Name: Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Erfahren Sie, wie Stammzelleigenschaften in menschlichen Ovarialkarzinomzellen mit Einzel- und Multizell-Sphärenassays bewertet werden. Einzelzellbasierte Assays liefern genauere Ergebnisse zur Krebsstammzellidentifizierung.

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Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) unterstützt, das C.L. Wir danken Dr. Martina Konantz für den kritischen Input und die Begutachtung des Manuskripts. Wir danken Emmanuel Traunecker und Toni Krebs von der DBM FACS Facility (Universitätsspital Basel) für die Unterstützung bei der FACS-Sortierung.

1. Erzeugung von OVCAR-3 Human Ovarialkarzinomzellen Stabil mit Lentiviren Beinhaltet den SOX2 Regulatory Region Reporterkonstrukt Transduzierte <ol><li> Generieren lentivirale Partikel durch Transfizieren der HEK 293T-Verpackungszelllinie mit einem Reporter-Konstrukt Erkennen eines SOX2 regulatorische Region, wie beschrieben 10,21. HINWEIS: Die Reporter-Konstrukt weiterhin enthält eine Destabilisierung Domäne des ProteoTuner Schild-System vor dem tdTomato fluoreszierendes Protein. Shield1 bindet zur Destabilisierung Domäne wodurch das Proteasom, das Fluoreszenzprotein 22 abbauen zu verhindern. </li><li> Transduzieren OVCAR-3-Zellen mit lentivirale Partikel über einen Zeitraum von 24 Stunden. Danach das Virusüberstand und die Zellen werden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in komplettem Medium (RPMI, ergänzt mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin). </li><li> 48 Stunden später wurden 10 ug / ml puromycin wurden zu den Kulturen zugegeben und für 5 Tage gehalten, um die Auswahl richtig transduzierten Zellen zu ermöglichen. </li></ol> 2. Herstellung der Zellsortierung und Oberflächen <ol><li> Fügen Shield1 bei 1: 1.000-Verdünnung 24 Stunden vor der Zellsortierung. Verwenden stabil transduzierten OVCAR-3-Zellen ohne Shield1 Behandlung als negative Kontrollen (Figur 1). Absaugen Medien aus Kolben, waschen Sie die Zellen mit 1 × PBS und trypsinieren Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA für 3 min. </li><li> Stoppen Trypsin unter Verwendung Vollmedium (siehe oben), zu zählen Zellzahlen Zentrifuge Zellen bei 300 · g bei RT (15 - 25 ° C) für 5 min. </li><li> Dekantieren und resuspendieren Zellen vorsichtig in 0,5-1 ml sterilem PBS. </li><li> Verwenden Sie 40 um Zellsieb Kappe Filter auf Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Passen Zellzahl von 5 Millionen Zellen pro ml. </li><li> Bereiten ultra low-Befestigungsplatten mit 96 Vertiefungen mit 100 &amp; mgr; l Kugeln Medium (MEGM ergänzt mit Wachstumsfaktoren, Cytokine und Ergänzungen,B-27, Heparin-Natrium; oder DMEM / F12 mit Wachstumsfaktoren, Cytokine und Ergänzungen, B-27, Heparin-Natrium mit oder ohne Zugabe von 1% Methylcellulose ergänzt, siehe auch Tabelle 1). Gegebenenfalls Antibiotika, hinzugefügt werden zu dem Medium in einer Konzentration von 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, um das Risiko einer möglichen Kontamination minimieren. </li><li> Sortieren RFP + und RFP- Zellen in vorbereitete Platten mit 96 Vertiefungen von oben, 1 Zelle pro Vertiefung (Einzelzellbasis Kugeln Assay) und 100 Zellen pro Vertiefung (multi zellbasierten Assay Kugeln) sind. Führen Art auf handelsüblichen Zellsortierer (siehe Materialien) mit Einzelzellenmodus, Setup Sortieren: 100 μ Düse, Manteldruck 20 psi und Ertrags Maske 0, Reinheit Maske 32, Phasenmaske 16. </li><li> Beurteilen Plattierungseffizienz von mikroskopisch scoring Vertiefungen mit Zellen (für die einzelnen Assays auf Zellbasis) und durch Zählen der Zellzahlen in einzelnen Vertiefungen (für die Mehr Assay auf Zellbasis, Figur 2 </strong&gt;). </li><li> Zellen unter Standardbedingungen in Bereichen mittlerer inkubieren (Zusammensetzung siehe Schritt 2.6) bei 37 ° C und 5% CO 2. Ergänzung täglich bFGF (20 ng / ml) und EGF (20 ng / ml). </li><li> Nach einer Woche zählen Anzahl von Schwellentumorsphären mit einem Standard-Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung oder 4X und einem Fluoreszenzmikroskop zur Fluoreszenzsignal