Name: La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprende a cuantificar parámetros sinápticos en la unión neuromuscular mediante microscopía confocal de fluorescencia. Este método permite evaluar cambios estructurales en modelos de enfermedades neuromusculares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud [570930]. Las imágenes se llevaron a cabo en el Centro de Microscopía Avanzada del Instituto Bosch. Se agradece a los antiguos miembros del laboratorio, cuyo trabajo se cita, por sus contribuciones al desarrollo de estos métodos.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
<li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li>
<li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663(2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
<li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412(2010).</li>
<li>Shimizu, S. Routes of Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein%2C+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li>
<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
<li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase%3A+Organiser+of+synaptic+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+%CE%B22-adrenoceptor+agonist%2C+albuterol%2C+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840(2014).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los protocolos descritos aquí nos han permitido medir y cuantificar los cambios en las propiedades de la UNM en toda una serie de condiciones, incluyendo los estados normales de envejecimiento y la enfermedad. Los métodos descritos para en face imágenes NMJ permitirán a los investigadores comparan el área de especialidades pre y postsinápticos y el área de superposición sináptica / alineación. Para comparar la intensidad relativa de las proteínas pre y postsinápticos el segundo protocolo, que utiliza secciones ópticas t...

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis relé crítico que media la comunicación entre el sistema nervioso y músculo esquelético. Se requiere para todo el movimiento voluntario. La microscopía de fluorescencia se ha utilizado para estudiar los efectos de los transgenes en el ratón NMJ 1-3 o para comparar los efectos de la edad, la dieta, el ejercicio y la enfermedad en roedores NMJs 4-11. Tales estudios han enseñado mucho acerca de la fisiología y la fisiopatología de la UNM, pero los diversos parámetros informado (por ejemplo, área AChR, área de placa terminal, longitud del perímetro, los índices de fragmentación) a menudo hacen que sea difícil comparar los resultados de estos estudios. Hay una expectativa creciente de investigadores pre-clínicos para ser capaces de demostrar la reproducibilidad, en particular en estudios con modelos de roedores de enfermedad 12. Los protocolos descritos aquí fueron refinados a través de una serie de estudios que investigaron ch desarrollo, fisiológico y fisiopatológicoanges de la UNM. Tales estudios requieren la medición de la zona de especializaciones sinápticas en la placa motora terminal del ratón y la densidad relativa de embalaje de las proteínas sinápticas dentro de especializaciones postsinápticos 13-15. La utilidad de estos métodos se ilustra por estudios recientes en un modelo de ratón de anti-MuSK miastenia gravis. Las inyecciones diarias de IgG de miastenia anti-MuSK positivos gravis pacientes en ratones adultos causó que se vuelven débiles dentro de 2 semanas 16. Imágenes de máxima proyección confocal de secciones musculares que fueron etiquetados doble para sinaptofisina (en terminales nerviosas) y AChR postsinápticos revelaron una disminución progresiva en el área de tinción AChR como el principal cambio. Es importante destacar que la tasa de disminución fue suficiente para explicar la disminución comparables en la amplitud de los potenciales sinápticos, fracaso de la transmisión sináptica y debilidad muscular 17,18. Cualitativamente hallazgos similares fueron reportados por otros grupos de investigación10,19. Los mismos métodos de medición NMJ ya se han utilizado para evaluar el impacto de tres fármacos para el tratamiento de la miastenia gravis anti-MuSK en este modelo de ratón 20,21. Envejecimiento sedentario puede llevar a la pérdida de las conexiones neuromusculares. Los protocolos descritos aquí han revelado una disminución asociada a la edad en la zona de sinaptofisina terminación nerviosa en placas motoras como ratones progresan en la vejez. Los mismos métodos revelaron que el ejercicio voluntario podría evitar en gran medida la reducción de la zona de la terminal nerviosa presináptica 22, en consonancia con el trabajo previo de otros grupos 4. La pérdida de las conexiones neuromusculares también se produce en el modelo de ratón SOD1G93A de la esclerosis lateral amiotrófica 9,23. Los estudios mencionados anteriormente demuestran que una variedad de condiciones de salud puede conducir a la reducción de la superficie de cualquiera de las especialidades pre o post-sináptica en la UNM. Esto puede producir problemas para la diversión sinápticacción o puede anunciar la pérdida completa de la conexión neuromuscular. Tres protocolos se describen que permiten la cuantificación de la zona y la densidad de