Name: Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a evaluar los efectos de la terapia con luz roja e infrarroja cercana sobre el estrés oxidativo en células cultivadas in vitro. Este método permite manipular longitudes de onda e intensidades con precisión.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de Neurotrauma (Australia Occidental). Este proyecto se financia a través de la Cuenta Fiduciaria de Trauma en Carretera, pero no refleja las opiniones ni recomendaciones del Consejo de Seguridad Vial.

1. Calibración óptica: Medición de luz de salida <ol><li> Para preparar el aparato de suministro de luz, conectar una fuente de luz de banda ancha (por ejemplo, xenón o lámpara de tungsteno) a una fuente de alimentación adecuada. Colocar una lente de colimación en frente de la fuente de luz para producir un haz de luz colimado. Pasar la luz a través de un filtro de calor líquido para eliminar la mayor parte del calor del haz de luz. Dependiendo de la aplicación, enfocar el haz colimado a la abertura de entrada de una guía de luz líquida, que proporciona para la entrega más flexible de la luz (por ejemplo., En una incubadora). </li><li> En el otro extremo de la guía de luz líquida, posicionar una segunda lente de colimación y, a continuación un soporte para la interferencia y filtros de densidad neutra. Compruebe que esta disposición produce una mancha uniformemente iluminada de luz de la banda de frecuencia y la intensidad deseada. Nota: La distancia entre el extremo de la guía de luz y el plano de la muestra puede tener que variar dependiendoel área que debe ser iluminada, pero recuerda que como la distancia desde el extremo de la guía de luz aumenta, intensidad de la luz disminuye. En el presente estudio, esta distancia es de 14cm y produce una sección transversal del haz que ilumina uniformemente un área bien 3x3 en una placa de 96 pocillos. </li><li> Asegúrese de que la luz difusa de la lámpara y los componentes ópticos asociados no puede llegar a la muestra. </li><li> Encienda la fuente de agua para el filtro de calor líquido y asegurar que existe intercambio de agua a través del filtro de la chaqueta. Encienda la fuente de energía de la lámpara y espere por lo menos 5 minutos para la fuente de luz de banda ancha a estabilizarse. Nota: Se requiere el uso del enfriador de agua para evitar el sobrecalentamiento del dispositivo. </li><li> Seleccionar un filtro de interferencia de banda estrecha (por lo general descrito por su longitud de onda central, la transmitancia de pico y anchura total a la mitad del máximo (FWHM) de ancho de banda) para generar la banda de frecuencias deseada de la iluminación. Nota: Los filtros de interferencia de banda estrecha utilizadas en el estudio fueron 442 nm, 550 nm, 671 nm y 810 nm. </li><li> Medir la luz producida por la lámpara en el plano en que el espécimen se va a colocar durante el tratamiento. Medir la luz utilizando una sonda calibrada irradiancia (colector coseno) conectado a un espectrorradiómetro adecuado, el uso de software de propiedad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Utilice filtros de densidad neutra para ajustar la intensidad de la luz hasta que se obtiene la salida deseada. Nota: En el presente estudio, la intensidad de luz que pasa por cada filtro de interferencia se ajusta para dar una salida quantal igual en cada una de las cuatro bandas de frecuencia de tratamiento. Es importante comprobar la calibración con regularidad, como la salida de la lámpara está sujeta a cambios. Nota: Tras la puesta en marcha del aparato, las células están listas para ser iluminada Figura 1 es una representación del aparato de suministro de luz utilizada en el estudio actual.. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52221/52221fig1.jpg" files ftp_upload> Figura 1. Imagen del aparato de suministro de luz. Illustrated son la fuente de energía de luz, lámpara de xenón con la vivienda, la lente de colimación, filtro de agua, la abertura de entrada, guía de luz líquida, segunda lente de colimación, soporte de filtro, marco de tratamiento y mate tarjeta de negro. Tenga en cuenta que los filtros de longitud de onda e intensidad de banda estrecha no se muestran. 