Name: Técnica mínimamente invasiva para la inyección en nervio óptico de la rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprende una técnica mínimamente invasiva para inyectar fármacos o células madre en el nervio óptico de ratas. Este método reduce complicaciones quirúrgicas y acelera la recuperación, facilitando la investigación regenerativa en neurociencia.

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Este estudio fue apoyado por NeuralStem, Inc., y Johns Hopkins Project RESTORE.

NOTA: Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de Johns Hopkins. Máquinas de anestesia requieren inspección anual y calibración según sea necesario. 1. Anestesia y Posicionamiento <ol><li> Anestesia. <ol><li> Realizar todos los procedimientos quirúrgicos con anestesia con isofluorano 2-3%. Confirmar nivel adecuado de anestesia por pizca dedo del pie y ritmo respiratorio. Compruebe que la rata no se inmuta en respuesta a una pizca dedo del pie. NOTA: Un estremecimiento indica la anestesia que es demasiado tarde y puede requerir anestesia más largos antes de comenzar o una concentración isofluorano superior. Una tasa de respiración menos de 1 respiración cada 2 seg es demasiado lento que indica la anestesia es demasiado alta y puede requerir aligeramiento de la concentración de isofluorano. </li><li> Asegure el animal si es necesario para evitar el movimiento de la cabeza durante el procedimiento. Coloque una gota de lidocaína en el ojo quirúrgico. Use lágrimas artificiales cada 10 minutos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Daruna inyección de buprenorfina de 0,01 mg / kg SC pre-operativamente y luego cada 6-8 horas según sea necesario. </li></ol></li><li> Posicionamiento. <ol><li> Coloque las ratas en un marco estereotáxico y mantenga caliente con una almohadilla térmica. Humedezca la piel del cuero cabelludo con el cuidado de alcohol para evitar la exposición en los ojos. Utilice herramientas estériles y una técnica estéril para minimizar el riesgo de infecciones postoperatorias. </li></ol></li></ol> 2. Control de los ojos <ol><li> Coloque una sutura 4-0 en la conjuntiva lateral y lo atan con suficiente sutura para permitir una tracción suave. </li></ol> 3. Disección <ol><li> Disección inicial. <ol><li> Hacer una incisión ~ 1 pulgada en la piel que cubre la cresta orbital utilizando un tamaño de 10 bisturí como se muestra en la Figura 1. Retraer la piel y la fascia subyacente y cuidadosamente diseccionar la fascia. Para prevenir el sangrado excesivo en el quirúrgico, evitar cortar los vasos sanguíneos, mientras que la disección de la fascia. Utilizar estratégicamente plconsejos de Aced algodón para proporcionar hemostasia. </li></ol></li><li> Disección más profundo. NOTA: Con tracción suave en la conjuntiva del ojo tirando hacia abajo y fuera de la cuenca, el músculo orbital superior vendrá a la vista. Con el fin de exponer el nervio óptico, este músculo se debe cortar la grasa y retro-orbital retira. La grasa puede ser desechado y no debe ser sustituido después de la inyección. Desde este punto, la fascia nervio óptico debe ser visible como un haz del nervio óptico en sí, junto con los vasos sanguíneos envueltos en la duramadre (Figura 1). <ol><li> Hacer una pequeña incisión en la duramadre utilizando el bisturí o una aguja biselada de calibre 31 para hacer la perforación menos traumática. </li></ol></li></ol> 4. Pipetear Inyector <ol><li> Tire de una micropipeta de vidrio de un diámetro de 50-100 micras. Para proporcionar estabilidad, montar la micropipeta en un micromanipulador y adjuntar a una jeringa Hamilton conectado a una bomba de infusión. </li><li> Tire hacia arriba de los granos (o células madre)reconstituida en un volumen de 0,5-1,0 l en la micropipeta retrógrado junto con 0,5 l de volumen de solución de azul de metilo antes y después. NOTA: Una tasa de infusión de 0,5 a 2 l por minuto impide traumatismo en el nervio óptico. </li></ol> 5. Inyección <ol><li> Baje la punta de la micropipeta en el nervio óptico justo encima de la duramadre mellado. NOTA: Una pequeña, pero a paso ligero movimiento de la punta de vidrio en los resultados del nervio óptico en el menor daño. Cuando comienza la bomba de infusión, el colorante azul de metilo debe resaltar el área del nervio óptico inyectado. El tinte debe permanecer localizada dentro del nervio óptico sin fugas en el espacio subaracnoideo. </li><li> Sigue la segunda banda de azul de metilo para determinar cuando la inyección de células madre es completa y girar la bomba de infusión fuera como se inyecta la segunda dosis de azul de metilo. Mantenga la micropipeta todavía dentro del nervio óptico durante 2 min para cada volumen 1 l se inyecta en alta para evitareyección de presión tras la retirada de la micropipeta. NOTA: Un enfoque alternativo es para conectar la punta de la pipeta a una jeringa llena de aire que puede ser manipulado manualmente. De cualquier manera, evitar una fuerza excesiva para minimizar el daño a los nervios ópticos. Se recomienda la inyección de no más de 2 l de volumen en cada nervio óptico. </li></ol> 6. Seguimiento <ol><li> Inmediato. <ol><li> Cuando la inyección, retire la micropipeta junto con las puntas de algodón utilizados para proporcionar la hemostasia. Suturar la piel con seda 3-0 y saque la sutura conjuntival. </li><li> Mantenga ratas caliente en una almohadilla eléctrica hasta que emergen de la anestesia. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere totalmente. </li><li> Si el animal está mostrando signos de dolor, incluyendo excesiva letargo, ataxia, o respirando trabajadog, administrar analgesia adecuada con buprenorfina intramuscular (0,05 mg / kg) hasta tres veces diarias. </li></ol></li><li> A largo plazo. <ol><li> Para el próximo 24 a 48 horas, se observe la rata de complicaciones de la cirugía, incluyendo inflamación o secreción de la herida u otros signos de dolor como la vocalización, la apariencia encorvada, sin preparación, o no comer. Considere la posibilidad de consultar con un veterinario o la eutanasia ética como sea necesario. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+and+future+prospects+for+stem+cell+rescue+and+regeneration+of+the+retina+and+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+journal+of+ophthalmology+Journal+canadien+d%27ophtalmologie%22%5BJournal%5D)">Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve.</a> Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).</li>
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<li>Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+inflammation+and+demyelination+in+a+rodent+model+of+nonarteritic+anterior+ischemic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).</li>
<li>Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+nanomedicine+for+vision+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+proceedings%22%5BJournal%5D)">Regenerative nanomedicine for vision restoration.</a> Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen divulgaciones significativas que informar.

