Name: Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende a generar clones de células T humanas aloantígeno-específicas a partir de sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de densidad, separación magnética y citometría de flujo. Este método permite estudiar respuestas inmunitarias específicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El autor desea agradecer a la Instalación Central de Terámeros de los NIH por la producción de tetrámeros. El autor también desea agradecer a E.D. O'Connor y K.E. Márquez del laboratorio de citometría de flujo de la Instalación Central de Células Madre Embrionarias Humanas de UCSD por su ayuda en la clasificación de células. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud K08AI085039 (G.P.M.).

NOTA: Este protocolo requiere el uso de muestras de sangre periférica de voluntarios humanos. Todas las investigaciones con seres humanos debe ser revisado y aprobado por un Estudios Humanos Junta de Revisión Institucional para garantizar el cumplimiento de la Declaración de Helsinki (2013) y la Portabilidad del Seguro de Salud y la Ley de Responsabilidad de 1996. 1. Aislamiento de células T de sangre entera <ol><li> Antes de comenzar, calentar el medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente. Alícuota 4 ml de medio de gradiente de densidad en 2-4 estériles de 15 ml tubos de centrífuga cónicos (1 tubo será utilizado por cada 10 ml de volumen total de sangre diluida). </li><li> Obtener 10-20 ml de sangre en aerosol heparina 1-2 de sodio revestido (verde-top) tubos de extracción de sangre venosa. Recoger muestras humanas bajo la supervisión de personas capacitadas y de acuerdo con una Junta de Revisión Institucional protocolo aprobado. </li><li> Limpiar el exterior de los tubos con etanol al 70%. Retire con cuidado la parte superior de la fillenada tubos de recogida y decantar la sangre en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. </li><li> Añadir 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a cada tubo de recogida de sangre. Recoger el PBS, añadir a la sangre entera se decanta, y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 25 mu l T humanas de enriquecimiento celular Cocktail / 2 ml de volumen total. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Usando una pipeta de 10 ml, la capa de hasta 10 ml de la 1: 1 sangre diluida suavemente en la parte superior del medio de gradiente de densidad. Tenga cuidado de no perturbar la superficie del medio de gradiente de densidad. </li><li> Sangre en capas Centrifugar y medio de gradiente de densidad a 1.200 xg durante 20 min a 20 o C. </li><li> Sacar los tubos de la centrífuga, teniendo cuidado de no alterar la interfaz entre el medio de gradiente de densidad y la capa de leucocitos en la interfaz entre el medio de gradiente de densidad y el plasma diluido. Con una pipeta de 5 ml, recoger cuidadosamente la capa leucocitaria y traslado a un nuevo 50 ml bañera cónico estérile. </li><li> Añadir PBS para llevar el volumen de la PBL recogidos a 50 ml y mezclar suavemente. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar. </li><li> Resuspender las células sedimentaron en 10 ml estéril citometría de flujo de la clasificación tampón (PBS filtrada de forma estéril que contiene 1% de BSA). Muestra de 10 l de suspensión celular, se diluye 1:10 (añadir a 90 l) de azul de tripano para contar las células utilizando un hemocitómetro (rendimiento esperado 1-4 x 10 6 células / tubo de sangre total). <ol><li> Eliminar 1 ml alícuota, traslado al tubo de 5 ml, y mantener en hielo para el análisis de las células T no etiquetados por tetrámero. Mantener la suspensión de células en hielo. </li></ol></li></ol> 2. Enriquecimiento magnética de las células T específicas de aloantígeno- <ol><li> Diluir aloantígeno pMHC tetrámero a 1: 100 en tampón de tipo estéril. </li><li> Centrifugar la suspensión celular (9 ml del paso 1,11) a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar. </li><li> Añadir 50 l de diluirse aloantıgeno pMHC tetrámero de peletizadocélulas (hasta 10 7 células). Mezclar por pipeteo suave. Transferir a un tubo de 5 ml estéril. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2 ml de tipo buffer. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar. </li><li> Resuspender las células en 100 l de tampón especie. Añadir 10 l de cóctel de selección de biotina y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 5 l Magnetic nanopartículas y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2,5 ml especie de amortiguamiento y se mezclan suavemente con la pipeta. Quite 100 l alícuota, traslado al tubo de 5 ml, y mantener en hielo para el análisis de las células pre-enriquecimiento. </li><li> Coloque el tubo de 5 ml que contiene la suspensión celular en el imán de separación de células. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidado la tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, decantar el contenido del tubo en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo aeliminar las últimas gotas de líquido. </li><li> Retire el tubo del imán. Añadir 2 ml de tampón de tipo frío y mezclar suavemente con la pipeta. Muestra de 10 l de suspensión celular, diluir 1: 2 (añadir a 10 l) de azul de tripano para contar las células utilizando un hemocitómetro. </li></ol> 3. Preparación de las células T de células Individual Citometría de Flujo clasificación de células <ol><li> Añadir tampón de tipo frío a todos los tubos de células (tetrámero no marcado, marcado con tetrámero-un enriquecido, y tetrámero marcado enriquecido) para llevar el volumen a 3 ml. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C y el tampón de decantación para recuperar las células. </li><li> Resuspender las células sedimentadas en 25 l de tampón especie frío. Añadir 5 l bloque Fc humana. Incubar en hielo durante 20 min. </li><li> Preparar anticuerpos para la clasificación de citometría de flujo. Mezclar 15 l de tampón especie, 15 l anti-CD5, 15 l anti-CD14, y 15 l anti-CD19. </li><li> Añadir 20 l de mezcla de anticuerpos a cada tubo de las células. Incubar en hielo durante 20 min. </li><li> Añadir 2 ml de tampón de tipo frío a cada tubo. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C y el tampón de decantación para recuperar las células. </li><li> Resuspender las células a una concentración de 1 -2 x 10 6 células / ml en tampón de clasificación. </li><li> Alícuota de 100 l de medio de cultivo de células humanas T (DMEM de Iscove suplementado con 2 mM Glutamax, HEPES 10 mM, 50 mg / ml de gentamicina, 50 mM 2-mercaptoetanol, 10% suero AB humano inactivado por calor, y 2,5 humana recombinante ng / ml IL-2) a cada pocillo de una placa redonda de 96 pocillos de cultivo celular de fondo. Mantener en hielo. </li></ol> 4. Aislamiento de células T tetrámero marcado por celda individual Citometría de Flujo Clasificación <ol><li> Establecer citometría de flujo para identificar los parámetros de compuerta aloantígeno-pMHC tetrámero células T marcados (Figura 2.A). Utilice la fracción tetrámero pre-enriquecimiento etiquetados para establecer gating estrategias para eliminar dobletes, puerta de linfocitos, las células que expresan CD19 excluir B y CD14expresando monocitos, e identificar las células T mediante la expresión CD5. Utilice la muestra no etiquetada con tetrámero como una fluorescencia menos uno de control para establecer la gating para la identificación de las células T tetramer vinculante (con 0% de CD5 + CD14 - CD19 - células de la muestra no etiquetada por tetrámero deben caer dentro de esta puerta) . NOTA: Gating estrategias que no son adecuadamente rigurosas dará como resultado el aislamiento de células no T o células T que no son específicas de antígeno, mientras que las estrategias de compuerta excesivamente restrictivas se reducirá el número de células T aisladas. </li><li> Programar los parámetros de la placa de la célula única especie. Dirigir el clasificador para colocar un CD5 + CD14 - CD19 - tetrámero + células en cada pocillo. Dirigir el plato creado para contener 1 pocillo de control negativo (no hay células ordenadas en el pozo) y 1 control positivo también (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetrámero - células) en cada fila (figura 2.B </strong&gt;). </li><li> Uso de la citometría de flujo establecido gating estrategia y la configuración de la placa, aislar células individuales de unión tetrámero-T directamente en la placa de 96 pocillos usando un clasificador de células por citometría de flujo. </li></ol> 5. Cultura y expansión de clones aloantígeno-específicos de células T <ol><li> Después de la finalización de la clasificación de células, la placa se centrifuga a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Lugar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li><li> Vortex estimulantes microperlas anti-CD3 / anti-CD28 durante 30 segundos para volver a suspender cuentas. </li><li> Calcular el volumen de perlas de activador necesarios para la estimulación de las células T recogidas (0,5 l de microperlas de activador / pocillo). Traslado volumen calculado de cuentas estimuladoras a un tubo de 5 ml estéril. Añadir 1 ml de medio de cultivo de células T humanas y de vórtice. </li><li> Coloque el tubo con la suspensión de microperlas en imán. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidadola tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, contenido del tubo de decantación en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo. </li><li> Retire el tubo del imán. Añadir medio de cultivo de células humanas T (100 medianas l / 0,5 l de microperlas añaden inicialmente). </li><li> Alícuota de 100 l de suspensión de perlas activador a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li><li> Monitorear el crecimiento celular diariamente por examen microscópico. Pequeños grupos de células proliferantes pueden ser observados microscópicamente después de 5 - 7 días de cultivo (Figura 3.A). NOTA: Visualización de cultivos de células T en este punto puede ser difícil, y la ausencia de grupos de células observables en esta etapa puede no ser indicativo de una falta de células T en crecimiento. </li><li> A los 14 días después del aislamiento de células, cultivos de alimentación retirando cuidadosamente 100 l de los medios de comunicación fuera de la parte superior de la cultura y la reemplazan con 100 μ; L fresco T humano medio de cultivo celular. Continuar la incubación de placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li><li> Monitorear el crecimiento celular diariamente por examen y evaluación de el color del medio de cultivo microscópico. Grupos de células grandes deben ser visibles al microscopio 2 - 3 días después de que el cambio de medio. Macroscópicamente, los sedimentos celulares deben ser visibles durante los 14 días siguientes al cambio de medio. </li><li> A los 28 días siguientes de aislamiento de células, identificar clones que crecen por el examen microscópico. Transferir el volumen 200 l de los cultivos en placas de 96 pocillos de crecimiento positivo a pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos que contenía 200 medio de cultivo de células T humanas l. </li><li> Añadir 100 l que contenían 12,5 l de microperlas anti-CD3 / anti-CD28 estimuladoras (preparada como se describe en las secciones 5.2 a 5.6). Incubar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li><li> Monitorear el crecimiento del cultivo a diario por ex microscópicaaminación y evaluación de el color del medio de cultivo. Cuando el cultivo de células T alcanza&gt; 2x10 6 / ml (típicamente 3-5 días después de la re-estimulación, se puede estimar por el día en que los medios de comunicación comienza girando amarillo paja), la cultura transferencia a un pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos y añadir 500 l medio celular humana T. </li><li> En 10 a 14 días seguir re-estimulación, recoger 200 l de cultivo de células T para evaluar aloantıgeno especificidad por citometría de flujo análisis de pMHC tetrámero de unión (mediante la estrategia de etiquetado y la compuerta se describe en las secciones 3 y 4.1). </li></ol> 6. A largo plazo Re-estimulación y Cultura de clones de células T <ol><li> Continuamente re-estimular y expandir los cultivos de células T clonales con la especificidad deseada puede ser cada 14 días. Recoger cultivos de células T en un tubo de 5 ml estéril a 14 días después de la última estimulación microperlas anti-CD3 / CD28. Combinar múltiples pocillos de la misma clon de células T en un solo tubo, hasta un volumen de 2,5 ml. </li&gt; <li> Añadir medio para llevar el volumen final a 2,5 ml y mezclar suavemente por pipeteado. </li><li> Coloque el tubo de 5 ml que contiene el cultivo de células T en el imán de separación de células para eliminar microperlas de edad del cultivo. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidado la tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, decantar la suspensión de células en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo para eliminar las últimas gotas de líquido. </li><li> Añadir medio para llevar el volumen final a 4 ml. Muestra de 10 l para contar las células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Recuperar las células T mediante centrifugación a 600 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Decantar el sobrenadante. Resuspender las células T en 10 6 células / T humanas medio de cultivo celular ml. Transferir 1 ml de alícuotas a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. </li><li> Vuelva a estimular las células T mediante la adición de 100 medios de comunicación l que contenía 12,5 l de estimulante anti-CD3 / amicroperlas nti-CD28 (como se describe en las secciones 5.2 a 5.6). Se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li></ol>