von der integrierten Reportersystem zu erkennen. Graf Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 100 um als &quot;große&quot; Kugeln und Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 100 um, wie &quot;klein&quot; Kugeln (Abbildung 3). Achten Sie darauf, dass Sie echte Kugeln zu zählen und Cluster nicht zell. HINWEIS: In einzelnen Assays auf Zellbasis Kugelbildung ist einfacher zu mikroskopisch nach 10 (Vergleich 7) Tagen Kultur erzielen. </li><li> Berechnen des Anteils der Kugel bildenden Zellen in RFP + bzw. RFP- Zellen in einzelnen Assays auf Zellbasis (eine Platte mit 96 Vertiefungen für jedes einzelne Experiment) oder Mehrfachzelle-baSED Kugeln Assays (Eine Vertiefung für jedes einzelne Experiment), wie von Shaw et al. 16 HINWEIS: Anteil der Kugel bildenden Zellen (%) = (Anzahl der Kugeln) / (Zahl der ausgesäten Zellen) × 100 </li></ol> 3. Serien Passagieren von Kugeln <ol><li> Platzieren Sie den Inhalt jedes Wells in einer geeigneten sterilen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 10 min bei RT. Bei mehrzellbasierten Assays Kugeln, sammeln gemeinsam die Kugeln von einem gut. Mit PBS und zentrifugieren 2 Minuten mehr 5 Mal - Waschen Sie die gut 3. Für einzelne zellbasierten Assays Kugeln, sammeln einzelnen Kugeln. Aufgrund der geringen Anzahl von Zellen, verwendet 1,5 ml Röhrchen für Zentrifugation und Waschschritten. </li><li> Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 &amp; mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA. </li><li> Um ein optimales Zelltrennung zu erreichen, Inkubation der Zellsuspension bei 37 ° C für 5 min in einem weichen Schüttler. Optimieren Trypsinierung Zeit für Ihre Zelllinie zu niedrigeren Zellsterberate: wenn keine großenSphären sichtbar verreiben vorsichtig mit einem 100 ul Pipettenspitze. Im Fall sind große Kugeln noch vorhanden, Inkubation mit Trypsin weitere 3 min und dann dem Verreiben Schritt. Bei Einzelzellbasierte Assays stellen Sie sicher, um die Zeit für eine optimale Zellausbeute von lebenden Zellen während der Trypsinierung Schritt optimieren. </li><li> Um das Trypsin zu inaktivieren, 500 &amp; mgr; l vollständiges Medium und Zentrifugation bei 300 g für 10 min, im Falle der Einzelzellassays Zentrifuge für weitere 2 min. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren Zellen vorsichtig in Sphären Medium. </li><li> Verwenden Sie eine 40 um Zellsieb Kappe Filter, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> In dem Fall der Verwendung RFP + und RFP- Zellen in Mehrzellen bassed Assays beurteilt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen in jeder Vertiefung nach Resuspendierung über Durchflusszytometer Analyse. </li><li> Für serielle replating Tests von Einzelzellen, Samen 1-Zelle pro Vertiefung in eine neue Ultra-Low-Befestigung Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt, wie oben beschrieben. Von einer einzelnen Kugel, Saatgut rund 20 Einzelbecken. Für replating Tests von Multi zellbasierten Primär Kugeln, von einem gut von primären Sphären erhalten Samenzellen in eine neue Platte mit 96 Vertiefungen und zählen Sie die Zellzahl am nächsten Tag durch Mikroskopie. </li><li> Beurteilung der Anteil der Kugel bildenden Zellen in der Sekundärkugeln Tests unter Verwendung des in Schritt 2.11 beschriebenen Formel. </li></ol> 4. Ergebnis-Analyse <ol><li> Analysieren Ergebnisse von Experimenten in unabhängigen dreifach durchgeführt und mit zweiseitigen Student-t-Test, um normal verteilt Werte und ansonsten Mann-Whitney-Tests für die statistische Analyse zu untersuchen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Spheres Kulturen sind eine weit verbreitete Methode, um zu untersuchen Krebsstammzellpotential und bereichern für stielartigen Zellen in einer breiten Palette von menschlichen Tumorzellen 15,25,26. Unter diesen Kulturbedingungen werden die Krebszellen, die Selbsterneuerung Fähigkeit fehlt voraussichtlich zu differenzieren und schließlich Zelltod. Obwohl sie zunächst bilden Zellhaufen oder auch Tumorsphären vor allem in der Grund Assays, sind sie nicht in der Lage, Kugel bildende Fähigkeit auf serielle replati...