2. Preparación de la célula <ol><li> El método de entrega / NIR-LT R descrito puede ser aplicado a cualquier tipo de célula o en el sistema de modelo in vitro; como tal, las siguientes descripciones de cultivo celular son generales, usando técnicas bien establecidas para la cultura feocromocitoma (PC12), Müller (RMC1) y células de la retina mixtos primarios. </li><li> Antes de la siembra de células para el tratamiento de la luz y el ensayo de estrés oxidativo, la cultura células en sus respectivos medios de cultivo que contiene suplementos apropiados (por ejemplo., FBS, antibióticos) en flas T75 inmortalizóks hasta 70-80% de confluencia. </li><li> Separar las células inmortalizadas de los matraces T75, usando el método apropiado para el tipo de célula para ser probado por ejemplo., Tripsina. Si es necesario, antes de proceder con la siembra de células en placas de 96 pocillos de ensayo, pocillos de placas de ensayo de capa con 10μg / ml de poli-L-lisina durante 1 h (por ejemplo., Para las células PC12) o 10μg / ml de poli-L-lisina para 1H seguido de un / O N incubación con 10μg / ml de laminina (por ejemplo., por células de la retina mixtos). </li><li> Centrifugar las células a recoger en su caso (por ejemplo., A 3 minutos a 405 xg para las células PC12 o 10 min a 218 xg durante células RMC1), eliminar el sobrenadante y resuspender en 8 ml de medio de cultivo celular apropiado. </li><li> Si las células de la retina son mezclados para ser utilizado, preparar a partir de crías de rata neonatal P0-5 por digestión enzimática (papaína) de acuerdo con procedimientos establecidos 19 </li><li> Contar el número de células viables con exclusión de 0,4% (w / v) de colorante azul de tripano, usando un hemocitómetro. </li><li> Ajuste suc densidad celularh que las células serán de aproximadamente 70-80% de confluencia después de 24 o 48 horas en cultivo. (Para las células PC12 de la densidad de siembra es de 4,0 x 10 5 células viables / ml, para las células RMC1, es 2,5 x 10 5 células viables / ml y para células de la retina mixtos es 8 x 10 5 células viables / ml). Después de añadir las células ya sea a placas de 96 pocillos claros o negros (utilizados para el H 2 O 2 o ensayo DCFH-DA, respectivamente), en 100 l de medio de cultivo adecuado, permiten placa para sentarse en una superficie plana a 37 ° C, 5 % de CO 2 (o lo que las condiciones son apropiadas para el tipo específico de célula) durante al menos 24 horas para permitir la adherencia celular. </li><li> Cultivar las células en medio de crecimiento en las 96 bandejas así apropiadas hasta que son 70-80% de confluencia (24h para PC12 y las células RMC1, 48h para las células de la retina mixtos). </li></ol> 3. La adición de glutamato Stressor a células <ol><li> Preparar monosódico ácido concentraciones estresantes hidrato de sal de L-glutámico de 0-10mm en cultivo completo apropiadomedios de cultivo XX. </li><li> Retire el medio de las células y lavar suavemente las células 3 veces con PBS (PC12) o HBSS (RMC1 y células de la retina mixtos). Después de lavados, añadir medios que contienen glutamato a un volumen total de 100 l / pocillo. </li></ol> 4. Primera Dosis de Tratamiento Luz <ol><li> Inmediatamente después de la adición de glutamato o el factor estresante de elección, exponer las células a tratamiento con luz en las longitudes de onda e intensidades deseadas colocando bajo el aparato de suministro de luz preparada. Asegúrese de alterar la salida quantal del haz de luz usando las combinaciones establecidas de filtros de densidad neutra en función de la longitud de onda que se administra. Nota: En los experimentos actuales, exponer las células para el tratamiento de luz durante 3 min mantener la temperatura en reposo las placas de 96 pocillos en una almohadilla de calor C 37 °. El tiempo de tratamiento puede variar según se requiera. <ol><li> Coloque una tarjeta mate negro