<ol><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li>
<li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li>
<li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+estimation+of+the+human+%CE%B1%CE%B2+T+cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li>
<li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+%CE%B2-chain+diversity+in+%CE%B1%CE%B2+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+T-cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li>
<li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li>
<li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+APCs%2C+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li>
<li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%2B+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li>
<li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li>
<li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection%2C+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li>
<li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li>
<li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La aloreactividad de las células T es un fenómeno largamente estudiado y clínicamente relevante. Las robustas respuestas proliferativas y efectoras de las células T a la estimulación alogénica han permitido un análisis exhaustivo de las respuestas de las células T humanas in vitro a través de reacciones linfocitarias mixtas relativamente sencillas de células T de sangre periférica contra células alogénicas inactivadas. Sin embargo, estas respuestas primarias de células T aloreactivas son oligoclonales, compuesta...

Los linfocitos T son componentes críticos del sistema inmune adaptativo. Las células T son responsables de mediar no sólo directamente respuestas inmunes protectoras a los agentes patógenos a través de una variedad de mecanismos efectores, sino también mantener activamente la auto-tolerancia inmunológica y dirigir las respuestas de otras células en el sistema inmune. Estas funciones están dirigidas a través de un número de señales integradas, incluyendo receptores de células T (TCR) de la ligación, citocinas y quimiocinas, y los metabolitos 1. De estas señales, el TCR es de particular importancia, ya que proporciona la especificidad característica que define el papel de la célula T en la inmunidad adaptativa. Un TCR interactúa con antígenos peptídicos lineales presentados por MHC (HLA ortólogo humano) moléculas (complejos pMHC) de una manera altamente específica y sensible para proporcionar las señales que inician la función efectora de células T. Los parámetros bioquímicos de las interacciones de TCR con ligandos pMHC proporcionan no sólo la especificidad para Tactivación de las células, sino que también tiene un impacto cualitativo en función de la célula posterior T2. Por lo tanto, el estudio de la función de las células T a menudo requiere el examen de las respuestas de las células T clonales con especificidad antigénica definida. El compartimiento humana de células T, que contiene aproximadamente 10 12 células T αβ, contiene un estimado de julio 10 a agosto 10 αβTCRs distintas 3-4. Este diverso repertorio ofrece oportunidad para el reconocimiento de la gran variedad de péptidos de patógenos potenciales que requeriría una respuesta de células T para la inmunidad protectora. Se estima que la frecuencia de células T en respuesta a un antígeno extraño dado presentado por auto-MHC es del orden de 10 -4 a 10 -7 en ausencia de respuesta inmune antes de que el antígeno 5. El repertorio de células T naive está determinada por la selección tímica para asegurar la capacidad de reconocer auto-MHC presentación de antígenos peptídicos y límite reaccionanividad contra antígenos auto-péptido, la maximización de la utilidad potencial para mediar la inmunidad protectora 2. Sin embargo, en violación de esta diseñado reactividad, una frecuencia relativamente grande, 10 -3-10 -4, de las células T de individuos inmunológicamente ingenuos responder a la estimulación con células alogénicas, reconociendo tanto las moléculas MHC extranjeros así como los péptidos endógenos que presentan 6. El reconocimiento de ligandos pMHC alogénicos es estructuralmente similar al reconocimiento de antígenos extraños presentados por auto-MHC; el TCR hace interacciones bioquímicas críticos tanto con la molécula MHC alogénico, así como el péptido presentado 7. La naturaleza robusta de la respuesta de las células T alogénicas a resultados de la estimulación de la diversidad de los complejos pMHC presente en la superficie de las células alogénicas 8. Se estima que cada MHC presenta aproximadamente 2 x 10 4 diferentes antígenos peptídicos endógenos 9. Este breadth de la respuesta a la estimulación alogénica es un aspecto significativo de la patología clínicamente relevantes, tales como el rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped (EICH), como resultado de alorreactividad de células T. Estudio de células T respuestas alorreactivas humanos se ha basado tradicionalmente en el examen de las respuestas policlonales de células T vírgenes después de la estimulación con células alogénicas. La estimulación repetida con la misma línea celular alogénico combinado con análisis de dilución limitante es capaz de generar células T clonales con el reconocimiento alogénico HLA definida de 10. Sin embargo, este enfoque es problemático para el examen de las respuestas a ligandos pMHC alogénicos individuales, como el repertorio amplio y diverso de complejos pMHC endógeno presente durante un determinado alogénico HLA estimula un amplio repertorio de células T. Esta estimulación población mayor y la limitación de la dilución enfoque requeriría de cribado de un gran número de clones para aislar células T con la deseada Reactividad contra un único ligando pMHC. Además, la frecuencia de células T que responden a un ligando pMHC alogénico individual es relativamente baja entre las poblaciones de células T ingenuas, que presenta una barrera para la generación eficiente de clones de células T humanos que responden a un antígeno dado. La identificación y el aislamiento de las células T específicas de antígeno de las poblaciones policlonales se han habilitado por el desarrollo de fluoróforo marcado pMHC multímeros 11. Este enfoque utiliza antígenos peptídicos específicos cargados en moléculas MHC solubles biotiniladas recombinantes, que se etiquetan mediante la unión a un fluoróforo marcado con estreptavidina. La multimerización de pMHC aumenta la avidez, la compensación de la afinidad del TCR intrínsecamente baja (M) para ligandos solubles pMHC. Las células marcadas pueden ser identificados y aislados por citometría de flujo. Sin embargo, este enfoque todavía está limitado por la baja frecuencia de células T específicas de antígeno entre las poblaciones de células T vírgenes, que son típicamenteórdenes de magnitud menor que el límite de la identificación y la cuantificación precisa en la mayoría de los citómetros de flujo. Para abordar esta limitación, un método de etiquetado tetrámero pMHC y posterior enriquecimiento perla magnética para las células tetrámero marcado ha sido desarrollado 12. Este método ha demostrado una detección fiable, enumeración, y el aislamiento de células T específicas de antígeno de baja frecuencia. Este protocolo describe un protocolo eficaz para la generación de clones humanos de células T que responden específicamente a ligandos pMHC alogénicos individuales. El protocolo se aplica pMHC (HLA) etiquetado multímero y enriquecimiento para el aislamiento de células T humanas-aloantígeno específico con citometría de flujo de células de clasificación y un método robusto para el cultivo in vitro de células T humanas para permitir la producción de clones de células T de células clasificadas individuales ( visión general en la Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Tubo de extracción de sangre venosa con heparina sódica 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep Kit de enriquecimiento de células T humanas</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco, 1x sin Ca ni Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina</td> <td>sérica bovinaSigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Tetrámero pMHC marcado con fluoróforos Instalación de</td><td>tetrámeros NIH NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de selección de biotina</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Imán de selección</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Solución</td> <td>de bloqueo de Fc humanoBiolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (clon UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (clon HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 FITC (clon HIB19)</td><td>Biolegend</td><td>302205</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de Iscove, sin b-ME ni L-glutamina</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Suero Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Human AB, donante masculino</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Activador T Humano CD3/CD28</td><td>Vida Tecnologías</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Medios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td><td></td>de clasificación de células</tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr> Medio de <tr><td>cultivo</td><td></td><td></td><td></td>de células T</tr><tr><td>humanas DMEM de Iscove</td><td>351,6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero AB humano inactivado por calor</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>0,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol (14,3 M)</td><td>1,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de células t humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