La inyección directa en el nervio óptico de células madre u otros productos destinados a facilitar la regeneración proporciona un modelo conveniente en comparación con otros medios de inyección en el SNC. Esta técnica lleva menos tiempo, requiere menos anestesia total, evita perforar o extirpar tejido craneal o óseo, reduce las tasas de complicaciones y permite una recuperación más rápida después de la cirugía. 
Los pasos más críticos de este protocolo incluyen: 1. Hemostasia adecuada en el ca...

El nervio óptico es un lugar ideal para el sistema nervioso central (SNC) la investigación regenerativa incluyendo condiciones oftalmológicas tales como neuritis óptica, glaucoma y el trauma. Las inyecciones de una variedad de células madre han demostrado la eficacia o mostrado promesa en la sustitución de la mielina perdida, aumentar el conteo de axonal y / o la prevención de enfermedades degenerativas. 1,2 El nervio óptico humano contiene aproximadamente 1,2 millones de axones paralelas que viajan desde la retina hasta el quiasma con un diámetro de aproximadamente 3,0-3,5 mm. 3 Para modelar enfermedades humanas en el laboratorio, la rata se ha usado con frecuencia. El nervio óptico de la rata adulta contiene aproximadamente 100.000 axones dentro de un diámetro de aproximadamente 0,5 mm. 4 Una de las principales limitaciones en el SNC investigación regenerativa es el acceso sin hueso directa. Las complicaciones y riesgos quirúrgicos para el animal son más altas cuando se quitan el cráneo o vértebras. Similar a los beneficios deabordajes mínimamente invasivos en la columna vertebral, 5 inyecciones nervio óptico directos sin necesidad de abrir las oferta reducida complicaciones cráneo y una recuperación más rápida. Esta técnica se ha utilizado en estudios previos. 6 En este manuscrito y vídeo que acompaña, se demuestra un procedimiento mínimamente invasivo para inyectar células madre en el nervio óptico de la rata.