especializaciones sinápticas. El propósito de la primera protocolo es proporcionar una medida práctica y reproducible de las áreas de pre y post-sinápticas especializaciones y su alineación en NMJs de mamíferos, usando microscopía de fluorescencia. Confocal de imágenes de proyección máximo de dos dimensiones y análisis de imagen con NIH ImageJ se utiliza para detectar cambios en el área de tinción sinaptofisina (vesículas sinápticas), AChR postsinápticos y área de superposición sináptica. Parámetros confocal de imágenes (ganancia y nivel de compensación) se han optimizado para cada NMJ a fin de maximizar la información visual utilizado para discernir el área de especialización sináptica. Insuficiencia neuromuscular también puede resultar de los cambios en la densidad de AChR postsináptica y / o otras proteínas sinápticas. El segundo protocolo se puede aplicar para detectar cambios en la densidad relativa de las proteínas postsinápticos talescomo el almizcle, RapSyn, distroglicano, fosforilada quinasa Src y fosforilada AChR 18,21. En la miastenia gravis, una densidad reducida de AChR dentro de la membrana postsináptica es la causa inmediata del fracaso sináptica y la debilidad muscular. El tercer protocolo describe un método de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para evaluar los cambios en la proximidad de AChR adyacentes dentro de las membranas postsinápticas 14,15. Este método detecta la transferencia de energía entre AChR vecinos marcados con fluorescente-α-bungarotoxina (BGT). FRET se produce sólo cuando el donante y aceptor de sondas fluorescentes son de menos de 10 nm de distancia. Esto puede revelar cambios (submicroscópicas) en la estanqueidad de embalaje AChR que pueden relacionarse directamente a la amplitud de los potenciales sinápticos. Estos tres protocolos, refinados durante la última década, proporcionan medidas complementarias de integridad NMJ de una manera consistente y reproducible. El uso de protocolos estandarizados unaparámetros nd deben facilitar la comparación de los efectos de los genes y las intervenciones ambientales sobre los mamíferos NMJ.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocal de barrido</td><td>Leica</td><td>DM 2000 con&nbsp; Sistema TCS SP2</td><td>La mayoría de los microscopios confocales de barrido deberían ser adecuados.</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotoxina (rojo-BGT)</td>Life <td>technologies</td><td>B35451</td><td>Utilizado para el etiquetado de AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alpha;-bungarotoxina (far-red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>Fluorescencia de rojo lejano: apenas visible a través del ocular&nbsp;</td></tr><tr><td>conejo anti-sinaptofisina</td><td>Life technologies</td><td>18-0130</td><td>Los diferentes lotes de anticuerpos primarios difieren en la dilución de trabajo efectiva</td></tr><tr><td>FITC-anti-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>Anticuerpo monoclonal conjugado con FITC</td></tr><tr><td>FITC-burro anti-conejo IgG</td><td>Jackson</td><td>711-095-152</td> Los <td>anticuerpos secundarios policlonales pueden variar en calidad según la fuente y el lote</td></tr><tr><td>Compuesto de temperatura de corte óptima (O.T.C.)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>Matriz de inclusión de criostato para congelar músculos</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>Medio de montaje que ralentiza el fotoblanqueo de fluoróforos</td></tr></tbody></table>

la unión neuromuscular: medición synapse tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica uso confocal microscopía de fluorescencia

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La unión neuromuscular (UNM) es la sinapsis relé grande, colinérgica a través del cual las neuronas motoras de mamíferos controlan la contracción muscular voluntaria. Los cambios estructurales en la UNM pueden resultar en el fracaso de la neurotransmisión, resultando en debilidad, atrofia e incluso la muerte de la fibra muscular. Muchos estudios han investigado cómo las modificaciones genéticas o enfermedades pueden alterar la estructura de la UNM ratón. Desafortunadamente, puede ser difícil comparar directamente los resultados de estos estudios ya que a menudo emplean diferentes parámetros y métodos analíticos. Tres protocolos se describen aquí. El primero utiliza la proyección de intensidad máxima imágenes confocal para medir el área de receptor de acetilcolina (AChR) ricos en dominios de la membrana postsináptica en la placa terminal y el área de tinción de las vesículas sinápticas en la terminal nerviosa presináptica suprayacente. El segundo protocolo se comparan las intensidades relativas de inmunotinción para proteínas sinápticas en la membrana postsináptica. La tercera protocol utiliza la transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (FRET) para detectar cambios en el embalaje de AChR postsinápticos en la placa terminal. Los protocolos se han desarrollado y perfeccionado a lo largo de una serie de estudios. Los factores que influyen en la calidad y la consistencia de los resultados se discuten y datos normativos se proporcionan para NMJs en ratones adultos jóvenes sanos.