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Ovarialkarzinome aus heterogenen Zellmischungen bestehen und sogenannte "Krebsstammzellen" (CSCs) beherbergen, die für die Initiierung, Aufrechterhaltung und den Rückfall nach konventionellen zytotoxischen Therapien verantwortlich sind1-3. Daher ist die Entwicklung molekularer Strategien, die auf ovarielle CSCs abzielen, ein wichtiges Ziel und verspricht, die Therapie von Patientinnen mit Eierstockkrebs zu verbessern.
Eine Voraussetzung für das Verständnis der molekularen Eigenschaften von CSCs ist ihre zuverlässige Isolierung von den Nicht-CSCs. Die Identifizierung von ovarialen CSCs scheint jedoch eine Herausforderung zu sein. Während berichtet wurde, dass die CD133-Expression und die Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDH)4,5 ovarielle CSCs markieren, deuten einige Daten darauf hin, dass diese Marker instabil sind6. Konsistent ist, dass bei Eierstockkrebs, anders als beispielsweise beim Mammakarzinom7, die Expression von ALDH1 mit einem günstigen Ergebnisassoziiert 8 und die Expression der vorgeschlagenen Stammzellmarker-Variante CD44 keinen prognostischen Werthat 9. In jüngerer Zeit haben wir gezeigt, dass die Expression des embryonalen Stammzellproteins SOX2 den Eierstockkarzinomzellen Stammzellen Immunität verleiht10 und eine hohe SOX2-Expression mit klinisch aggressiven Ovarial- und Mammakarzinomen assoziiertist 11,12. Daher verwenden wir in diesem Bericht ein lentivirales Reporterkonstrukt, das ein rotes Fluoreszenzprotein (RFP) enthält, dessen Expression durch eine SOX2-regulatorische Region gesteuert wird, als Methode zur Isolierung putativer ovarieller CSCs.
Per Definition können CSCs sich sowohl selbst erneuern als auch differenzieren, wodurch alle Tumorzelltypen entstehen. Mutmaßliche CSC-Populationen müssen in funktionellen Assays analysiert werden, die in vivo durchgeführt werden. Aus offensichtlichen Gründen sind solche Funktionstests in menschlichen Zellen auf Xenotransplantat-Assays beschränkt, die hauptsächlich die Transplantation menschlicher Tumorzellen in immungeschwächte Mäuse umfassen10,13.
Eine alternative in vitro-Methode wurde von Brent Reynolds und Sam Weiss angeboten, die zuerst den sogenannten Neurosphären-Assay als Surrogat-Assay zur Bewertung des Stammpotenzials in Nervenzellen berichteten14. Dontu und Kollegen bestätigten später die Verwendung dieses Assays zur Bewertung des Stammzellpotenzials in Brustzellen15,16. Hier wurden humane Brustzellen in unterschiedlicher Anzahl in serumfreiem Medium plattiert, das mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), B-27 und Heparin ergänzt wurde, und unter nicht-adhärenten Bedingungen sieben bis zehn Tage lang kultiviert, bevor die Kugelbildung mikroskopisch bewertet wurde. Nach diesem Protokoll mit einigen Anpassungen der Zellzahl, des Wachstumsmediums und der Nahrungsergänzungsmittel haben mehrere Gruppen das Potenzial von In-vitro-Stammzellen aus verschiedenen Krebsarten wie Brust17, Gehirn18, Bauchspeicheldrüse19 und Dickdarm20 untersucht. Beim Ovarialkarzinom haben wir kürzlich über die Machbarkeit des Spheres-Assays berichtet und seine Ergebnisse mit denen verglichen, die in in vivo-Xenotransplantatmodellen von Mäusen gesammelt wurden10. Wir fanden heraus, dass die Überexpression des Stammzellproteins SOX2 sowohl die in vitro Kugelbildung als auch die in vivo Tumorigenität von humanen Ovarialkarzinomzellen erhöhte10. Die Häufigkeit von Sphären-initiierenden Zellen war jedoch höher als die Häufigkeit von tumorinitiierenden Zellen, die in vivo gemessen wurden 10, was darauf hindeutet, dass entweder der Kugel-Assay aus technischen Gründen zu falsch positiven Ergebnissen führen kann oder alternativ der in vivo-Assay ineffizient sein und zu falsch negativen Ergebnissen führen kann.
In diesem Bericht analysieren wir Multizell-basierte Ovarialsphären-Assays detaillierter, überprüfen die verschiedenen in der Literatur verfügbaren Protokolle und vergleichen sie mit einem einzelzellbasierten Assay. Wir zeigen, dass der einzelzellbasierte Assay genauere und reproduzierbare Ergebnisse liefert als multizellbasierte Assays, die stark von der Dichte der plattierten Zellen beeinflusst werden können, es sei denn, den Kulturen wird Methylcellulose zugesetzt, um die Zellen zu immobilisieren. Aber auch in einzelzellbasierten Assays wird das in vitro Sphären-initiierende Potential häufiger beobachtet als in vivo das tumor-initiierende Potential.

