Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

El objetivo de este procedimiento es el cultivo y la electrooperación de embriones de ratón, cóclea exvivo. Con el fin de estudiar varios aspectos del desarrollo coclear, incluida la diferenciación de la morfogénesis y los eventos de crecimiento, esto se logra obteniendo primero la cabeza de un embrión de ratón de día 13. A continuación, exponga los oídos internos extirpando el cerebro y aíslelos del hueso temporal en desarrollo separándolos de la base del cráneo.

A continuación, retire el cartílago suprayacente y abra el conducto coclear para obtener el epitelio sensorial de la cóclea. El paso final es cultivar la cóclea disecada con o sin electroporación durante un máximo de una semana. En última instancia, los implantes se pueden analizar para obtener imágenes de células vivas o tinción inmunológica fija y analizarse mediante imágenes confocal, el cultivo de embriones de ratón.

Cochlear explan proporciona un excelente sistema para estudiar varios aspectos de la organogénesis, como la proliferación, la especificación de sulfato y la polaridad en la cóclea en desarrollo y cómo estos eventos contribuyen al crecimiento y la diferenciación. Por lo tanto, esta técnica permite realizar manipulaciones farmacológicas y monitorear las funciones de los genes ex vivo. Y así, esta técnica, junto con la transferencia de genes a través de la electroporación, podría alterar la expresión del gen de interés y monitorear su función a nivel de una sola célula.

Para comenzar este procedimiento, coloque la cabeza de un embrión de ratón E 13 en una placa sogar estéril que contenga una solución de disección fría. Bajo un microscopio de disección, inmovilice la cabeza del embrión colocando alfileres minuciosos alrededor de la región del ojo. Luego, con dos pares de pinzas estériles, retire con cuidado la piel y abra el cráneo en el lado dorsal a lo largo de la línea media.

Después de eso, extraiga el cerebro de la cavidad craneal. Los oídos internos ubicados dentro de los huesos temporales se pueden identificar a partir del revestimiento de los vasos sanguíneos que los rodean. A continuación, disecciona los oídos internos de los huesos temporales colocando las pinzas debajo del tejido y aislando el oído interno de la base del cráneo.

Después, transfiera los oídos internos disecados a un nuevo plato que contenga una solución de disección fría. Ahora oriente el oído interno de modo que el lado ventral quede hacia arriba. Estabilice el oído interno insertando suavemente el extremo afilado de los clavos de minuchin a través de la porción vestibular.

Con pinzas ultrafinas, corte el cartílago suprayacente haciendo una incisión cerca de la ventana oval. Asegúrese de que las pinzas no se inserten demasiado profundamente en el cartílago, ya que el cartílago suprayacente a veces se fusiona con el conducto coclear. A continuación, retire con cuidado el cartílago de la cóclea.

A continuación, exponga el epitelio sensorial colocando las pinzas en la base o en el vértice del conducto coclear y tire suavemente del techo de la cóclea hacia afuera. Como último paso, retire con cuidado el tejido conectivo subyacente del epitelio sensorial expuesto para que la base del plano coclear quede plana. Después de eso, aísle la cóclea disecada de la porción vestibular del oído interno.

Transfiera el epitelio sensorial coclear disecado al pozo de cultivo recubierto de matriz de membrana basal utilizando una cuchara estéril de 1,5 milímetros si se necesita una limpieza adicional para eliminar el tejido adicional, esto se puede realizar durante esta etapa. A continuación, oriente el plano coclear con la superficie luminal del epitelio hacia arriba. Aspire la solución DMEM de la matriz de la membrana basal para aplanar cuidadosamente el tejido y agregue suavemente 150 microlitros de medio de cultivo fresco al plato.

Asegúrese de que cada x explana a se adhiera bien al cubreobjetos de vidrio recubierto y no flote en el medio de cultivo. A continuación, transfiera suavemente la cóclea microdisecada a una placa de cultivo estéril de 150 milímetros y colóquela en una incubadora de cultivo de tejidos. A 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono para tres a seis DIV.

Después de 1D IV.Examine el cultivo bajo un microscopio de disección para asegurarse de que el explan coclear se adhiere bien a la placa de cultivo. A continuación, continúe incubando el cultivo in vivo durante el período de tiempo deseado antes de procesarlo para la inmunohistoquímica y prepararlo para la electroporación. En primer lugar, esterilice un plato de vidrio recubierto de cigarro de 100 milímetros esterilizándolo en autoclave o sumergiéndolo en etanol al 70% durante unos 20 minutos.

Luego deje que se seque al aire en un banco limpio antes de usarlo. Ahora prepare el ADN a partir de un vector de expresión de su elección utilizando un maxi o un kit de preparación MIDI adecuado. Los vectores de expresión utilizados en este protocolo son un constructo de expresión H uno y un constructo de expresión D neuro.

Y la concentración final de ADN debe ser de al menos un microgramo por microlitro en ARN estériles, ARN libre, agua para electrooperar el ADN en la memoria coclear enica. Agregue 10 microlitros de solución de ADN plasmático a un plato fresco de 100 milímetros cubierto de puro. A continuación, transfiera un explanado coclear completamente diseccionado a la solución de ADN con la superficie luminal del epitelio hacia arriba.

Incline ligeramente la cóclea para que quede perpendicular al plano de la placa. A continuación, coloque la paleta de electrodos negativos hacia el epitelio sensorial y la paleta de electrodos positivos junto a la base de la cóclea utilizando el electro ator. Entrega de nueve a 10 pulsos de 24 milivoltios y 30 milisegundos de duración de pulso.

A continuación, añada 100 microlitros de medio de cultivo tibio a la cóclea electrorclasificada. Repita los procedimientos para toda la memoria coclear y para el ADN de todos los genes de interés antes de transferir la cóclea electroclasificada a la placa recubierta de la matriz de membrana basal para su colocación en placa. A continuación, cultive toda la cóclea electroclasificada en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante el período de tiempo deseado, que luego se procesará para la inmunocitoquímica.

Estas imágenes muestran los implantes cocleares embrionarios del día 13 de las pubs de ratón CD one de tipo salvaje, que se electroporan con una construcción TH, EEG FP o neuro D one EGFP Reporter. Fueron marcados inmunológicamente con marcador específico de células ciliadas, anti mio siete A o marcador neuronal dos a uno en rojo. Las células electroclasificadas, que pueden visualizarse por la expresión de EGFP, se observan en toda la cresta epitelial mayor, la cresta epitelial menor y las células del epitelio sensorial.

Las células epiteliales cocleares transfectadas neuro D uno después de cinco DIV adquirieron el fenotipo neuronal con procesos dendríticos, la mayoría de los cuales fueron positivos para dos uno o un T oh H uno. Las células transfectadas fueron positivas para myo seven. Una expresión Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en tres o cuatro horas para el litro de inteligencia de ocho a 10 pops.

Esto permitirá tiempo suficiente para el cultivo de disección, la electroporación y la colocación de placas de la lámpara.