El estudio de la biología de los linfocitos T humanos a menudo implica el examen de las respuestas a los ligandos activadores. Las células T reconocen y responden a los antígenos peptídicos procesados presentados por las moléculas MHC (HLA ortólogo humano) a través del receptor de células T (TCR) de una manera altamente sensible y específica. Mientras que la función principal de las células T es mediar las respuestas inmunitarias protectoras a los antígenos extraños presentados por el autoMHC, las células T responden de forma robusta a las diferencias antigénicas en los tejidos alogénicos. Las respuestas de las células T a los aloantígenos pueden describirse como aloreactividad directa o indirecta. En la aloreactividad, la célula T responde a través del reconocimiento altamente específico tanto del péptido presentado como de la molécula MHC. La robusta respuesta oligoclonal de las células T a la estimulación alogénica refleja el gran número de aloantígenos potencialmente estimuladores presentes en los tejidos alogénicos. Si bien la amplitud de las respuestas de los linfocitos T aloreactivos es un factor importante en el inicio y la mediación de la patología asociada con las respuestas aloreactivas biológicamente relevantes, como la enfermedad de injerto contra huésped y el rechazo del aloinjerto, puede impedir el análisis de las respuestas de los linfocitos T a los ligandos alogénicos. Con este fin, este protocolo describe un método para generar células T aloreactivas a partir de leucocitos de sangre periférica humana (PBL) naïve que responden a aloantígenos peptídicos-MHC (pMHC) conocidos. El protocolo aplica el marcaje de multímeros pMHC, el enriquecimiento magnético de perlas y la citometría de flujo a los métodos de cultivo in vitro de una sola célula para la generación de clones de células T específicas de aloantígenos. Esto permite estudiar la bioquímica y la función de las células T que responden a la estimulación alogénica.

