Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el enfoque de ensamblaje de Gibson para crear construcciones de ADN grandes y complejas que combinen segmentos cortos y largos de varias fuentes de ADN diferentes. En primer lugar, diseñe computacionalmente la secuencia completa de nucleótidos de los plásmidos y, a continuación, diseñe conjuntos de cebadores superpuestos. A continuación, las plantillas de ADN para la reacción de ensamblaje se amplifican mediante PCR.

A continuación, se realiza una purificación de los productos PCR. El paso final es la transformación de la reacción de ensamblaje de los plásmidos resultantes y la verificación de los clones de plásmidos. En última instancia, la reacción de ensamblaje de Gibson se utiliza para desarrollar plásmidos en paralelo que contienen versiones marcadas con bandera de las proteínas CSTF 64 mutantes y de tipo salvaje bajo la regulación transcripcional del promotor alfa del factor de elongación humano uno.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el Corning de ADN tradicional, es que puede crear en paralelo, plásmidos de tipo salvaje y mutantes similares en diseño sin pasos secuenciales de Corning. Diseñe una secuencia continua de nucleótidos para representar el plásmido final. Ahora enumere los plásmidos y fragmentos de ADN reales que se utilizarán como plantillas en fragmentos de ADN de orden PCR que no están fácilmente disponibles, como diferentes combinaciones de etiquetas y promotores como fragmentos de ADN sintético de doble cadena simples o múltiples.

A continuación, divida la secuencia continua de nucleótidos de la construcción final en fragmentos de ADN adecuados para la PCR. Confirme que los fragmentos coinciden con los plásmidos disponibles y los fragmentos de ADN sintético. Evite los fragmentos de ADN de menos de 200 nucleótidos.

Junto a acceder a la herramienta de generación de cebadores, seleccione el menú establecer preferencias en la ventana emergente Cambiar la configuración del ensamblaje de Gibson. Seleccione la pestaña cambiar pres y, a continuación, seleccione el menú de construcción de compilación para insertar los fragmentos de ADN divididos en la herramienta de generación de cebadores secuencialmente desde el extremo de los cinco primos hasta el de los tres primos. Abra la ventana de entrada de vector o inserte fragmento, pegue el primer fragmento de ADN que representa los cinco extremos principales del ADN vectorial en formato A rápido y asigne un nombre a este fragmento de ADN.

Elija la forma adecuada de obtener el fragmento de ADN. A continuación, haga clic en la pestaña Continuar. Si es necesario agregar nucleótidos adicionales o sitios de restricción en la unión de la construcción final, abra el fragmento de adición e inserción en la ventana de ensamblaje en las áreas del espaciador de cebador hacia adelante o hacia atrás.

Introduzca los nucleótidos adicionales o los sitios de restricción en uno solo de los fragmentos de ADN. A continuación, haga clic en la pestaña Listo. Repita el procedimiento para todos los fragmentos hasta que se complete la construcción.

Seleccione el menú ver cebadores y revise las secuencias de cebadores. Repita también para todas las construcciones, vectores, esqueletos e inserciones o para fragmentos de ADN que sean diferentes. Diluya los cebadores de PCR a 10 micromolares en agua o tampón.

A continuación, diluya todas las plantillas de ADN y los ADN sintéticos monocatenarios para las PCR a un nanogramo por microlitro en agua. Ensamble las reacciones de PCR a temperatura ambiente combinando 2,5 microlitros de 10 micromolares de cada cebador. Un microlitro de un nanogramo por fragmento de ADN molde de microlitro 25 microlitros de caliente.

Comience a corregir la ADN polimerasa y 19 microlitros de agua. Mezcle el tubo con un movimiento suave y recoja las gotas de líquido mediante una breve centrifugación. Amplificar simultáneamente en tubos separados, los fragmentos de ADN de tamaño similar de acuerdo con las recomendaciones para la ADN polimerasa utilizada.

Realice de 25 a 28 ciclos de PCR o determine el número de ciclos que producen suficiente rendimiento de ADN. Resuelva cinco microlitros de la PCR utilizando electroforesis en gel AROS estándar. Verifique que una sola banda de ADN que representa el producto de PCR esté visible.

Determine el tamaño y la cantidad relativa de los fragmentos de ADN utilizando los estándares de peso molecular del ADN, si es necesario, repita la PCR para obtener una cantidad suficiente de fragmentos de ADN. Transfiera las PCR predigeridas con DPN en tubos de uno a 1,5 mililitros y agregue 81 microlitros de perlas magnéticas de purificación de ADN a cada tubo. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Coloque los tubos en el colector magnético durante dos minutos. Ahora, desecha el líquido claro. Lavar dos veces con 200 microlitros de etanol al 80% durante 30 segundos.

Luego vuelva a suspender las perlas secas en 10 microlitros de clorhidrato tris de 10 milimolares pH 8.0 Después de dos minutos, gire brevemente y luego coloque los tubos en el colector magnético durante dos minutos. Retire de 8,5 a 10 microlitros de la solución clara y colóquela en un nuevo tubo preetiquetado. Determinar la concentración de los fragmentos de ADN mediante espectroscopía UV.

Utilice al menos 100 nanogramos de fragmento de ADN que represente la columna vertebral del vector o el fragmento de ADN que lleve el marcador selectivo. Calcule el triple exceso molar de los fragmentos de ADN que se utilizarán como inserciones. Mezcle las cantidades calculadas de fragmentos de ADN en un tubo de PCR.

Luego ajuste el volumen a 10 microlitros. Añade 10 microlitros de la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson. Incubar la reacción a 50 grados centígrados en un termociclador PCR.

Proceda con la transformación del producto de ensamblaje incompetente e coli, o congele los productos a menos 20 grados Celsius hasta que sea necesario. Siga el procedimiento de transformación que acompaña a las células químicas o electrocompetentes. Por lo general, use dos microlitros de la reacción de ensamblaje por reacción de transformación.

Por último, confirmar el éxito de la clonación de ADN mediante secuenciación de ADN utilizando cebadores específicos o estándar. Analice los datos de secuenciación para verificar su precisión. Este experimento fue diseñado para clonar la proteína 64 del factor de estimulación de escisión y también la mutante CSTF 64.

Proteínas fusionadas a una etiqueta de tres banderas x bajo la regulación expresiva del promotor alfa HE F1. Un plásmido que contenía HE F1 alfa seguido de una etiqueta de bandera de tres x no estaba disponible para nosotros. Sin embargo, los siguientes plásmidos estaban disponibles.

PC DNA 3.1 M hiss HF un alfa que contiene plásmido y CSTF 64 plásmidos de ratón. La secuencia completa para la construcción se ensambló utilizando las aplicaciones de edición de nucleótidos y texto. Posteriormente, la secuencia se dividió en cuatro partes convenientes correspondientes a los ADN plasmídicos disponibles.

Los cuatro fragmentos de ADN para las reacciones de ensamblaje se amplificaron mediante PCR. Los plásmidos resultantes de clones individuales se amplificaron y analizaron mediante digestión enzimática de restricción para su correcto ensamblaje en el vector de ADN pc. Una vez dominada la técnica de ensamblaje, incluido el diseño primario y de plásmidos, la verificación posterior de PCR y comunicación se puede realizar dentro de los cinco días, excluyendo el tiempo para la síntesis y entrega de ADN primario y sintético.