<table><tbody><tr><td>Platte mit niedrigem Aufsatz</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td></td><td>Lonza CC-4136</td><td>SingleQuots&trades; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Endkonzentration: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>Endkonzentration: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen/ Gibco</td><td>17504-044</td><td>Endkonzentration: 1X</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-25000 IE</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>Verdünnung 1:1.000</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td>632189</td><td>Verdünnung 1:1.000</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (Pulver)</td><td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Puromycindihydrochlorid</td><td>Applichem</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>Zelle Sortierer</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III Zellsortierer</td></tr><tr><td>FACS Analysator</td><td>BD</td><td></td><td>Accuri c6 Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

bewertung der stammzelleigenschaften in menschen ovarialkarzinomzellen mit multi und single cell-basierte assays spheres

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Jahrelange Forschung zeigt, dass Eierstockkrebs eine heterogene Mischung von Zellen beherbergt, einschließlich einer Subpopulation von sogenannten "Krebsstammzellen" (CSCs), die für die Entstehung, Aufrechterhaltung und den Rückfall von Tumoren nach konventionellen Chemotherapien verantwortlich sind. Die Identifizierung von ovarialen CSCs ist daher ein wichtiges Ziel. Eine häufig verwendete Methode zur Beurteilung des CSC-Potenzials in vitro ist der Kugel-Assay, bei dem Zellen unter nicht adhärenten Kulturbedingungen in einem serumfreien Medium, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt ist, plattiert und die Kugelbildung nach einigen Tagen bewertet wird. Hier überprüfen wir die derzeit verfügbaren Protokolle für Assays von menschlichen Eierstockkrebssphären und führen eine Side-by-Side-Analyse zwischen häufig verwendeten Multizell-basierten Assays und einem genaueren System auf Basis von Einzelzell-Plating durch. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl mehrzellbasierte als auch einzelzellbasierte Kugel-Assays zur Untersuchung der Kugelbildung in vitro verwendet werden können. Die aufwendigeren und teureren einzelzellbasierten Assays eignen sich besser für die funktionelle Bewertung einzelner Zellen und führen zu insgesamt genaueren Ergebnissen, während mehrzellbasierte Assays stark von der Dichte der plattierten Zellen beeinflusst werden können und im Vorfeld Titrationsexperimente erfordern. Die Methylcellulose-Supplementierung zu multizellbasierten Assays kann effektiv eingesetzt werden, um mechanische Artefakte zu reduzieren.

Bei herkömmlichen Sphären Assays fast 40% der RFP + OVCAR-3-Zellen gegenüber 20% der RFP- Zellen führte zu einer individuellen Tumorbereich in der primären Kügelchen Assay (4A). Darüber hinaus waren die Bereiche, die durch RFP + Zellen gebildet Größe als die RFP- Zellen größer ausgebildet. Beim Betrieb in Tests auf Zellbasis überzogen, RFP + Zellen ebenfalls gebildet mehr Kugeln als RFP- Zellen bestätigt die obigen Ergebnisse. Allerdings gab es eine Tendenz zur Erzeugung von...

In-vitro-Kugel-Assays werden häufig verwendet, um Krebsstammzellen zu identifizieren. Hier vergleichen wir Einzel- mit Multizell-basierten Kugel-Assays. Die aufwendigeren einzelzellbasierten Assays oder die Methylcellulose-Supplementierung liefern genauere Ergebnisse, während mehrzellige Assays, die in flüssigem Medium durchgeführt werden, stark von der Zelldichte beeinflusst werden können.