Este protocolo describe la generación de cultivos de células humanas T clonal con aloantígeno especificidad definida a través de un enriquecimiento de perla magnética y flujo de una sola célula de clasificación de citometría de estrategia. La Figura 1 proporciona un esquema del proceso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> Figura 1: Visión general de Protocolo El protocolo aquí d...

Este artículo describe un método para la generación y propagación de clones de células T humanas que responden específicamente a un aloantígeno definido. Este protocolo se puede adaptar para la clonación de células T humanas específicas para una variedad de ligandos péptidos-MHC.

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar, aislar y clonar células T humanas con una especificidad definida de todos los antígenos. Esto se logra aislando primero los linfocitos T de la sangre periférica completa mediante centrifugación en gradiente de densidad. En el segundo paso, las células T específicas del antígeno allo se marcan con péptido conjugado de cuatro flúores, HLA, tetrámeros y se enriquecen mediante separación magnética.A continuación, las células T marcadas se aíslan mediante la clasificación de células por citometría de flujo de una sola célula. Finalmente, los cultivos unicelulares se estimulan con anticuerpos anti CD 3 y anti CD 25. En última instancia, la aloreactividad de las células T específicas del antígeno puede evaluarse mediante un análisis de citometría de flujo.La principal ventaja de esta técnica frente a otras técnicas como la estimulación masiva de linfocitos y la limitación de la dilución es que permite la generación de clones de células T con reactividad específica a todos los antígenos bien definidos. Generalmente, las personas que son nuevas en este método pueden tener dificultades en el cultivo y la expansión de los clones de células T. Esto requiere un cuidadoso monitoreo diario de los cultivos antes de comenzar el procedimiento.Alícuota de cuatro mililitros de gradiente de densidad a temperatura ambiente en dos a cuatro tubos de centrífuga cónicos estériles de 15 mililitros utiliza etanol al 70% para limpiar el exterior de uno o dos tubos de recolección de sangre con tapa verde llenos que contienen sangre de un voluntario sano y luego retire con cuidado las tapas, decantar la sangre en un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros, y luego res cada tubo de recolección con 10 mililitros de PBS. Agrupar los lavados con la sangre entera decantada y mezclar una solución suavemente, luego incubar las células con 25 microlitros de cóctel de enriquecimiento de células T humanas por dos mililitros de volumen total de sangre diluida. Después de 20 minutos, use una pipeta de 10 mililitros para colocar hasta 10 mililitros de sangre suavemente sobre el medio de gradiente de densidad, teniendo cuidado de no alterar la superficie del gradiente.Centrifugar las células durante 10 minutos y luego usar una pipeta de cinco mililitros para transferir cuidadosamente la capa de leucocitos de la interfaz del gradiente de densidad y el plasma diluido a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Lleve el volumen de los linfocitos de sangre periférica recolectados hasta 50 mililitros con PBS y mezcle suavemente la suspensión celular. A continuación, cuente las células y retire una alícuota de un mililitro para su análisis.A continuación, después de centrifugar las células, suspenda los gránulos en un mililitro de tampón de citometría de flujo y mezcle 50 microlitros del péptido de antígeno alo diluido MHC tetrámero en la suspensión celular. Transfiera las células a un tubo estéril de cinco mililitros y luego, después de 30 minutos, lave las células en dos mililitros de tipo tampón resus. Suspender el paladar en 100 microlitros de tampón y luego incubar las células en 10 microlitros de cóctel de selección de biotina durante 15 minutos.A continuación, incube las células en cinco microlitros de partículas magnéticas durante 10 minutos y luego mezcle suavemente la suspensión celular con 2,5 mililitros de tampón. Retire una alícuota de análisis de 100 microlitros de las células de enriquecimiento de acicalamiento y luego coloque el tubo en el imán de separación celular. Después de cinco minutos, sostenga el tubo y el imán juntos y decante el contenido en un tubo nuevo de cinco mililitros.A continuación, retire el tubo del imán y lave las células en dos mililitros de tampón de clasificación, vuelva a suspender el pellet en un tampón de clasificación