debajo de las células para evitar que la luz refleja en los pozos adyacentes en el 96-well bandeja designado para otros parámetros de tratamiento. </li></ol></li><li> Si se desea un tratamiento para longitudes más largos de tiempo, añadir tampón Hepes 25 mM para mantener el pH del medio de cultivo celular o, idealmente, colocar las placas de aparatos y de tratamiento dentro de una incubadora con CO 2 concentración regulada a 5% de CO 2, o condiciones que son óptimas para el tipo específico de célula. </li><li> Tras la finalización del tratamiento con luz, colocar las células en una superficie plana y se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 (o lo que las condiciones son óptimas para el tipo de célula) durante 24 horas. Nota: las dosis adicionales de R / NIR-LT se pueden administrar como se ha descrito anteriormente, según se desee. </li></ol> 5. Final de la dosis de tratamiento con luz y detección de ROS <ol><li> Antes de realizar la ronda final del tratamiento de la luz, se preparan los reactivos que se utilizan para la detección de ROS. Prepare el buffer de 50 mM de citrato (pH 6,0), Triton X100, y H 2 O 2 reactivo de detección de trabajosolución (1: 2: 97 proporción de 10 mM H 2 O 2 de detección de solución de reactivo de valores; 10 U / ml de peroxidasa de rábano; citrato de sodio 50 mM (pH 6,0)). Preparar DCFH-DA a una concentración final de 100μM en el medio adecuado. Nota: DCFH-DA reactivo para las células PC12 se encuentra en medio RPMI, DCFH-DA reactivo para células RMC1 está en medio DMEM. Tenga en cuenta que los reactivos de detección disponibles en el mercado tienen sensibilidades diferenciales a lo específico ROS y los reactivos deben ser elegidos cuidadosamente para proporcionar la información deseada para una aplicación individual. </li><li> Administrar tratamiento con luz a las células, como se describe en el paso 4.1-4.1.2. Asegurarse de que las células están siendo tratados con los deseados influencias / longitudes de onda de la luz. </li><li> Inmediatamente después de tratamiento con luz, retire los medios que contienen glutamato y lavar dos veces con solución tampón apropiado (para las células PC12, PBS y se utiliza para las células RMC1, se utiliza HBSS). Realizar los ensayos de ROS en las células como sigue: <ol><li> H 2 O 2 CO2 durante 15 min. Añadir 50 l de H 2 O 2 solución de trabajo de detección y se incuba durante 30 min a TA. Medir la fluorescencia usando un lector de placa con una longitud de onda de excitación de 530 nm y una longitud de onda de emisión de 480 nm. </li><li> Ensayo de DCF: añadir 100 l de la solución de DCFH-DA a cada uno de los pocillos 100 mM y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2. Retire el medio que contiene 100 mM DCFH-DA y lavar con solución de tampón apropiado (como se describió anteriormente) dos veces. Añadir 90 l de solución tampón y 10 l Triton X100 a cada uno de los pocillos y agitar suavemente en un agitador orbital durante 30 segundos antes de 15 min de incubación a 37 ° C. Mida DCF fluorescencia derivada usando un lector de placas con una longitud de onda de excitación de 480 nm y una emisión wavelength de 530 nm. </li><li> Expreso ROS valora con respecto a la concentración de proteína de las células restantes en los pocillos, utilizando un kit colorimétrico para cuantificar la concentración de proteína de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con referencia a una curva estándar para calcular mg de proteína. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Hemos adaptado con éxito un sistema de suministro de luz precisa y calibrado para proporcionar un mecanismo para el estudio de optimización de R / NIR-LT in vitro. Longitud de onda y la intensidad de los parámetros de R / NIR-LT son capaces de ser manipulado con precisión y eficacia el uso de este sistema. Hemos establecido que el tratamiento de luz de las células no dio lugar a la muerte celular, aunque ROS no se reduce a las longitudes de onda y las dosis entregadas, de los tipos celulares de la prueba. Las i...

