Citometría de Flujo Protocolos de superficie y intracelular de antígenos Los análisis de los tipos de células neuronales

El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión de antígenos de superficie e intracelulares en células neuronales mediante citometría de flujo. Esto se logra primero recolectando células neuronales de cultivos in vitro o de tejido neural primario. A continuación, se aplica una tinción intracelular inespecífica opcional a las células.

A continuación, los antígenos de superficie deseados se marcan inmediatamente con un anticuerpo primario, mientras que los antígenos intracelulares deseados se marcan después de la fijación y permeación celular. En última instancia, los resultados se pueden obtener mediante el uso de análisis citométrico de flujo para la coexpresión de los antígenos de superficie en subpoblaciones neurales específicas de interés, según lo definido por el marcador intracelular. Este protocolo demostrará cómo preparar células neuronales derivadas de cultivos de tejidos para la interrogación de antígenos de superficie e intracelulares con citometría de flujo multicolor.

Para comenzar, coseche las células neurales adherentes cultivadas en frascos T 75 lavando primero suavemente las células una vez con cinco mililitros de PBS libre de magnesio y calcio a temperatura ambiente. A continuación, separar las células del matraz añadiendo tres mililitros de tripsina de sustitución e incubar a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos. Apague la digestión enzimática agregando seis mililitros de tampón de flujo después de aflojar los grumos celulares pipeteando la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces, transfiera toda la suspensión celular a un tubo nuevo de 15 mililitros para aislar las células.

Coloque el tubo en una centrífuga, centrifuga las células durante cinco minutos a temperatura ambiente y aspire el snat en preparación para el etiquetado del tinte intracelular. Vuelva a suspender el pellet de celda con cinco mililitros de PBS más 0.1%BSA. De lo contrario, agregue cinco mililitros de tampón de flujo junto con el protocolo estándar de tinción con azul de triano.

Utilice un hemocitómetro para estimar el recuento efectivo de células viables. Vuelva a ajustar la concentración celular de la suspensión existente a 1 millón de células viables por mililitro con el mismo tampón utilizado en el paso anterior. Estas células ahora están listas para dos opciones de tinción, una tinción de anticuerpos de antígeno de superficie o una tinción intracelular fluorescente opcional con carboxifluoresceína seguida de la tinción de antígeno de superficie antes mencionada.

Para realizar un paso de marcaje intracelular con colorante de éster CIN de carboxifluoresceína, primero agregue 10 microlitros de solución madre de CFSE. Por cada mililitro de suspensión celular, coloque el tubo en un agitador a 200 RPM e incube la mezcla durante cinco minutos. A temperatura ambiente, evite el fotoblanqueo protegiendo el tubo de la exposición directa a la luz.

Apague todos los tintes no reactivos agregando cinco volúmenes de suero que contenga tampón de flujo y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. A continuación, centrifugar las células durante cinco minutos en una centrífuga a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante para eliminar los restos de tintes no reactivos. Lave el pellet de la celda suspendiéndolo con cinco volúmenes de tampón de flujo.

A continuación, las células se hacen girar una vez más en una centrífuga a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de desechar el natante de SUP. Finalmente, vuelva a suspender el pellet de celda con tampón de flujo de modo que la concentración final de celda sea de 1 millón de células viables por mililitro. Para un experimento multiplexado, agregue un número igual de células de interés no teñidas de una condición experimental diferente a la suspensión de células teñidas con CFSC.

Las células ahora están listas para el marcaje de antígenos de superficie con anticuerpos para comenzar la tinción de la superficie celular. Transfiera 100 microlitros de la suspensión de celdas con o sin etiquetas CFSC a un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Agregue cuatro anticuerpos conjugados con flúor a la suspensión celular en una cantidad previamente determinada por pruebas de titulación de anticuerpos.

Coloque el tubo en un agitador orbital a temperatura ambiente a 100 RPM e incube la mezcla durante 30 minutos. En ausencia de luz, diluya la mezcla de anticuerpos agregando un mililitro de tampón de flujo. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar y girar las células en una microcentrífuga preenfriada a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos.

Aspire el supinato para eliminar los anticuerpos no unidos y repita este lavado, centrífuga y aspiración. Da un paso más. Reus suspende el pellet celular en 100 microlitros un tampón de flujo a las células previamente teñidas.

Añadir 500 microlitros del tampón de fijación a 100 microlitros de la suspensión celular. Coloque el tubo en un agitador orbital a temperatura ambiente a 100 RPM e incube durante 15 minutos en la oscuridad. El formaldehído entrecruzará todas las especies de proteínas y ADN que estén muy próximas entre sí y producirá suspensiones celulares no viables.

Diluya la mezcla de fijación agregando un mililitro de PBS y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. A continuación, gire las celdas fijas en una centrífuga preenfriada de cuatro grados centígrados durante tres minutos. Aspire el supinato de tal manera que queden 100 microlitros de líquido por encima de la pelletización celular para permear la membrana celular para el posterior marcaje del antígeno intracelular.