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Stammzelleigenschaften von humanen Ovarialkarzinomzellen mit Hilfe von Multi- und Einzelzell-basierten Kugel-Assays zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst SOX-Zellen mit zwei Reporter-RFP-Lentiviren ausgewählt werden, die durch Pur-Mycin-Behandlung transduziert werden. Im zweiten Schritt werden die RFP-positiven und RFP-negativen Zellen isoliert und als Einzel- oder Mehrzellkolonien pro Vertiefung plattiert. Als nächstes wird die primäre Kugelbildung mikroskopisch analysiert und dann werden die primären Kugelkulturen dissoziiert und für die Analyse der sekundären Kugelbildung neu plattiert.Letztendlich werden diese Kugel-Assays verwendet, um den Anteil der mutmaßlichen Eierstockkrebs-Stammzellen zu berechnen, die eine Kugelbildungskapazität aufweisen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Krebsstammzellen zu beantworten, z. B. welche potenziellen Krebsstammzellpopulationen es gibt und wie hoch die Häufigkeit im gesamten Tumorbeutel ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die Identifizierung von Stammzellen von Eierstockkrebs geben kann, kann sie auch zur Isolierung von Krebsstammzellen aus anderen soliden Tumorentitäten wie dem Mammakarzinom angewendet werden.24 Stunden nach der Transduktion menschlicher Ovarialkarzinomzellen mit lentiviralen Partikeln ist der Virusüberstand zu entfernen und die Zellen in PBS-Kultur zu waschen. Die Zellen sind 48 Stunden lang in vollständigem Medium. Wechseln Sie dann das Medium und fügen Sie nach fünf Tagen 10 Mikrogramm pro Milliliter Piro Mycin hinzu.Behandeln Sie die Kulturen am nächsten Tag mit Schild in einer Verdünnung von eins bis 1000. Waschen Sie die Zellen in PBS und lösen Sie sie dann mit 0,05 % Trips in EDTA. Stoppen Sie die Reaktion nach drei Minuten mit vollständigem Medium.Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 0,5 bis einem Milliliter sterilem PBS und seihen Sie dann die resultierende Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Filter. Stellen Sie die Zellen auf eine Verdünnung von fünf mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter ein und fügen Sie dann 100 Mikroliter Kugeln Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem geringer Bindung als nächstes für einen einzelzellbasierten Kugel-Assay hinzu.Verwenden Sie den Einzelzellenmodus, um eine Zelle in jede Vertiefung der Platte zu sortieren. Bewerten Sie dann die Zellen mikroskopisch, um die Beschichtungseffizienz zu beurteilen. Inkubieren Sie die Zellen in frischen Kugeln, Medium bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 mit täglicher Supplementierung des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors und des epidermalen Wachstumsfaktors.Nach einer Woche wird lichtmikroskopisch die Anzahl der entstehenden Tumorsphären und das Vorhandensein des Fluoreszenzsignals aus dem integrierten Reportersystem fluoresziert. Zählen Sie die Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 100 Mikrometern als große Kugeln und die Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 100 Mikrometern als kleine Kugeln. Achten Sie darauf, echte Kugeln und keine Zellcluster zu zählen.Berechnen Sie dann den Anteil der Kugel, die RFP-positive oder RFP-negative Zellen gemäß der Formel zum Durchgang bildet. Die Kugeln beginnen damit, den Inhalt jeder Vertiefung in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Spülen Sie dann jede Vertiefung drei- bis fünfmal mit PBS aus, um sicherzustellen, dass alle Kugeln gesammelt sind, und schleudern Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur herunter.Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Schlinge und die Wiederbelebung und suspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern 0,05 % EDTA bei 37 Grad Celsius in einem weichen Shaker für fünf Minuten. Wenn nach fünf Minuten keine großen Kügelchen sichtbar sind, tritrieren Sie die Zelllösung vorsichtig mit einer 100-Mikroliter-Pipettenspitze und fügen Sie 500 Mikroliter vollständiges Medium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Spin-Down-Zellen resuspendieren die Pellets vorsichtig in Kugelmedium und leiten die resultierende Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Filter ab, wie gerade bewertet.Schließlich wird für die serielle Replattierung der Einzelzellen einzelne Zellen aus einer Primärkugel in 100 Mikrolitern Kugeln, Medium pro Well, in einer neuen 96-Well-Platte mit extrem geringer Bindung gesät. Verwenden Sie dann die gleiche Formel wie für den Primärkugel-Assay, um den Anteil der kugelbildenden Zellen in den sekundären Kugeln zu bewerten. Assays in mehrzellbasierten Sphären führten zu einer individuellen Tumorsphäre im Assay von fast 40 % der RFP-positiven humanen Ovarialkarzinomzellen im Vergleich zu nur 20 % der RFP-negativen Zellen zu einer individuellen Tumorsphäre im primären Sphären-Assay.Überraschenderweise wird eine höhere Anzahl von Kugeln aus einer geringeren Anzahl plattierter Zellen sowohl in MGEM- als auch in D-M-E-M-F 12-basierten Medien gezählt, was zeigt, dass die Plattierungsmodalitäten die Ergebnisse in diesem Assay stark verzerrt haben. Im Gegensatz dazu ist bei der Immobilisierung von Zellen durch die Zugabe von 1%Methylcellulose die Effizienz der Kugelbildung in mehrzellbasierten Kugelkulturen weitgehend unabhängig von der Zelldichte. Etwa 35 % der Zellen aus den RFP-positiven Kugeln verlieren nach siebentägiger Kultur ihr rot fluoreszierendes Signal, was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine Differenzierung durchlaufen haben, während über 65 % der Zellen ein RFP-Signal behalten, was auf eine Selbsterneuerungsfähigkeit hindeutet.Im Gegensatz dazu bleiben Zellen aus Kugeln, die aus anfänglich RFP-negativen Zellen erzeugt wurden, RFP-negativ, was darauf hindeutet, dass sie unter diesen Bedingungen das Stammzellpotenzial nicht wiederherstellen können. Die Fluoreszenzmikroskopie an Kugeln, die aus einzelnen Zellen erzeugt wurden, bestätigt diese Daten und zeigt, dass einzelne Kugeln, die von RFP-positiven Zellen abgeleitet wurden, sowohl RFP-positive als auch RFP-negative Zellen enthalten. Während Kugeln, die von RFP-negativen Zellen abgeleitet werden, nach diesem Verfahren das Fehlen eines roten Signals behalten.Andere Methoden wie Antikörper, Färbung oder Genexpressionsanalyse mittels Quantit-PCR können durchgeführt werden, um die Zellen mit hoher Bildungsfähigkeit weiter zu charakterisieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass In-vivo-Transplantationsassays an immunsupprimierten Mäusen durchgeführt werden müssen, um die Tumorstammzelleigenschaften der Kugel-initiierenden Zellen zu validieren.