<table><tbody><tr><td>Rata de Lewis</td><td>Charles River</td><td>4</td><td>Cualquier cepa de rata funcionará.</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>Surgivet</td><td>CDS9000</td><td>CDS 9000 Máquina de anestesia para animales pequeños - Montaje en poste</td></tr><tr><td>Bomba de infusión</td><td>Stoelting</td><td>53129</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>National Optical</td><td>409-411-1105</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz de fibra óptica</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Disección y almacenamiento</td><td></td> <td>de instrumentos estereotáxicos51400</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Kopf</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>18150-6</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí desechables</td><td>Harvard Apparatus</td><td>810-15-021</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iridectomía</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica Unibanda</td><td>LA-4XF</td><td></td></tr></tbody></table>

técnica mínimamente invasiva para la inyección en nervio óptico de la rata

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

El nervio óptico de la rata es un modelo útil para la investigación de la regeneración de células madre. La inyección directa en el nervio óptico de la rata permite la administración en el sistema nervioso central en una cirugía mínimamente invasiva sin extirpación ósea. Esta técnica describe un enfoque para la visualización y la inyección directa del nervio óptico después de una disección fascial menor de la cresta orbitaria, utilizando una sutura de tracción conjuntival para tirar suavemente del ojo hacia abajo y hacia afuera. Ejemplos representativos de un nervio óptico inyectado muestran la inyección exitosa de cuentas teñidas.

A la conclusión del experimento, las ratas se sacrificaron y se perfundieron con 4% de paraformaldehído. Los nervios ópticos fueron cuidadosamente disecados y montados para seccionamiento criostato. La figura 2 muestra un ejemplo de un nervio óptico de rata entero a baja potencia en el que se inyectó colorante azul de Evans con el fin de visualizar el sitio. La flecha identifica la ubicación precisa de la inyección. Esta disección se realiza dentro de unos pocos minutos de la inyección, como se indica p...

La inyección directa en el nervio óptico de la rata es útil para la investigación regenerativa. Demostramos una técnica mínimamente invasiva para la inyección directa en el nervio óptico de una rata que no implica abrir el cráneo. Con este método, las complicaciones quirúrgicas se minimizan y la recuperación es más rápida.

