Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

El objetivo general de este proceso es cultivar un gran número de células en condiciones controladas de nutrientes. Utilizando equipos convencionales que se encuentran en un laboratorio de cultivo celular. Los algoritmos asociados permiten el control y la manipulación de nutrientes dentro de rangos experimentales.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave para aplicaciones de cultivo celular a gran escala. Como las terapias celulares humanas. La principal ventaja de esta técnica es que permite el cultivo de células a gran escala con una distribución uniforme de nutrientes y gases.

Esto permite densidades celulares más altas que los cultivos celulares estáticos o alimentados a granel, aumenta el rendimiento y reduce la pérdida de células. Esto se puede hacer con equipos que se encuentran comúnmente en la mayoría de los laboratorios de cultivo celular. La demostración visual de este método puede ser útil para los nuevos investigadores, ya que estas técnicas utilizadas pueden ser difíciles de dominar, debido a la gran cantidad de pasos que deben realizarse en un orden específico en condiciones estériles.

Reúna los cinco componentes principales necesarios para el sistema de alimentación. Un depósito mediano, una bomba peristáltica, un biorreactor agitado, un depósito de residuos y un conjunto de muestreo de tuberías diseñado a medida. Establezca el depósito medio con una botella de vidrio de un litro.

El depósito de residuos mediante una botella de vidrio de dos litros. El biorreactor agitado utiliza un reactor de vidrio de 250 ml de volumen. Utilice una bomba peristáltica digital o una bomba similar con un cabezal de bomba de ocho canales para controlar el intercambio de medios.

Ensamble el depósito y las tapas del biorreactor modificado de plástico duro y esterilizable en autoclave. Con puertos de paso de tubería de acero inoxidable para proporcionar ventilación a través de filtros estériles y permitir la transferencia de medios entre depósitos y biorreactores. Conecte un tubo de salida fabricado a partir de tubos de aireación de vidrio poroso a la tapa del biorreactor de suspensión agitada modificada.

Ensamble juegos de tubos de perfusión esterilizables en autoclave a partir de conectores de tubos de fluoruro de polivinilideno y tubos de bomba peristáltica duraderos. La longitud de la sección depende de la distancia entre los diferentes componentes. Ensamble la línea de alimentación utilizando dos diámetros de tubo.

Utilice L/S 14 para la tubería primaria que abarcará la distancia desde el biorreactor hasta el depósito de medio. Inserte una longitud de tubo L/S 13 en el centro de la longitud del tubo para la sección de la bomba, utilizando los adaptadores de PVDF adecuados. Utilice adaptadores de tubería de púas de manguera de PVDF estándar para unir dos piezas de tubería L/S 14 a cada lado de la tubería de sección de bomba más corta.

Ensamble la sección de la tubería para la eliminación de desechos utilizando una tubería L/S 16 de mayor diámetro e inserte una sección corta de tubería L/S 14 en el medio para la sección de bombeo. Esto se hace de la misma manera que el montaje de la línea de alimentación mediante adaptadores de púas de manguera de PVDF. Ensamble el componente final del juego de tubos construyendo el juego a partir de tres longitudes de tubería cortas L/S 14.

Conectados entre sí con un conector HVDF tipo T y dos pequeñas abrazaderas de manguera en dos de las longitudes de tubería. Conecte el conjunto de muestras al conector de muestras de acero inoxidable adjunto en la tapa del biorreactor. Después de la esterilización, se conectará un filtro de gas estéril para la ventilación del gas a una de las longitudes sujetas.

El otro se utiliza para la conexión a una jeringa de muestreo estéril. Esterilizar en autoclave el conjunto de muestreo mientras está conectado al biorreactor, antes de comenzar el experimento como se describe en el protocolo de texto. Utilice este conjunto para recolectar muestras estériles del biorreactor según sea necesario, sin perturbar el proceso de alimentación continua.

Coloque los respiraderos estériles en las ubicaciones apropiadas en las tapas del matraz giratorio, el recipiente mediano, los recipientes de desechos y los puertos de muestras. Cultive y recoja las células como se describe en el protocolo de texto. Deje que las células se incuben a temperatura ambiente en tripsina durante dos o tres minutos en un gabinete de bioseguridad y luego recójalas en un tubo cónico.

A continuación, se recoge una pequeña muestra de células y se tiñe con azul de tripán. Cuente la densidad celular usando un microscopio y un hemocitómetro estándar con tinción con azul de tripán como se describe en el protocolo de texto. Agregue el número deseado de células totales a los biorreactores de suspensión agitados estériles para cada condición.