Se requieren especies reactivas de oxígeno (ROS) para una serie de vías de transducción de señales y reacciones normales del metabolismo celular, incluidos los de neuroprotección 1. Sin embargo, cuando el mecanismo antioxidante endógeno no son capaces de controlar la producción de ROS, las células pueden sucumbir a estrés oxidativo 2,3. Después de una lesión en el SNC, se cree que los aumentos asociados en la presencia de ROS y el estrés oxidativo a desempeñar un papel importante en la progresión del daño 4,5. A pesar de la extensa serie de estrategias para atenuar el estrés oxidativo que se han evaluado, actualmente no existen estrategias de anti-oxidantes completamente eficaces, clínicamente relevantes para la atenuación de la producción de ROS y el estrés oxidativo asociado en uso clínico siguiente neurotrauma 6. Por lo tanto la atenuación del estrés oxidativo sigue siendo un objetivo importante para la intervención terapéutica 7. Mejoras siguening R / NIR-LT se han reportado en una amplia gama de lesiones y enfermedades, incluyendo reducciones en el tamaño del infarto de miocardio, las complicaciones renales y hepáticas durante diabetes, degeneración de la retina, la lesión del SNC y accidente cerebrovascular 8, quizás al reducir el estrés oxidativo. Con especial atención a la lesión del SNC, los estudios preclínicos de eficacia de la luz 670 nm han demostrado buenos efectos en los modelos de degeneración retiniana 9-11, lesión de la médula espinal 12, la muerte neuronal 13. Se han llevado a cabo ensayos clínicos para la edad seco degeneración macular relacionada y están actualmente en curso para el accidente cerebrovascular 14, sin embargo los resultados de estos ensayos no parecen prometedores, quizás debido a la imposibilidad de emplear un tratamiento efectivo parámetros 15. Como tal, R / NIR-LT no ha sido ampliamente adoptado como parte de la práctica clínica normal en neurotrauma, a pesar de ser una fácil de administrar, no invasiva y tratamiento relativamente barato. Las barreras a la traducción clínica incluyen la falta de un cltemprano entendido mecanismo de acción y la ausencia de un protocolo de tratamiento efectivo 16,17 estandarizado. La literatura actual con respecto a la terapia de luz revela una gran cantidad de variación en los parámetros de tratamiento con respecto a las fuentes de irradiación (LED o láser), longitud de onda (por ejemplo, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), la dosis total (julios de irradiación / unidad de superficie), la duración (tiempo de exposición), el tiempo (insulto previo o posterior), la frecuencia del tratamiento y el tipo de parto (pulso o continua) 8. La variabilidad en los parámetros de tratamiento entre los estudios dificulta la comparación y ha contribuido al escepticismo respecto a la eficacia 16. Por lo tanto, la optimización de R / NIR-LT está claramente necesario, con los sistemas de cultivo de células capaces de proporcionar el mecanismo de selección de alto rendimiento necesario comparar las múltiples variables. Sin embargo, hay pocos sistemas de iluminación disponibles en el mercado que pueden proporcionar la flexibilidad y el control suficiente sobre wavelength e intensidad para realizar este tipo de experimentos de optimización. Comercialmente dispositivos LED disponibles son generalmente no capaz de entregar múltiples longitudes de onda o intensidades, resultando en investigadores que emplean múltiples dispositivos LED de diferentes fabricantes, que pueden variar no sólo en la intensidad, sino también el espectro de longitud de onda de la luz emitida. Hemos abordado este problema mediante el empleo de una banda ancha de xenón fuente de luz filtrada a través de filtros de interferencia de banda estrecha, generando de ese modo una gama de longitudes de onda y fluencias de luz, lo que permite un estrecho control y precisa de los parámetros de R / NIR-LT. Es importante señalar que la dosis terapéutica de tratamiento se define por el número de fotones que interactúan con el photoacceptor (cromóforo), que, en el caso de R / NIR-LT se postula que el citocromo c oxidasa (COX) 18. La energía fotónica entregado varía con la longitud de onda; es decir, dosis iguales de energía a diferentes longitudes de onda será compreciada de diferentes números de fotones. Por lo tanto, la luz emitida desde el dispositivo fue calibrado para emitir un número igual de fotones para cada una de las longitudes de onda elegidas para ser probado. Hemos desarrollado un sistema que puede ser utilizado para entregar R / NIR-LT en un rango de longitudes de onda e intensidades a las células in vitro y ha demostrado la capacidad de medir los efectos de la entrega R / NIR-LT sobre la producción de ROS en células sometidas a estrés glutamato.

