Técnica mínimamente invasiva para la inyección en nervio óptico de la rata

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un enfoque mínimamente invasivo para inyectar drogas o células madre en el nervio óptico de una rata viva. Esto se logra anestesiando primero a la rata, colocándola en el soporte de disección e insertando una sutura en la conjuntiva para la manipulación del ojo. Más tarde, el segundo paso es diseccionar la cresta orbitaria detrás del ojo para exponer el nervio óptico.

A continuación, se inserta la pipeta de vidrio en el nervio óptico y se inyecta el fármaco o las células madre antes de cerrar el sitio quirúrgico y revivir a la rata de la anestesia. En última instancia, después de un cierto período de tiempo, se sacrifica la rata, se disecciona el nervio óptico y se pueden visualizar los efectos de la inyección quirúrgica o el trasplante mediante microscopía. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que este enfoque es mínimamente invasivo, y eso permite que la rata sobreviva todo el tiempo que necesites.

Estudiar los efectos de la inyección quirúrgica o el trasplante. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kate Schwartz, una estudiante de técnica de mi laboratorio. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo anestesia con dos a 3% de flúor.

Confirme el nivel adecuado de anestesia por pellizco de los dedos del pie y la frecuencia respiratoria. Comprueba que la rata no se estremezca en respuesta a un dedo del pie. Pellizcar. Asegure al animal según sea necesario para evitar el movimiento de la cabeza durante el procedimiento.

A continuación, coloque una gota de lidocaína en el ojo quirúrgico. Use lágrimas artificiales cada 10 minutos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia. Administre una inyección preoperatoria de buprenorfina a 0,01 miligramos por kilogramo por vía subcutánea, y luego cada seis a ocho horas según sea necesario.

Mantenga al animal caliente con una almohadilla térmica. Humedece el pelaje del cuero cabelludo con alcohol. Teniendo cuidado de evitar la exposición en los ojos.

Asegúrese de utilizar herramientas y técnicas estériles para minimizar el riesgo de infecciones postoperatorias. A continuación, coloque una sutura de cuatro oh en la conjuntiva lateral y átela con suficiente sutura para permitir una tracción suave. Haga una incisión aproximada de una pulgada en la piel que recubre la cresta orbitaria.

Usando un bisturí de tamaño 10. Retraiga la piel y la fascia subyacente y diseccione cuidadosamente la fascia. Coloque una sutura en la piel retraída para permitir la exposición del saco orbitario superior para evitar el sangrado excesivo en el sitio quirúrgico.

Evite cortar los vasos sanguíneos mientras disecciona la fascia. Con una tracción suave en la conjuntiva, tirando del ojo hacia abajo y fuera de la cuenca, el músculo orbitario superior quedará a la vista. Para exponer el nervio óptico, se debe eliminar la grasa retroorbitaria y cortar este músculo.

La grasa se puede desechar y no debe reemplazarse después de la inyección. A partir de este punto, la fascia del nervio óptico debe ser visible como un haz del propio nervio óptico, junto con los vasos sanguíneos envueltos en duramadre. Para hacer la disección más profunda, haga una pequeña incisión en el DRA usando el bisturí o una aguja biselada de calibre 31 para que el piercing sea menos traumático, haya preparado una micropipeta de vidrio estirado con un diámetro de 50 a 100 micras para proporcionar estabilidad.

Monte la micropipeta en un micromanipulador y conéctela a una jeringa de plástico de 20 cc. Tire de las perlas o células madre reconstituidas en 0,5 a un microlitro en la micropipeta retrógrada, junto con 0,5 microlitros de solución de azul de metilo antes y después de que la pipeta de vidrio se cargue con tinte. Con una jeringa de un cc y una aguja de calibre 30, baje la punta de la micropipeta sobre el nervio óptico justo por encima de la duramadre mellada.

Un movimiento pequeño pero enérgico de la punta del vidrio en el nervio óptico da como resultado el menor daño mientras se aplica una presión lenta y constante sobre el émbolo. El tinte azul de Evans debe resaltar el área del nervio óptico inyectado. El tinte debe permanecer localizado dentro del nervio óptico sin filtrarse en el espacio subaracnoideo.

Siga la segunda banda del tinte azul de Evan para determinar cuándo se completó la inyección de células madre. Cuando se inyecte el volumen necesario en el nervio óptico, suelte el émbolo. Mantenga la micropipeta inmóvil dentro del nervio óptico durante cinco minutos para evitar la eyección de alta presión al retirar la micropipeta una vez finalizada la inyección.

Retire la micropipeta junto con las puntas de algodón utilizadas para proporcionar hemostasia. Suturar la piel con seda 3.0 y retirar la sutura conjuntival. Mantenga a las ratas calientes en una almohadilla térmica hasta que salgan de la anestesia.

No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener el esternón recostado. Si el animal presenta signos de dolor, como letargo excesivo, ataxia o dificultad para respirar, administre analgesia adecuada con buprenorfina intramuscular hasta tres veces al día. Después del experimento, se sacrificaron ratas y se les perfundió con paraldehído.

Los nervios ópticos fueron cuidadosamente diseccionados y montados para el corte de criostato, aquí hay un ejemplo de un nervio óptico de agujero de rata a baja potencia en el que se inyectó el tinte azul de Evan. Para visualizar el sitio, la flecha identifica la ubicación precisa de la inyección. Esta disección se realizó a los pocos días de la inyección, como lo indica la difusión restringida del tinte por el nervio después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurología regenerativa exploraran nuevas formas de regenerar el nervio óptico y potencialmente restaurar la visión perdida en este modelo de rata de enfermedad desmielinizante.