Medición de Synaptic Área en la UNM Cualquier estimación del área se basa en el dibujo de un límite para definir la extensión de especializaciones sinápticas. En los músculos adultos jóvenes sanos imágenes NMJ deben mostrar los límites bien definidos, tanto para AChR y tinción sinaptofisina (Figura 2 A y B). La intensidad de fluorescencia para ambos AChR y sinaptofisina aumenta de forma pronunciada en el límite entre la porción peri-sináptic...

La unión neuromuscular (NMJ) está alterada en una variedad de condiciones que a veces pueden culminar en una falla sináptica. Este informe describe los métodos basados en microscopios de fluorescencia para cuantificar dichos cambios estructurales.

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar objetivamente los parámetros sinápticos, incluido el tamaño de la sinapsis, la fragmentación y la densidad relativa de proteínas en la membrana postsináptica. Esto se logra diseccionando primero el músculo de interés de los animales de experimentación. A continuación, el músculo disecado se criosecciona y las secciones se tiñen inmunológicamente para microscopía de fluorescencia.A continuación, en phos, se muestrean objetivamente imágenes de las uniones neuromusculares de los diferentes grupos de tratamiento y se cuantifica la intensidad relativa de la tinción para las especializaciones sinápticas. En última instancia, las medidas cuantitativas reproducibles de los efectos de un tratamiento o modificación genética sobre la organización estructural de la unión neuromuscular se obtienen mediante microscopía confocal. Pues bien, este método proporciona protocolos objetivos estandarizados que utilizan microscopía confocal para evaluar los cambios en la estructura de la unión neuromuscular en modelos de ratón de trastornos como la miastenia gravis y la enfermedad de la neurona motora.Por lo general, las personas que intentan este método pueden tener dificultades porque el muestreo de NPLS en el microscopio confocal de una manera imparcial y objetiva requiere una planificación. Después del muestreo, el análisis de NPLS debe realizarse de manera coherente y reproducible, donde la variabilidad de un animal a otro entre los parámetros de la placa puede dificultarlo. Después de aislar la criosección y la tinción inmunofluorescente, las uniones neuromusculares de ratón o njs, de acuerdo con el protocolo de texto, ciegan los portaobjetos etiquetando cada uno con un número aleatorio que permanece conocido solo por un segundo investigador hasta después de que se complete la cuantificación de los parámetros NMJ. Coloque un portaobjetos en la platina del microscopio y use un conjunto de filtros trit C para verlo bajo iluminación de campo amplio.Muévase progresivamente a través de los campos de izquierda a derecha y hacia atrás hasta que aparezca una placa final en el campo con el orificio confocal configurado en 1.0 unidad aireada, y utilizando una potencia láser baja, optimice los niveles de ganancia y compensación para trit C red BGT en la placa final que se va a fotografiar. A continuación, utilizando el láser de 488 nanómetros, optimice el ajuste de la fluorescencia C, que representa la sinaptofisina, y luego recoja una pila Z de la placa final con un intervalo de 0,7 micras entre cada corte óptico. Guarde las imágenes con un nombre de archivo que incluya la fecha de la sesión de imágenes, el nombre en clave de la diapositiva y el número de la placa final.Repita el procedimiento de muestreo e imagen que se acaba de mostrar hasta que se recojan 20 placas finales del portaobjetos o la muestra. Y luego repita el proceso para las diapositivas codificadas restantes con la misma configuración confocal. Tome algunas imágenes de la corredera de control.Utilice el software gratuito de imagen J para abrir un Zack y en un canal fluorescente, prepare una imagen de proyección máxima. Guarde las proyecciones como archivos TIF con el nombre del archivo, incluida la fecha de la sesión de la imagen, el código de muestra, el número de placa final y el canal fluorescente. Ahora use la imagen J para abrir la proyección Z.Seleccione el receptor de acetilcolina o el canal de imagen A CHR y seleccione el tipo de imagen de ocho bits para convertir la imagen en color RGB de 24 bits en una imagen en escala de grises de ocho bits en la pantalla con la herramienta de polígono. En el canal de tinción BGT rojo, dibuje un contorno aproximado alrededor de la placa final de interés, excluyendo cualquier mancha que no se origine en la placa final de interés. Seleccione Umbral de ajuste de imagen para aplicar un umbral de intensidad mínima a la imagen.Ajuste el nivel de umbral para aislar las partes teñidas con A CHR y excluir la señal de fondo circundante como subumbral. A continuación, abra una segunda ventana con la imagen original a tono completo para compararla. Para confirmar la configuración del umbral con el contorno del polígono aún presente, seleccione analizar, analizar partículas en el menú emergente.Especifique el rango de tamaños en número de píxeles desde 50 hasta el infinito, lo que elimina la selección de pequeños artefactos que surgen del ruido eléctrico. En el multiplicador de fotos, haga clic en analizar partículas para generar una ventana con una lista de áreas discretas de supra umbral y sus valores de intensidad de fluorescencia numerados tal como aparecen en la imagen binaria. Copie estos datos en una hoja de cálculo etiquetada para medir el área total de la placa