<table><tbody><tr><td>Kit de ensayo de ROS intracelular OxiSelect (fluorescencia verde)</td><td>Cell Biolabs</td><td>STA-342</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed Reactivo</td><td>Sondas moleculares</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de arco de xenón de 300 vatios</td><td>Newport Corporation</td><td>6258</td><td>Fuente de luz muy intensa, no mire directamente a la lámpara. Asegúrese de que haya suficiente enfriamiento para la lámpara mientras está encendida</td></tr><tr><td>USB4000-FL Espectrómetro de fluorescencia</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-3-UV Corrector de coseno para la recolección de emisiones</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200&mu; Fibra óptica de cuarzo de diámetro m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Plataforma de espectroscopía Ocean</td><td>Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2300 EnSpire Lector de placas multimodo</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Toxicidad aguda, use guantes cuando manipule.</td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico hidrato de sal monosódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>142-47-2 (anhidro)</td><td></td></tr><tr><td>Feocromocitoma Células de médula suprarrenal de rata (PC12)</td><td>Colección de cultivos tipo americano</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Medios de comunicación</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen estadounidense</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Cálido hasta 37 &deg; C en baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Suero de caballo, origen neozelandés</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Cálido a 37 &deg; C en baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Caliente hasta 37 &deg; C en baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>100 mM Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Caliente a 37 &deg; C en baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Caliente a 37 &deg; C en baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar 100X MEM Solución de aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Tibia a 37 & grados; C en baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Células Retinal Muller (rMC1)</td><td>Universidad de California, San Diego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Cálido a 37 &deg; C en baño maría antes de usar</td></tr><tr><td>75 cm2 Frascos</td><td>BD Biosciences</td><td>B4-BE-353136</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>Alícuota y almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-134</td><td>Tibia hasta 37 &deg; C en baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td>Caliente a 37 & grados; C en baño maría antes de usar</td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein, Natural</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Aliquot y almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>1X Medio Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Cálido a 37 &deg; C en baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripán, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>165U Papain</td><td>Worthington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Corning Placas de 96 pocillos, fondo transparente, negro</td><td>Corning</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Costar Poliestireno transparente Placas de 96 pocillos sin tratar; Forma del pozo: Redondo; Estéril.</td><td>Costar</td><td>07-200-103</td><td></td></tr><tr><td>Balancín Balancín</td><td>Centrífuga</td><td></td><td></td></tr> Equipo <tr><td></td><td>de laboratorio</td><td></td><td></td>estándar</tr><tr><td>Papel de filtro de densidad neutra (0.3)</td><td>THORLABS Filtro de paso de banda de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>442 nm</td><td>THORLABS</td><td>FL441.6-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de 550 nm</td><td>THORLABS</td><td>FB550-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de 670 nm</td><td>THORLABS</td><td>FB670-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de 810 nm</td><td>THORLABS</td><td>FB810-10e</td><td></td></tr><tr><td>Desmontado y Oslash; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,1)</td><td>THORLABS</td><td>NE01B</td><td></td></tr><tr><td>desmontados y oslash; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,2)</td><td>THORLABS</td><td>NE02B</td><td></td></tr><tr><td>desmontados y oblicuos; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,3)</td><td>THORLABS</td><td>NE03B</td><td></td></tr><tr><td>desmontados y oslash; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,5)</td><td>THORLABS</td><td>NE05B</td><td></td></tr><tr><td>desmontados y oslash; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,6)</td><td>THORLABS</td><td>NE06B</td><td></td></tr><tr><td>desmontados y oslash; Filtros Absortivos de Densidad Neutra de 25 mm (1.0)</td><td>THORLABS</td><td>NE10B</td><td></td></tr></tbody></table>