en frío y alícuota las células en dos mililitros de tampón de clasificación en frío por tipo de muestra. Después de volver a centrifugar las muestras, vuelva a suspender los gránulos en 25 microlitros de tampón de clasificación en frío e incube las células en cinco microlitros de bloque de FC humano en hielo durante 20 minutos. A continuación, incube los tubos con 20 microlitros del cóctel de anticuerpos adecuado.Después de 20 minutos, lave las células en dos mililitros más de tampón de clasificación en frío y vuelva a suspender los gránulos a una a 2 millones de células por mililitro. En más tampón, alícuota 100 microlitros de medio de cultivo de células T humanas en cada pocillo de una placa de cultivo celular de fondo redondo de 96 pocillos y almacene la placa en hielo hasta que se haya completado la clasificación. Después de clasificar, centrifugar la placa y luego colocar las celdas a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2 al 6%.A continuación, mezcle el volumen adecuado de perlas activadoras mediante vórtice y transfiera el volumen adecuado de perlas a un tubo estéril de cinco mililitros. Después de lavar las perlas en el imán, decantar la solución de lavado y agregar 100 microlitros de cultivo de células T humanas, medio por cada 0,5 microlitros de microperlas al tubo. A continuación, alícuota 100 microlitros de la suspensión de perlas activadoras a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y devuelva las células a la incubadora.Se pueden observar microscópicamente pequeños grupos de células proliferantes después de cinco a siete días de cultivo, 14 días después del aislamiento celular. Reemplace cuidadosamente 100 microlitros de medios de la parte superior de los cultivos con 100 microlitros de cultivo de células T humanas frescas. Los grupos de células medianamente grandes deben ser visibles microscópicamente dos o tres días después de la alimentación, macroscópicamente los gránulos de células deben hacerse visibles durante los 14 días siguientes al cambio de medio.Después de 28 días después del aislamiento celular, transfiera todo el volumen de 200 microlitros de los cultivos positivos para el crecimiento a pocillos individuales de una placa de cultivo de tejido de 48 pocillos que contenga 200 microlitros de medio de cultivo de células T humanas. A continuación, añada 12,5 microlitros de las microesferas estimuladoras anti CD 3, anti CD 28 en 100 microlitros de medio de cultivo de células T humanas, y devuelva la placa a la incubadora de tres a cinco días después de la reestimulación. El medio debe comenzar a volverse amarillo pajizo.En este punto, transfiera los cultivos a pocillos individuales de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos y agregue 500 microlitros de medio de células T humanas a cada cultivo. Finalmente, a los 10 a 14 días después de la reestimulación, recoja 200 microlitros de cada cultivo de células T para evaluar su especificidad de antígeno allo mediante un análisis de citometría de flujo de su péptido. Unión de tetrámero MHC: El rendimiento esperado de los linfocitos T específicos del antígeno alogénico dependerá del donante, del antígeno allo utilizado y de la frecuencia correspondiente de linfocitos T reactivos en el donante.Por ejemplo, un donante sano promedio tendrá de 4.500.000 a 10 millones de leucocitos por mililitro de sangre, de los cuales aproximadamente el 20% son linfocitos T. Estos diagramas de puntos ilustran los resultados de la medición de la unión de las células T de un donante HLAD cuatro negativo a un antígeno alogénico específico. Por ejemplo, en este experimento, se enumeró una frecuencia de una de cada 4.776 células T específicas de antígeno allo de un número inicial de 20 millones de leucocitos de esta población de células iniciales.Se pudo aislar 88 linfocitos T marcados con temer individuales y, después de dos rondas de estimulación y cultivo con microperlas, se identificaron dos cultivos positivos para el crecimiento mediante un examen microscópico y se evaluó su especificidad de allo antígeno mediante el examen de su unión al A 2 30 48 HLA DR. Cuatro tetrámeros. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear los cultivos celulares diariamente para evitar la muerte celular y el crecimiento excesivo de los cultivos. Siguiendo este procedimiento, los clones de células T se pueden utilizar para responder a preguntas adicionales, como examinar la bioquímica del reconocimiento alogénico de ligandos y cómo se traduce en respuestas inmunitarias efectivas.