Técnica mínimamente invasiva para la inyección en nervio óptico de la rata

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

El objetivo general de este procedimiento consiste en proporcionar un enfoque mínimamente invasivo para inyectar fármacos o células madre en el nervio óptico de una rata viva. Esto se logra primero anestesiando a la rata, colocándola sobre el soporte de disección e insertando una sutura en la conjuntiva para la manipulación del ojo. Posteriormente, el segundo paso consiste en realizar un desprendimiento hacia la cresta orbitaria detrás del ojo para exponer el nervio óptico.A continuación, se inserta la pipeta de vidrio en el nervio óptico y se inyecta el fármaco o las células madre antes de cerrar el sitio quirúrgico y revivir a la rata de la anestesia. Finalmente, tras un determinado período de tiempo, se sacrifica a la rata, se disecciona el nervio óptico y los efectos de la inyección quirúrgica o del trasplante pueden visualizarse mediante microscopía. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que este enfoque es mínimamente invasivo, lo que permite que la rata sobreviva tanto tiempo como sea necesario.Estudie los efectos de la inyección quirúrgica o el trasplante. El procedimiento será demostrado por Kate Schwartz, una técnica estudiante de mi laboratorio. Realice todos los procedimientos quirúrgicos bajo anestesia con 2 a 3% de isoflurano.Confirme el nivel adecuado de anestesia mediante la compresión del dedo del pie y la frecuencia respiratoria. Verifique que la rata no presente respuestas de retirada ante la compresión de un dedo. Sujete al animal según sea necesario para evitar movimientos de la cabeza durante el procedimiento.Luego coloque una gota de lidocaína en el ojo quirúrgico. Use lágrimas artificiales cada 10 minutos para prevenir la sequedad mientras el paciente está bajo anestesia. Administre una inyección preoperatoria de buprenorfina a 0.01 miligramos por kilogramo por vía subcutánea, y luego cada seis u ocho horas según sea necesario.Mantenga al animal caliente con una almohadilla calefactora. Humedezca el pelo del cuero cabelludo con alcohol. Tenga cuidado de evitar el contacto con los ojos.Asegúrese de utilizar herramientas estériles y técnica estéril para minimizar el riesgo de infecciones posoperatorias. A continuación, coloque una sutura 4-0 en la conjuntiva lateral y átela con suficiente hilo para permitir tracción suave. Realice una incisión de aproximadamente una pulgada de longitud en la piel que recubre el reborde orbitario.Utilizando un escalpelo tamaño 10. Retraer la piel y la fascia subyacente y diseccionar cuidadosamente la fascia. Colocar un punto de sutura en la piel retraída para permitir la exposición de la bolsa orbitaria superior y prevenir sangrado excesivo en el sitio quirúrgico.Evite cortar los vasos sanguíneos mientras disecciona la fascia. Con una tracción suave sobre la conjuntiva, tirando del ojo hacia abajo y fuera de la órbita, se hará visible el músculo orbital superior. Para exponer el nervio óptico, debe eliminarse la grasa retroorbital y seccionarse este músculo.La grasa puede descartarse y no debe reemplazarse después de la inyección. A partir de este punto, la fascia del nervio óptico debe ser visible como un haz del propio nervio óptico, junto con los vasos sanguíneos envueltos en la duramadre. Para realizar la disección más profunda, haga una pequeña incisión en la DRA utilizando el bisturí o una aguja biselada de calibre 31 para que la punción sea menos traumática, y tenga preparada una micropipeta de vidrio estirada con un diámetro de 50 a 100 micrones para proporcionar estabilidad.Monte la micropipeta en un micromanipulador y conéctela a una jeringa de plástico de 20 cc. Aspire hacia atrás las perlas o células madre reconstituidas en 0,5 a un microlitro dentro de la micropipeta en sentido retrógrado, junto con 0,5 microlitros de solución de azul de metileno antes y después de cargar la pipeta de vidrio con el colorante. Utilizando una jeringa de 1 cc y una aguja de calibre 30, baje la punta de la micropipeta sobre el nervio óptico justo por encima de la duramadre seccionada.Un pequeño pero rápido movimiento de la punta de vidrio hacia el nervio óptico provoca el menor daño posible mientras se aplica una presión lenta y constante sobre el émbolo. El colorante azul de Evans debe resaltar el área del nervio óptico inyectado. El colorante debe permanecer localizado dentro del nervio óptico sin fugas hacia el espacio subaracnoideo.Siga la segunda banda del colorante Azul de Evans para determinar cuándo se completa la inyección de células madre. Cuando se haya inyectado el volumen necesario en el nervio óptico, suelte el émbolo. Mantenga la micropipeta inmóvil dentro del nervio óptico durante cinco minutos para evitar la expulsión por alta presión al retirar la micropipeta una vez finalizada la inyección.Retire la micropipeta junto con cualquier punta de algodón utilizada para proporcionar hemostasia. Suture la piel con seda 3.0 y retire el punto conjuntival. Mantenga a las ratas calientes sobre una almohadilla calefactora hasta que salgan de la anestesia.No deje un animal sin supervisión hasta que haya recuperado conciencia suficiente para mantenerse en posición esternal. Si el animal muestra signos de dolor, como letargo excesivo, ataxia o dificultad respiratoria, administre analgesia adecuada con buprenorfina por vía intramuscular hasta tres veces al día. Después del experimento, las ratas fueron sacrificadas y perfundidas con paraformaldehído.Los nervios ópticos se disecaron cuidadosamente y se montaron para el corte en criostato; aquí se muestra un ejemplo de un nervio óptico completo de rata a bajo aumento, en el cual se inyectó el colorante azul de Evans. Para visualizar el sitio, la flecha indica la ubicación exacta de la inyección. Esta disección se realizó unos días después de la inyección, como lo indica la difusión restringida del colorante a lo largo del nervio tras su administración.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurología regenerativa exploraran nuevas formas de regenerar el nervio óptico y potencialmente restaurar la visión perdida en este modelo de rata de enfermedad desmielinizante.