método para la evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / terapia de luz del infrarrojo cercano red sobre el estrés oxidativo in vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

/ Terapia Red de infrarrojo cercano luz (R / NIR-LT), entregado por láser o diodo emisor de luz (LED), mejora los resultados funcionales y morfológicos en una gama de lesiones del sistema nervioso central in vivo, posiblemente mediante la reducción del estrés oxidativo. Sin embargo, se han mostrado efectos de R / NIR-LT sobre el estrés oxidativo a variar dependiendo de la longitud de onda o la intensidad de la irradiación. Los estudios que compararon los parámetros de tratamiento se carece, debido a la ausencia de dispositivos disponibles en el mercado que ofrecen múltiples longitudes de onda o intensidades, apto para alta rendimiento de procesamiento en los estudios de optimización vitro. Este protocolo describe una técnica para la entrega de la luz en una gama de longitudes de onda e intensidades para optimizar las dosis terapéuticas requeridas para un modelo de lesión dado. La hipótesis de que un método de entrega de la luz, en el que los parámetros de longitud de onda e intensidad podría modificarse fácilmente, podría facilitar la determinación de una dosis óptima de R / NIR-LT para la reducción de especies reactivas de oxígeno(ROS) in vitro. Luz no coherente Xenon se filtró a través de filtros de interferencia de banda estrecha para proporcionar longitudes de onda diferentes (longitudes de onda centrales de 440, 550, 670 y 810 nm) y flujos de energía (8,5 x 10 -3 a 3,8 x 10 -1 J / cm 2) de la luz a las células cultivadas. La salida de luz del aparato se calibró para emitir dosis cuantales terapéuticamente relevantes, iguales de luz en cada longitud de onda. Se detectaron especies reactivas en glutamato destacó las células tratadas con la luz, utilizando DCFH-DA y H 2 O 2 tintes fluorescentes sensibles. Nos éxito librados luz en una gama de longitudes de onda fisiológica y terapéuticamente e intensidades pertinentes, a las células cultivadas expuestas a glutamato como un modelo de lesión del SNC. Mientras que las fluencias de R / NIR-LT utilizados en el estudio actual no ejercer un efecto sobre ROS generado por las células cultivadas, el método de suministro de luz es aplicable a otros Systems incluyendo mitocondrias o más fisiológicamente modelos de cultivo rebanada organotípicos pertinentes aislado, y podría utilizarse para evaluar los efectos sobre una serie de medidas de resultado del metabolismo oxidativo.

La salida de la luz entregada a una longitud de onda de 670 nm fue calibrado usando filtros de densidad neutra con el fin de irradiar las células con una gama de fluencias que abarcan una dosis de luz de 670 nm previamente demostrado ser beneficioso en vivo (0,3 J / cm 2) 20. Como el número de filtros de densidad neutra en frente de la fuente de luz aumenta, la intensidad (W / m 2) disminuyó, lo que permite menos luz para pasar a la zona objetivo. La Tabla 1 presenta los datos de calibraci...

La luz de xenón no coherente se hizo pasar a través de filtros de interferencia de banda estrecha y densidad neutra para entregar luz de longitud de onda e intensidad variables a las células cultivadas. Este protocolo se utilizó para evaluar los efectos de la terapia con luz roja/infrarrojo cercano sobre la producción de especies reactivas in vitro: no se observaron efectos utilizando los parámetros probados.

Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

El objetivo general del siguiente procedimiento es evaluar los efectos de una gama de longitudes de onda e intensidades de la terapia con luz roja infrarroja cercana sobre el estrés oxidativo in vitro. Para ello, hemos desarrollado un método novedoso de entrega de luz en el que podemos manipular la longitud de onda y la intensidad emitidas. Montamos una fuente de luz de xenón o banda ancha en una carcasa sobre una base de metal, luego colocamos una lente de recubrimiento, un filtro de agua y una apertura de entrada frente a la luz.El siguiente paso del procedimiento es guiar la luz generada por la fuente de luz de banda ancha a través de la guía, la apertura y la luz líquida de entrada y a través de una segunda lente de recubrimiento. A continuación, se colocan filtros de ancho de banda y densidad neutra para obtener la longitud de onda y la intensidad de la luz deseadas. Tenga en cuenta que los filtros permiten el paso de un rango estrecho de longitudes de onda denominado banda de onda.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes de administración de terapia de luz roja infrarroja cercana, como los LED o los láseres, es que permite una manipulación precisa y calibrada de los parámetros de longitud de onda e intensidad. Esto nos permite optimizar la entrega de luz para obtener los mejores resultados biológicos que el estudio actual administra a las células disociadas. Además, también se puede aplicar a otros sistemas como los organotípicos, modelos de neurotrauma.Cuando trabaje con cualquier fuente de luz de banda ancha brillante, asegúrese de no mirar directamente a la fuente de luz, ya que puede provocar daños visuales permanentes. Para preparar el aparato de suministro de luz, conecte una fuente de luz de banda ancha, como una lámpara de xenón o tungsteno, a una fuente de alimentación adecuada. Coloque una lente de intercalación frente a la fuente de luz para producir un haz de luz intercalado.Haga pasar la luz a través de un filtro de calor líquido para eliminar la mayor parte del calor del haz de luz. Coloque una lente de intercalación frente a la fuente de luz para producir un haz de luz intercalado. Haga pasar la luz a través de un filtro de calor líquido para eliminar la mayor parte del calor del haz de luz.Dependiendo de la aplicación, enfoque el haz intercalado en la estructura de entrada de una guía de luz líquida para proporcionar una entrega más flexible de la luz. En el otro extremo de la guía de luz líquida, coloque una segunda lente de recubrimiento y luego un soporte para los filtros de interferencia y densidad neutra. Esta disposición debe producir un punto de luz iluminado uniformemente de la banda de onda e intensidad deseadas.Es posible que la distancia entre el extremo de la guía de luz y el plano de la muestra deba variar según el área que se deba iluminar. Es importante recordar que, de acuerdo con la ley del cuadrado inverso, a medida que aumenta la distancia desde el extremo de la guía de luz, la intensidad de la luz disminuirá en el presente estudio. Esta distancia es de 14 centímetros, lo que da como resultado la producción de una sección transversal de haz que ilumina uniformemente un área de tres por tres pocillos en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos.Asegúrese de que la luz parásita de la lámpara y los componentes ópticos asociados no pueda llegar a otros especímenes, por ejemplo, utilizando cartón negro. Una vez que el dispositivo esté construido, encienda el enfriador de agua para el filtro de calor líquido y asegúrese de que haya un intercambio de agua a través de la camisa del filtro. Encienda la fuente de alimentación de la lámpara y espere al menos cinco minutos para que la fuente de luz de banda ancha.Para estabilizar, seleccione un filtro de interferencia de banda estrecha para generar la banda de onda de iluminación deseada. Mida la luz producida por la lámpara en el plano donde se colocará la muestra. Durante el tratamiento.La luz se mide utilizando una sonda de irradiancia calibrada conectada a un espectro adecuado. Radiómetro. Utilice filtros de densidad neutra para ajustar la intensidad de la luz hasta obtener la salida deseada. En el presente estudio, la intensidad de la luz que pasa por cada filtro de interferencia se ajusta para dar una salida cualitativa igual en cada una de las cuatro bandas de onda de tratamiento.El método de administración de terapia de luz roja infrarroja cercana descrito se puede aplicar a cualquier tipo de célula o sistema modelo in vitro. Aquí mostramos nuestra técnica de entrega de luz a las células utilizando feocromocitoma o células PC 12. Por ejemplo, células de cultivo en medios de crecimiento.En 96, las bandejas de pocillos recubiertas con poliol lisina hasta que tienen un 70 a 80% de confluente. Prepare la concentración deseada de glutamato o estresor alternativo en medios de cultivo de crecimiento completo. Aquí usamos glutamato de 10 milimolares.Retire el medio de las células y lávelas suavemente tres veces con solución salina tampón de fosfato. Después del lavado, agregue medios que contengan glutamato hasta un volumen total de cien microlitros por pocillo. Inmediatamente después de la adición de glutamato o el factor estresante de elección, exponga las células a un tratamiento de luz a las longitudes de onda e intensidades deseadas colocando la placa de cultivo debajo del aparato de suministro de luz preparado.Asegúrese de modificar la salida cualitativa del haz de luz utilizando las combinaciones establecidas de filtros de densidad neutra. Dependiendo de la longitud de onda que se administre. Una vez finalizado el tratamiento de luz, coloque las células en una superficie nivelada e incube a 37 grados centígrados en condiciones reguladas por dióxido de carbono durante 24 horas.También se pueden administrar dosis adicionales de terapia de luz roja infrarroja cercana. Antes de realizar la ronda final de tratamiento con luz, prepare los reactivos que se utilizarán para la detección de especies reactivas de oxígeno como indicador de estrés oxidativo. Aquí utilizamos dietas indicadas que emiten fluorescencia cuando reaccionan con una variedad de especies reactivas, incluida la dilución, el acetato de fluoresceína D, administramos un tratamiento de luz a las células como se describe en el paso cuatro, nos aseguramos de que las células estén siendo tratadas con las gripes y las longitudes de onda de luz deseadas.Inmediatamente después del tratamiento con luz, retire el medio que contiene glutamato y lávese dos veces con PBS. Proceda con los ensayos utilizando tintes indicadores que emiten fluorescencia cuando reaccionan con especies reactivas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mida la fluorescencia generada por los tintes indicadores utilizando un lector de placas ajustado a los ajustes de excitación y emisión adecuados.Utilice el color del kit métrico para cuantificar la concentración de proteínas en los pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Exprima las salidas de fluorescencia en relación con la concentración de proteínas de cada pocillo individual y, a continuación, analice los resultados mediante software estadístico. El desarrollo de esta técnica allana el camino para los investigadores que investigan los efectos de múltiples longitudes de onda e intensidades de la terapia de luz roja del infrarrojo cercano sobre el estrés oxidativo.Esta técnica se puede utilizar en una variedad de sistemas modelo, incluidas células disociadas o cultivos organotípicos.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe la técnica de visualización del estrés oxidativo en organoides cultivados. Este trabajo ayuda a comprender el nivel de estrés oxidativo debido a la acumulación de ROS en los distintos tipos celulares presentes en un organoide después del tratamiento con diferentes moduladores de ROS.