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este artículo describe una técnica simple para inducir aloantígenos específicos de anergia en las células mononucleares de sangre periférica. La técnica puede aplicarse clínicamente para generar no aloreactivas células del donante. La infusión de estas células podría mejorar la reconstitución inmune y reducir la toxicidad después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

La inducción de anergia aloantígenos específicos en las células mononucleares de sangre periférica mediante estimulación aloantígeno con bloqueo de señales co-estimuladoras

Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

Se describe un ensayo de diagnóstico valiosa que potencialmente podría ser utilizado para decidir la retirada de la inmunosupresión después del trasplante sin riesgo elevado de rechazo del injerto. El ensayo utiliza los principios de la hipersensibilidad de tipo retardado y proporciona una evaluación precisa de ambos donantes respuestas inmunes efectoras y reglamentarias específicas montados por los destinatarios.

Trans-vivo hipersensibilidad de tipo retardada Ensayo para Antigen Reglamento Específico

Aquí describimos un ensayo de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) para cuantificar el inmunosupresor tacrolimus en manchas de sangre seca utilizando un paso simple de precipitación manual de proteínas y extracción en columna en línea.

Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS

Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Este documento describe un método para medir alorreactividad en una población mixta de células T usando flujo de imágenes citometría.

La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo

Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

En este artículo se describe un método para generar un método para generar un antígeno tumoral funcional específico de antígeno pluripotente derivado de células madreCD8- + células T positivas únicas utilizando el sistema de cocultivo OP9/DLL1.

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14+ humanos

Aprende a generar clones de células T humanas aloantígeno-específicas a partir de sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de densidad, separación magnética y citometría de flujo. Este método permite estudiar respuestas inmunitarias específicas.

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

Explorar más videos