los ritmos biológicos en el catabolismo proteico a través de la autofagia y el proteosoma en el hígado de ratón.

Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Aprende a analizar los perfiles proteómicos de macrófagos M1 y M2 humanos mediante electroforesis 2D diferencial en gel. Esta técnica detecta variaciones proteicas con alta sensibilidad usando solo cinco microgramos de proteína.

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

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