Añada el medio al biorreactor de suspensión agitado con una pipeta para alcanzar el volumen total de cultivo deseado. Mueva el biorreactor de suspensión agitada con células a una placa de agitación dentro de una incubadora de cultivos celulares. Cultivo de células en los biorreactores sin alimentación durante tres días a 37 grados centígrados, con 5% de dióxido de carbono, 100% de humedad relativa y una tasa de agitación de 70 rpm para permitir la formación de esferoides.

Después de la formación del esferoide, retire el biorreactor de suspensión agitado de la incubadora. Ensamble los componentes para el sistema de alimentación continua en un gabinete de seguridad biológica. Primero llene un depósito de medio fresco con el medio de cultivo deseado y luego conéctelo a un lado de la línea de alimentación.

Asegúrese también de que el depósito de medio fresco esté correctamente ventilado con un filtro estéril. Se debe reemplazar un filtro estéril en el puerto de entrada del biorreactor para filtrar el medio antes de que ingrese al biorreactor. Conecte la línea de desagüe al depósito de residuos mediano y asegúrese de que el depósito de residuos esté correctamente ventilado con un filtro estéril.

Coloque el biorreactor de suspensión agitado en la placa de agitación dentro de la incubadora utilizando los mismos parámetros de cultivo que para la formación de esferoides. Coloque el depósito de medio fresco dentro de un minirefrigerador cercano. Asegúrese de que las líneas de alimentación puedan salir del refrigerador sin impedir que las puertas se cierren.

También es fundamental que las líneas de alimentación no queden cerradas por las puertas del refrigerador o de la incubadora. El depósito de medio residual se puede colocar en la mesa de trabajo fuera de la incubadora en una ubicación conveniente. Pase los extremos de los tubos restantes a la incubadora y conecte la línea de alimentación al filtro en el puerto de entrada del biorreactor.

A continuación, conecte la línea de desagüe al puerto del tubo de salida. A continuación, coloque la sección de la bomba de las líneas de alimentación y residuos en el cabezal de la bomba, asegurándose de la orientación adecuada para que las líneas de alimentación bombeen el medio desde el depósito de medio fresco hasta el biorreactor de suspensión agitado, y las líneas de residuos bombeen el medio desde el biorreactor hasta el depósito del medio de desecho. Calcule la velocidad de alimentación utilizando la ecuación de velocidad de alimentación ajustada como se describe en el protocolo de texto.

Utilice la muestra más reciente con información de recuento de células, junto con la predicción de la tasa de crecimiento y las mediciones de glucosa en el medio para estimar la velocidad de alimentación necesaria para mantener la concentración de glucosa deseada en el cultivo. Ajuste la velocidad de la bomba en función de la velocidad de alimentación calculada. Repita el cálculo de la velocidad de alimentación y ajuste la velocidad de la bomba para cada punto de muestreo.

Las mediciones de glucosa en medio se muestran a partir de cultivos de esferoides de insulinoma Beta-TC6 utilizando biorreactores de suspensión agitados estáticos y métodos de cultivo de biorreactores de suspensión agitada alimentados continuamente. Alimentación con medio estándar de alta glucosa. La alimentación continua es capaz de eliminar las fluctuaciones de glucosa, pero los niveles medios de glucosa en el medio cambian drásticamente durante el período de cultivo y están muy por encima del rango fisiológico.

La alimentación ajustada es capaz de eliminar las fluctuaciones, así como de mantener las concentraciones de glucosa cerca de los niveles fisiológicos durante todo el período de cultivo. Aquí, se compara el crecimiento celular reportado como un cambio de pliegue en el número de células durante el período de cultivo de 21 días para biorreactores de suspensión agitada con cambios regulares de medio, cultivos de biorreactores de suspensión agitados con velocidad de alimentación constante y cultivos de biorreactores de suspensión agitada con velocidad de alimentación ajustada. Siguiendo este procedimiento, se pueden elaborar otros métodos, como la variación de condiciones, para responder a preguntas adicionales, como los requisitos de nutrientes para nuevas líneas celulares o resultados experimentales específicos.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran los requisitos metabólicos en células de humanos con cáncer u otros trastornos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo ensamblar un sistema de cultivo celular de profusión para controlar mejor las condiciones de cultivo y maximizar el rendimiento celular. No olvide que trabajar con células humanas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la protección contra patógenos transmitidos por la sangre al realizar este procedimiento.