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Investigación

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Neurociencia

Inyección intravítrea es una técnica ampliamente utilizada en la investigación de las ciencias visuales de enfermedades oculares o en la aplicación directa del tratamiento local. Este vídeo demuestra un protocolo de inyección intravítrea con una jeringa de 1 ml con una pipeta de vidrio. Consejos útiles acerca de cómo evitar una hemorragia masiva y daños en el objetivo se les da.

Inyección intravítrea para el establecimiento de modelos Enfermedades Oculares

Transección del nervio óptico es un modelo ampliamente utilizado de la lesión en el SNC adulto. Este modelo es ideal para llevar a cabo una serie de manipulaciones experimentales que se dirigen a la retina a nivel mundial o directamente dirigidos a la población heridos neuronal de las células ganglionares de la retina.

Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Este video muestra el procedimiento de acceder quirúrgicamente al nervio óptico en un animal anestesiado y administrar con precisión lisolecitina para inducir la desmielinización focal, creando condiciones neuropatológicas para estudios posteriores.

Inducción de desmielinización local en el nervio óptico mediante lisolecitina

Las inyecciones subretinianas son la técnica más común para administrar grandes agentes terapéuticos, como proteínas y vectores virales, a los fotorreceptores y al epitelio pigmentario de la retina. Aquí se describe un método alternativo en ratones que se dirige con éxito al espacio subretiniano con un daño colateral mínimo y tiempos de recuperación rápidos.

Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano<i&gt; vía</i&gt; Un enfoque posterior transescleral

Este protocolo tiene como objetivo demostrar una vía de administración venosa reproducible que pueda ser utilizada en ratas y ratones durante todo el período neonatal. Este procedimiento es importante para los estudios preclínicos en roedores que desean reflejar la administración de fármacos en las unidades de cuidados neonatales, principalmente mediante la administración intravenosa.

Un modelo neonatal de inyección venosa retroorbitaria en roedores

Este protocolo describe una técnica para la inyección intracameral en ratas utilizando una incisión corneal central y un túnel largo hacia la cámara anterior. Este método de inyección minimiza el riesgo de inducir daño tisular involuntario y, por lo tanto, mejora la precisión y la reproducibilidad.

Inyección intracameral en ratas con bajo riesgo de efectos adversos

Presentamos un protocolo para la inyección directa del nervio vago en ratas, que permite la administración del fármaco directamente en el nervio sin complicaciones posteriores a la inyección. Este método se aplica a los estudios neurológicos preclínicos que involucran la manipulación del sistema nervioso autónomo. Se puede utilizar para la inyección directa de nervios para otros nervios en ratas y otras especies, con las modificaciones necesarias.

Protocolo de inyección directa del nervio vago para ratas

Este protocolo describe una técnica única que utiliza un abordaje transconjuntival para acceder al nervio óptico de rata para inyecciones.

Abordaje transconjuntival para inyección en el nervio óptico de la rata

Este estudio presenta una metodología para la administración de terapias en la retina y los nervios ópticos de la rata adulta. Además, se introduce un método único de recuperación de tejido para una colección en bloque de arriba hacia abajo del nervio óptico y la retina en una rata adulta.

Administración Terapéutica Ocular y Recuperación Avanzada de Tejido en Ratas Adultas

Las inyecciones subretinianas son una técnica indispensable para el desarrollo preclínico de terapias para enfermedades de fotorreceptores y EPR. Describimos una técnica de inyección subretiniana transescleral optimizada en ratones que mejora las tasas de éxito intraoperatorio y minimiza el daño retiniano.

Técnica de inyección subretiniana transescleral mínimamente invasiva optimizada en ratón

Aprende una técnica mínimamente invasiva para inyectar fármacos o células madre en el nervio óptico de ratas. Este método reduce complicaciones quirúrgicas y acelera la recuperación, facilitando la investigación regenerativa en neurociencia.

Técnica mínimamente invasiva para la inyección en nervio óptico de la rata

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