Ensayo de imágenes con sonda fluorescente: una técnica para visualizar el estrés oxidativo en las células organoides intestinales cultivadas tratadas con inductor de especies reactivas de oxígeno

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Un ensayo de placa puntual para evaluar las respuestas al estrés oxidativo en cepas bacterianas

Presentamos un enfoque espectroscópico óptico difuso (DOS) que proporciona biomarcadores ópticos cuantitativos de la respuesta de la piel a la radiación. Describimos el diseño de la instrumentación del DOS, los parámetros ópticos, los algoritmos de extracción y los procedimientos de manejo de animales necesarios para obtener datos representativos de un modelo preclínico de eritema inducido por radiación en ratones.

Espectroscopia óptica difusa para la evaluación cuantitativa de la radiación ionizante aguda La toxicidad cutánea inducida utilizando un modelo de ratón

Este manuscrito describe el uso de reporteros fluorógenos genéticamente codificados en una aplicación de imágenes de células vivas para el examen de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Este enfoque experimental ofrece inigualable resolución espaciotemporal, la sensibilidad y especificidad evitando muchas de las deficiencias de los métodos convencionales usados para la detección de estrés oxidativo toxicológica.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.

En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo

Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.

Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.

Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

La cuantificación de las formas oxidadas y reducidas de glutatión (GSSG y GSH, respectivamente) se ha logrado mediante el uso de ortoftalaldehído (OPA). El OPA se vuelve altamente fluorescente una vez que se conjuga con GSH, pero no puede conjugar el GSSG hasta que se reduce. Aquí, describimos un ensayo multiparamétrico para cuantificar ambos utilizando la cuantificación de proteínas para la normalización.

Cuantificación rápida de formas oxidadas y reducidas de glutatión utilizando orto-ftalaldehído en células de mamífero cultivadas in vitro

Aprende a evaluar los efectos de la terapia con luz roja e infrarroja cercana sobre el estrés oxidativo en células cultivadas in vitro. Este método permite manipular longitudes de onda e intensidades con precisión.

Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo In Vitro (Video) | JoVE Journal

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