Añadir 500 microlitros de tampón de permeación a 100 microlitros de suspensión celular. Coloque el tubo en un agitador orbital a temperatura ambiente a 100 RPM e incube durante 15 minutos en la oscuridad. Diluya la mezcla de permeabilidad agregando un mililitro de PBS, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar y girar las celdas fijas en una centrífuga preenfriada de cuatro grados Celsius durante tres minutos.

Aspire el SUP natante completamente antes de la incubación. Prepare un stock de trabajo de anticuerpo primario diluyendo el anticuerpo en un tampón PBS más 0,5% entre 20. Eso se enriquece aún más con 1% de suero de burro 10% BSA o suero de cabra al 10%.

A continuación, vuelva a suspender el pellet de célula permeable a la membrana con 100 microlitros del material de trabajo del anticuerpo primario. Coloque el tubo en un agitador orbital a temperatura ambiente a 200 RPM e incube durante 30 minutos en la oscuridad. Diluya la mezcla de anticuerpos primarios agregando un mililitro de tampón de flujo.

Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para mezclar y girar las células en una centrífuga preenfriada de cuatro grados centígrados durante cuatro minutos. Aspire el supinato por completo para eliminar los anticuerpos no unidos. A continuación, vuelva a suspender el pellet con 100 microlitros del material de trabajo del anticuerpo secundario.

Repita la incubación a temperatura ambiente protegida de la luz durante 30 minutos. En el mismo agitador, diluya la mezcla de anticuerpos secundarios agregando un mililitro de tampón de flujo. Repita la misma mezcla de inversión del tubo, centrifugado y eliminación del sobrenadante para eliminar todos los anticuerpos no unidos.

Repita los mismos pasos de centrifugación de lavado de un mililitro y eliminación del sobrenadante dos veces más, pero con PBS fresco como tampón de lavado. En su lugar, el resultado final será un pellet de célula limpia marcado con anticuerpos fluorescentes dirigidos extracelulares o intracelulares CFSC o cualquier combinación de los tres resuspendidos, el pellet de célula marcada en 150 microlitros de tampón de flujo. Transfiera la suspensión de la celda al citómetro de flujo y comience el análisis con los ajustes adecuados de filtro de emisión y excitación láser para cada piso de cuatro.

Utilizando los datos de dispersión directa y lateral como guía, configure la dispersión inicial hacia adelante frente a la dispersión lateral dentro del software de análisis de citometría de flujo para excluir puntos de datos no específicos, como restos de células y células muertas. A continuación, utilizando datos brutos de una suspensión celular no teñida como control negativo, configure múltiples puertas de integración fluorescente que seleccionen señales de emisión positivas de etiquetas de antígenos extracelulares e intracelulares para tener en cuenta el fluorescente de fondo de varios colores. Los efectos de superposición espectral reajustan las puertas fluorescentes utilizando datos brutos de controles teñidos con un solo anticuerpo.

En un experimento de fax multiplexado, las etiquetas de carboxifluoresceína se pueden utilizar como una señal de referencia que podría discriminar entre células de dos linajes diferentes o condiciones experimentales sin el uso de un anticuerpo. Por ejemplo, en una suspensión celular heterogénea, se puede diferenciar inmediatamente entre las células neuronales marcadas con CFSC y los fibroblastos no marcados con solo observar la presencia o ausencia de fluorescencia en el canal verde. Además, junto con el marcaje Esther de CFSE, se pueden utilizar anticuerpos fluorescentes de diferentes colores para determinar la expresión diferencial de antígenos de superficie entre los subconjuntos marcados con CFSE y los no marcados dentro de una muestra mixta.

Por ejemplo, las células de neuroblastoma SHSY cinco Y marcadas con CFSE en el canal de fluorescencia verde, coexpresaron niveles altos de antígeno de superficie CD 24, pero no del marcador de fibroblastos CD 54. Por el contrario, los fibroblastos BJ negativos para CFSC son positivos para CD 54 con niveles más bajos de CD 24.Combinatorial. El análisis de los antígenos de la superficie neural también se puede realizar junto con la detección de antígenos intracelulares basada en anticuerpos.

La inclusión de muestras sin tinción y controles con tinción única para antígenos de superficie y antígenos intracelulares es fundamental como alternativa al marcaje de antígenos intracelulares basado en anticuerpos primarios y secundarios, como el mapa de marcadores neuronales dos que se muestra aquí. El marcaje fluorescente no covalente del anticuerpo primario puede producir resultados comparables en el análisis de coexpresión y acorta el protocolo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar las células neuronales para el análisis básico de citometría de flujo utilizando varios enfoques de etiquetado alternativos y combinaciones de los mismos.