final.Dentro del polígono, seleccione Analizar, medir, copie y pegue los datos de las áreas e intensidades de A CHR en una hoja de cálculo con columnas etiquetadas. Cambie al canal de sinaptofisina. Prepare una imagen de proyección máxima.Seleccione un área de interés y establezca el umbral de intensidad mínimo como se acaba de demostrar. Para medir el área de superposición, aplique los siguientes pasos. Abra el archivo original que contiene las dos imágenes de canal y seleccione las pilas de imágenes.Apilar a imágenes para dividirlo en dos imágenes separadas. Utilizando el complemento de colocalización de imagen J, seleccione la colocalización del complemento e ingrese los valores de umbral registrados previamente para los canales A CHR y nervioso en el cuadro de consulta del canal correspondiente. El resultado es una imagen superpuesta en píxeles blancos.Convierta la imagen de superposición recién creada a un formato de escala de grises y aplique un umbral al valor máximo, que solo seleccionará los píxeles blancos correspondientes al área de superposición de los dos canales anteriores. Registre en la hoja de cálculo el valor del área resultante de la colocalización, que representa el área de superposición en píxeles, prepare una hoja de cálculo de datos. Las medias de muestra calculan y representan gráficamente las desviaciones estándar y los errores estándar en forma de histogramas o diagramas de dispersión.Traza y asigna áreas CHR como diagramas de dispersión o histogramas de frecuencia para determinar si los datos se distribuyen normalmente antes de las pruebas estadísticas. Después de preparar la tinción inmunofluorescente y la obtención de imágenes de las secciones de fibras musculares transversales como se describe en el protocolo de texto, abra un archivo de imagen original y, mientras visualiza el canal A CHR, seleccione las pilas de imágenes apiladas para dividir los canales, seleccione el tipo de imagen de ocho bits para convertir el formato de escala de grises de ocho bits a la pantalla. Haga esto para ambos canales de fluorescencia.Seleccionar pilas de imágenes para apilar y abrir una nueva pila a partir de dos imágenes de ocho bits previamente separadas, lo que permite cambiar entre los dos canales de fluorescencia dentro de una sola ventana con la herramienta Polígono. Traza una línea ajustada alrededor del límite de la tinción A CHR, selecciona analizar medida para medir la intensidad media de A CHR dentro del área cerrada. Copie este valor en una hoja de cálculo etiquetada conservando el contorno del polígono.Cambie al segundo canal de fluorescencia y seleccione analizar medición. Esto producirá la tinción promedio para la proteína de interés dentro del área sináptica definida por la tinción A CHR. Elija un área alejada de las manchas visibles de la placa terminal.A continuación, seleccione analizar medida para medir la intensidad media de la fluorescencia de fondo. Repita la medición para los otros canales de fluorescencia y copie los valores de fondo en la hoja de cálculo de valores de fluorescencia. Reste los valores de fondo promedio de los valores de la placa terminal para obtener las intensidades corregidas para A CHR y la proteína de interés en cada placa terminal.Finalmente, divida los valores de intensidad de nplate corregidos para la proteína de interés por la intensidad de fluorescencia BGT corregida para obtener las proporciones de intensidad de fluorescencia como se muestra aquí. La intensidad de fluorescencia tanto para A CHR como para la sinaptofisina aumenta bruscamente en el límite entre la porción sináptica y sináptica de PERS de la placa terminal del motor. Para tales imágenes, un umbral mínimo aislará fácilmente el área rica en A CHR o rica en sinaptofisina de la placa terminal.Como se demuestra en esta figura en ratones envejecidos y en algunos estados patológicos, la tinción de la placa terminal para la sinaptofisina puede ser menos intensa. Los bordes de un grupo de CHR pueden aparecer borrosos, y puede haber niveles más altos de autofluorescencia extra sináptica. Los diagramas de dispersión revelan un rango considerable en el área rica en CHR A entre las placas terminales del músculo tibial anterior de cualquier ratón individual. Sin embargo, el área promedio de A CHR basada en 15 a 20 imágenes de la placa terminal de la cara fue similar entre siete ratones de muestra. En las secciones transversales, la placa final achr generalmente aparece en forma de media luna, pero esta forma es a menudo irregular, como se ilustra aquí.La fluorescencia de fondo de baja intensidad, como se muestra aquí en el canal de sinaptofisina, generalmente revela si un parche de tinción A CHR representa una sola placa terminal o dos placas terminales separadas ubicadas en las fibras musculares adyacentes. Además, muchas proteínas sinápticas como el rapson, el almizcle y el beta distro glicano están colocalizadas con un CHR en la nplaca. Al intentar este procedimiento, es importante que los experimentadores permanezcan ciegos a los grupos de tratamiento y genotipo durante el muestreo y el análisis de las imágenes de nplate.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recopilar, muestrear y analizar imágenes fluorescentes confocales de las uniones neuromusculares. En última instancia, los investigadores deberían ser capaces de comparar de forma coherente y objetiva diferentes parámetros estructurales de la placa entre diferentes grupos de tratamiento y genotipos.

