La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar objetivamente los parámetros sinápticos, incluido el tamaño de la sinapsis, la fragmentación y la densidad relativa de proteínas en la membrana postsináptica. Esto se logra diseccionando primero el músculo de interés de los animales de experimentación. A continuación, el músculo disecado se criosecciona y las secciones se tiñen inmunológicamente para microscopía de fluorescencia.

A continuación, en phos, se muestrean objetivamente imágenes de las uniones neuromusculares de los diferentes grupos de tratamiento y se cuantifica la intensidad relativa de la tinción para las especializaciones sinápticas. En última instancia, las medidas cuantitativas reproducibles de los efectos de un tratamiento o modificación genética sobre la organización estructural de la unión neuromuscular se obtienen mediante microscopía confocal. Pues bien, este método proporciona protocolos objetivos estandarizados que utilizan microscopía confocal para evaluar los cambios en la estructura de la unión neuromuscular en modelos de ratón de trastornos como la miastenia gravis y la enfermedad de la neurona motora.

Por lo general, las personas que intentan este método pueden tener dificultades porque el muestreo de NPLS en el microscopio confocal de una manera imparcial y objetiva requiere una planificación. Después del muestreo, el análisis de NPLS debe realizarse de manera coherente y reproducible, donde la variabilidad de un animal a otro entre los parámetros de la placa puede dificultarlo. Después de aislar la criosección y la tinción inmunofluorescente, las uniones neuromusculares de ratón o njs, de acuerdo con el protocolo de texto, ciegan los portaobjetos etiquetando cada uno con un número aleatorio que permanece conocido solo por un segundo investigador hasta después de que se complete la cuantificación de los parámetros NMJ. Coloque un portaobjetos en la platina del microscopio y use un conjunto de filtros trit C para verlo bajo iluminación de campo amplio.

Muévase progresivamente a través de los campos de izquierda a derecha y hacia atrás hasta que aparezca una placa final en el campo con el orificio confocal configurado en 1.0 unidad aireada, y utilizando una potencia láser baja, optimice los niveles de ganancia y compensación para trit C red BGT en la placa final que se va a fotografiar. A continuación, utilizando el láser de 488 nanómetros, optimice el ajuste de la fluorescencia C, que representa la sinaptofisina, y luego recoja una pila Z de la placa final con un intervalo de 0,7 micras entre cada corte óptico. Guarde las imágenes con un nombre de archivo que incluya la fecha de la sesión de imágenes, el nombre en clave de la diapositiva y el número de la placa final.

Repita el procedimiento de muestreo e imagen que se acaba de mostrar hasta que se recojan 20 placas finales del portaobjetos o la muestra. Y luego repita el proceso para las diapositivas codificadas restantes con la misma configuración confocal. Tome algunas imágenes de la corredera de control.

Utilice el software gratuito de imagen J para abrir un Zack y en un canal fluorescente, prepare una imagen de proyección máxima. Guarde las proyecciones como archivos TIF con el nombre del archivo, incluida la fecha de la sesión de la imagen, el código de muestra, el número de placa final y el canal fluorescente. Ahora use la imagen J para abrir la proyección Z.

Seleccione el receptor de acetilcolina o el canal de imagen A CHR y seleccione el tipo de imagen de ocho bits para convertir la imagen en color RGB de 24 bits en una imagen en escala de grises de ocho bits en la pantalla con la herramienta de polígono. En el canal de tinción BGT rojo, dibuje un contorno aproximado alrededor de la placa final de interés, excluyendo cualquier mancha que no se origine en la placa final de interés. Seleccione Umbral de ajuste de imagen para aplicar un umbral de intensidad mínima a la imagen.

Ajuste el nivel de umbral para aislar las partes teñidas con A CHR y excluir la señal de fondo circundante como subumbral. A continuación, abra una segunda ventana con la imagen original a tono completo para compararla. Para confirmar la configuración del umbral con el contorno del polígono aún presente, seleccione analizar, analizar partículas en el menú emergente.

Especifique el rango de tamaños en número de píxeles desde 50 hasta el infinito, lo que elimina la selección de pequeños artefactos que surgen del ruido eléctrico. En el multiplicador de fotos, haga clic en analizar partículas para generar una ventana con una lista de áreas discretas de supra umbral y sus valores de intensidad de fluorescencia numerados tal como aparecen en la imagen binaria. Copie estos datos en una hoja de cálculo etiquetada para medir el área total de la placa final.

Dentro del polígono, seleccione Analizar, medir, copie y pegue los datos de las áreas e intensidades de A CHR en una hoja de cálculo con columnas etiquetadas. Cambie al canal de sinaptofisina. Prepare una imagen de proyección máxima.