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Forschung

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Dieses Video zeigt, Protokoll der Isolierung und Expansion von Stammzellen, wie Zellen, die aus operativ entfernt menschlichen Glioblastom mutliforme (GBM) Tumorgewebe mit dem Neurosphäre Assay Kultur-Methode.

Isolation und Expansion der menschlichen Glioblastoma multiforme Tumorzellen unter Verwendung der Neurosphäre Assay

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Krebsstammzellen (CSCs) in Tumorrückfall durch Chemoresistenz beteiligt ist. Wir haben ein Protokoll für die Auswahl und den Ausbau von CSCs von Eierstock-Krebszelllinien optimiert. Durch die Behandlung mit dem Chemo Zellen Cisplatin und Kultivierung in einer Stammzelle Förderung der Medien bereichern wir für nicht haft CSC Kulturen.

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Schwimmende Mammosphären-Assays können die Untergruppe von stammähnlichen Brustkrebszellen untersuchen, die unter Suspensionsbedingungen überleben und eine erhöhte Tumorgenese zeigen, wenn sie in Mäuse implantiert werden.  Dieses Protokoll bietet eine bequeme in vitro Messung der kugelbildenden Fähigkeit, einen Proxy für die in vivo Tumorgenese, und erleichtert gleichzeitig die Analyse der stammassoziierten Transkriptionslandschaft.

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Pankreaskrebs-Stammzellen (CSCs) können in vitro mit der Verankerungsunabhängigen Kugelkulturtechnik vermehrt werden, die ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der CSC-Biologie darstellt und als erster Schritt zur Entwicklung neuartiger CSC-Targeting-Therapien dienen kann. Hier wird die Methodik für die Erweiterung, Analyse und das Targeting von Pankreas-CSCs bereitgestellt.

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Das Vorhandensein von Krebsstammzellen (KSZ) in Knochensarkomen kürzlich ihrer Pathogenese in Verbindung gebracht worden. In diesem Artikel stellen wir die Isolierung des CSCS aus primären Zellkulturen aus humanen Biopsien herkömmlicher Osteosarkom (OS) mit der Fähigkeit des CSCS erhalten unter nichtadhärenten Bedingungen zu wachsen.

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Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

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Ziel dieser Methodik ist es, Krebsstammzellen (CSC) in Krebszelllinien und primären menschlichen Tumorproben mit dem kugelbildenden Protokoll auf robuste Weise zu identifizieren, wobei funktionelle Assays und phänotypische Charakterisierung mit Durchflusszytometrie und western Fleck.

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Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

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Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

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