the-neuromuscular-junction-measuring-synapse-size-fragmentation

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

La abundancia de receptores de neurotransmisores en las sinapsis agrupadas influye fuertemente en la fuerza sináptica. Este método cuantifica marcadas con fluorescencia receptores de neurotransmisores en tres dimensiones con una sola sinapsis resolución...

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em&gt; C. elegans</em

La unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) se utiliza como modelo para estudiar la morfología y función de las sinapsis. Este video describe características importantes que los investigadores cuantifican para caracterizar el NMJ. El protocolo de ejemplo muestra un software capaz de realizar la cuantificación automáticamente.

Drosophila Cuantificación de la unión neuromuscular (NMJ): un método para evaluar la morfología y la función sináptica

Fuente: Marinello, M., et al. Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía confocal y de superresolución combinada. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra la preparación, inmunotinción e imágenes de uniones neuromusculares en tejido muscular de rata utilizando microscopía confocal y de superresolución para visualizar y analizar estructuras presinápticas y postsinápticas.

Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía confocal y de superresolución combinada

Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

Este protocolo muestra cómo emplear la microscopía de superresorción para estudiar la co-localización de proteínas en cultivos neuronales primarios.

Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

La capacidad de detectar con precisión los componentes de la unión neuromuscular es crucial en la evaluación de modificaciones en su arquitectura debido a procesos patológicos o de desarrollo. Aquí presentamos una descripción completa de un método sencillo para obtener imágenes de alta calidad de uniones neuromusculares de montaje completo que se pueden utilizar para realizar mediciones cuantitativas.

Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Este protocolo describe un método para el análisis morfométrico de uniones neuromusculares mediante microscopía combinada confocal y STED que se utiliza para cuantificar cambios patológicos en modelos de ratón de SMA y CMS relacionados con ColQ.

Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía combinada confocal y de superresolución

DetectSyn es un ensayo fluorescente rápido e imparcial que mide los cambios en el número relativo de sinapsis (compromiso pre y postsináptico) en todos los tratamientos o estados de enfermedad. Esta técnica utiliza una técnica de ligadura de proximidad que se puede utilizar tanto en neuronas cultivadas como en tejido fijo.

DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

El protocolo describe el método de carga de un tinte de calcio fluorescente a través del nervio cortado en las terminales nerviosas motoras del ratón. Además, se presenta un método único para registrar transitorios rápidos de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas mediante microscopía confocal.

Registro de transitorios de calcio en unión neuromuscular de ratón con alta resolución temporal mediante microscopía confocal

Aprende a cuantificar parámetros sinápticos en la unión neuromuscular mediante microscopía confocal de fluorescencia. Este método permite evaluar cambios estructurales en modelos de enfermedades neuromusculares.

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

Explorar más videos