Seleccione un área de interés y establezca el umbral de intensidad mínimo como se acaba de demostrar. Para medir el área de superposición, aplique los siguientes pasos. Abra el archivo original que contiene las dos imágenes de canal y seleccione las pilas de imágenes.

Apilar a imágenes para dividirlo en dos imágenes separadas. Utilizando el complemento de colocalización de imagen J, seleccione la colocalización del complemento e ingrese los valores de umbral registrados previamente para los canales A CHR y nervioso en el cuadro de consulta del canal correspondiente. El resultado es una imagen superpuesta en píxeles blancos.

Convierta la imagen de superposición recién creada a un formato de escala de grises y aplique un umbral al valor máximo, que solo seleccionará los píxeles blancos correspondientes al área de superposición de los dos canales anteriores. Registre en la hoja de cálculo el valor del área resultante de la colocalización, que representa el área de superposición en píxeles, prepare una hoja de cálculo de datos. Las medias de muestra calculan y representan gráficamente las desviaciones estándar y los errores estándar en forma de histogramas o diagramas de dispersión.

Traza y asigna áreas CHR como diagramas de dispersión o histogramas de frecuencia para determinar si los datos se distribuyen normalmente antes de las pruebas estadísticas. Después de preparar la tinción inmunofluorescente y la obtención de imágenes de las secciones de fibras musculares transversales como se describe en el protocolo de texto, abra un archivo de imagen original y, mientras visualiza el canal A CHR, seleccione las pilas de imágenes apiladas para dividir los canales, seleccione el tipo de imagen de ocho bits para convertir el formato de escala de grises de ocho bits a la pantalla. Haga esto para ambos canales de fluorescencia.

Seleccionar pilas de imágenes para apilar y abrir una nueva pila a partir de dos imágenes de ocho bits previamente separadas, lo que permite cambiar entre los dos canales de fluorescencia dentro de una sola ventana con la herramienta Polígono. Traza una línea ajustada alrededor del límite de la tinción A CHR, selecciona analizar medida para medir la intensidad media de A CHR dentro del área cerrada. Copie este valor en una hoja de cálculo etiquetada conservando el contorno del polígono.

Cambie al segundo canal de fluorescencia y seleccione analizar medición. Esto producirá la tinción promedio para la proteína de interés dentro del área sináptica definida por la tinción A CHR. Elija un área alejada de las manchas visibles de la placa terminal.

A continuación, seleccione analizar medida para medir la intensidad media de la fluorescencia de fondo. Repita la medición para los otros canales de fluorescencia y copie los valores de fondo en la hoja de cálculo de valores de fluorescencia. Reste los valores de fondo promedio de los valores de la placa terminal para obtener las intensidades corregidas para A CHR y la proteína de interés en cada placa terminal.

Finalmente, divida los valores de intensidad de nplate corregidos para la proteína de interés por la intensidad de fluorescencia BGT corregida para obtener las proporciones de intensidad de fluorescencia como se muestra aquí. La intensidad de fluorescencia tanto para A CHR como para la sinaptofisina aumenta bruscamente en el límite entre la porción sináptica y sináptica de PERS de la placa terminal del motor. Para tales imágenes, un umbral mínimo aislará fácilmente el área rica en A CHR o rica en sinaptofisina de la placa terminal.

Como se demuestra en esta figura en ratones envejecidos y en algunos estados patológicos, la tinción de la placa terminal para la sinaptofisina puede ser menos intensa. Los bordes de un grupo de CHR pueden aparecer borrosos, y puede haber niveles más altos de autofluorescencia extra sináptica. Los diagramas de dispersión revelan un rango considerable en el área rica en CHR A entre las placas terminales del músculo tibial anterior de cualquier ratón individual. Sin embargo, el área promedio de A CHR basada en 15 a 20 imágenes de la placa terminal de la cara fue similar entre siete ratones de muestra. En las secciones transversales, la placa final achr generalmente aparece en forma de media luna, pero esta forma es a menudo irregular, como se ilustra aquí.

fluorescencia de fondo de baja intensidad, como se muestra aquí en el canal de sinaptofisina, generalmente revela si un parche de tinción A CHR representa una sola placa terminal o dos placas terminales separadas ubicadas en las fibras musculares adyacentes. Además, muchas proteínas sinápticas como el rapson, el almizcle y el beta distro glicano están colocalizadas con un CHR en la nplaca. Al intentar este procedimiento, es importante que los experimentadores permanezcan ciegos a los grupos de tratamiento y genotipo durante el muestreo y el análisis de las imágenes de nplate.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recopilar, muestrear y analizar imágenes fluorescentes confocales de las uniones neuromusculares. En última instancia, los investigadores deberían ser capaces de comparar de forma coherente y objetiva diferentes parámetros estructurales de la placa entre diferentes grupos de tratamiento y genotipos.