Name: Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a derivar epitelio pigmentario de retina (EPR) a partir de células iPS mediante cuerpos embrionarios de tamaño definido. Este protocolo optimiza la diferenciación dirigida para investigación retinal y aplicaciones regenerativas.

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Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son los puntos de vista privados de los autores y no deben interpretarse como oficiales ni reflejar los puntos de vista del Departamento del Ejército o del Departamento de Defensa. Esta investigación se llevó a cabo mientras los autores Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene y Jae-Hyek Choi tenían una beca de investigación postdoctoral del Consejo Nacional de Investigación en la USAISR. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de Medicina de Rehabilitación Clínica del Ejército de los Estados Unidos (CRMRP) y el Programa de Investigación de Medicina Operativa Militar (MOMRP).

1. Preparación de reactivos de cultivo y placas de cultivo <ol><li> Preparar medio de cultivo de células madre alimentador libre mediante la adición de 100 ml de suplemento de suero libre de 5x a 400 ml de medio basal de células madre. El medio es estable a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas y a -20 ° C durante 6 meses. </li><li> Añadir 10 mM solución de Rho-asociado, espiral de la bobina que contiene la proteína quinasa (Rock) inhibidor (Y-27362) al cuerpo embrioide (EB) Medio de formación disponibles en el mercado. </li><li> Preparar medio de diferenciación mediante la adición de 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, la sustitución de suero knockout 10% (KSR) y 10 mg / ml de gentamicina a medio Eagle modificado / mezcla de nutrientes de Dulbecco F-12 (DMEM / F12). </li><li> Preparar medio IPS-RPE mediante la adición de suplemento 1x N1, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 250 mg / ml taurina, 13 ng sal sódica / ml triyodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, 5 mg / ml de gentamicina, y 15% suero bovino fetal (FBS) &lt;sup&gt; 21 a medio esencial mínimo de Eagle (MEM). Ajustar el pH a 7,4. </li><li> Preparar triyodo-L-tironina solución de sal de sodio de valores. Disolver 1 mg de sal de sodio triyodo-L-tironina en 1 N de hidróxido de sodio girando suavemente. Añadir 49 ml de MEM para hacer 50 ml de 20 g / ml de sal de sodio triyodo-L-tironina. Preparar alícuotas y congelar a -20 ° C hasta que se necesite. Utilice volumen apropiado para alcanzar la concentración deseada en medio de cultivo final. </li><li> Preparar hidrocortisona solución madre. Solubilizar 1 mg de hidrocortisona en 1 ml de etanol al 100% por agitación suave. Añadir 19 ml de MEM para hacer 20 ml de 50 mg / ml de solución de hidrocortisona de valores. Alícuota y congelar a -20 ° C hasta que se necesite. Utilice volumen adecuado para conseguir la concentración deseada en el medio de cultivo final. </li><li> Preparar una solución de trabajo de dispasa de 1 mg / ml en DMEM / F12. </li><li> Preparación de las placas matriz recubierta <ol><li> Preparar matriz de proteína extraída de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucélulas de sarcoma de Se en DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Escudo cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de la solución de matriz. Se incuban las placas recubiertas a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Después de la incubación de 1 hora, aspirar el exceso de DMEM / F12. Añadir 0,5 ml de medio de cultivo celular vástago alimentador libre para evitar el secado de los pozos. Las placas matriz recubierta están listos para su uso. </li></ol></li><li> Preparar placas de micropocillos, enjuagando cada pocillo con 2 ml de DMEM / F12. Eliminar DMEM / F12 y añadir 0,5 ml de medio de formación de EB suplementado con inhibidor de la roca a cada pocillo. Centrifugar la placa a 2.000 xg durante 5 min para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Preparar tampón de tinción FACS mediante la mezcla de 2% de FBS y 0,09% de azida de sodio en tampón fosfato salino (PBS). Ajuste el tampón a pH 7,4. </li><li> Preparar la solución de neutralización de tripsina mediante la adición de 10% de FBS a DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Cultura <ol><li> Antes de la siembra de células iPS, cálido tallo medio de cultivo celular alimentador libre a 37 ° C, y tienen la matrix placas recubiertas listo. </li><li> Descongelar rápidamente las células iPS IMR90-1 en un baño a 37 ° C. A continuación, retire la crio-vial del baño de agua y limpie el vial con etanol al 70%. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta 2 ml para minimizar la rotura de los agregados celulares. </li><li> Añadir 5 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre caliente a las células gota a gota y mezclar suavemente. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender cuidadosamente los grupos de células en 2 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre y semillas de los grupos de células en los pocillos de la placa de matriz recubiertos. Colocar la placa en una incubadora a 37ºC con 5% de CO 2, 95% de humedad. </li><li> Cambiar el medio de cultivo de células iPS diaria. Observe colonias indiferenciadas cinco a siete días después de la siembra. Compruebe si hay colonias indiferenciadas que están listos para el paso (colonias con un centro denso) bajo un microscopio de luz. </li></ol> 3. pases de células iPS <ol><li> Antes de comenzar a paso las células iPS, calentar la solución dispasa, DMEM / F12 y tallo medio de cultivo celular alimentador libre a 37 ° C en baño de agua. </li><li> Antes de pases de células iPS, retire cualquier área de la diferenciación raspando la superficie y aspirar el medio. Enjuagar cuidadosamente las células iPS con 2 ml de DMEM / F12. </li><li> Añadir 1 ml de 1 mg / ml de dispasa a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar el dispasa y enjuagar suavemente las colonias de células con 2 ml de DMEM / F12 dos veces. Después de enjuagar, añadir 2 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre a cada pocillo. </li><li> Con una pipeta de 5 ml raspar suavemente las colonias de la placa para formar grupos de células. La transferencia de los grupos de células desprendidas a un tubo cónico de 15 ml. Añadir suficiente vástago de medio de cultivo celular libre de alimentador para sembrar el siguiente paso de las células. </li></ol> 4. Generación de EBS Usando microplacas <ol><li> Preparación de una suspensión de células individuales de células iPS <ol><li> Retire el medium de las células iPS y enjuagar las células iPS con 2 ml de DMEM / F12. Añadir 750 l de accutase a las células iPS en cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 para permitir que las células se desprenden de la placa (aproximadamente 5-10 min). </li><li> Utilice una pipeta de disociar suavemente cualquier resto de las células y de separar las células que quedan en la superficie de la placa. Transferir las células a un tubo cónico de 50 ml. Enjuagar la placa con 5 ml de DMEM / F12 y combinar el enjuagado DMEM / F12 con las células en el tubo cónico. Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras para eliminar los posibles grupos de células residuales. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar el accutase. Resuspender el sedimento celular en un medio de formación de EB de modo que la concentración de células es de aproximadamente 0,5-1,0 x 10 7 células / ml. </li><li> Determinar el número de células viables contando las células con azul de tripano y un hemocitómetro. </li></ol></li><li> Adjusting densidad celular en micropocillos para formar EBS tamaño controlado <ol><li> Ajustar el número de células a cada pocillo de la microplaca para generar los tamaños EB deseados. Añadir las células a los pocillos de las placas preparadas en el paso 1.9, Distribuya uniformemente las células pipeteando suavemente las células en varias ocasiones. Nota: El número de células requeridas por pocillo = el número deseado de células por EB x número de micropocillos por pocillo. </li><li> Ajuste el medio EB formación complementado con inhibidor de la roca en los pozos a un volumen final de 2,0 ml. Redistribuir las células pipeteando suavemente cada pocillo. Centrifugar las microplacas a 100 g durante 3 min. Colocar las placas en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 hr. </li></ol></li><li> EB Cosecha de las placas de microtitulación <ol><li> Cosecha de EBs de micropocillos mediante pipeteo medio en el pozo arriba y abajo con una micropipeta 1 ml para eliminar la mayor parte de los EBS. Pasar la suspensión a través de una célula EB 40 micras invertidacolador en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml para eliminar las células individuales. </li><li> Lave la microplaca 5 veces con 1 ml de DMEM / F12 para eliminar todos los EBS. Recoger lavados y pasar sobre el filtro celular invertida. Gire el lado derecho hacia filtro celular a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Recoge los EBS por lavado con medio EB formación. Contar EBS para determinar el rendimiento. </li></ol></li></ol> 5. Revestimiento del EBS y Diferenciación Iniciación <ol><li> Placa las EBS en matriz de proteína recubierta placas de seis pocillos (como en el paso 1.8.1) a una densidad de &lt;1.000 EB / pocillo en medio de la formación de EB más un inhibidor de la roca 10 mM. Incubar EBS a 37 ° C con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 hr. </li><li> 24 horas después de la siembra EB, reemplazar con medio de diferenciación para iniciar la diferenciación. Cambiar la mitad del medio de diferenciación cada dos días hasta que se recogieron las células para su posterior análisis. </li><li> Recoger muestras en días 6, 17, 29 y 60 para llevar a cabo RT-PCR, immunocytochemistry y FACS para validar la expresión de genes característicos del EPR y proteínas. </li></ol> 6. Extracción de ARN y PCR <ol><li> Extracto de ARN de las muestras de EB según las instrucciones proporcionadas en el kit disponible comercialmente. Determinar la concentración de ARN mediante el uso de un espectrofotómetro. </li><li> Realizar la transcripción inversa en 100 ng de ARN total de acuerdo con RNA disponibles comercialmente a cDNA kit de transcripción inversa. </li><li> Realizar PCR con 10 ng de cDNA usando los siguientes cebadores (Tabla 1) a una concentración de 10 mmol / 10 ng de cDNA. Ajuste la PCR como sigue: desnaturalizar el ADN a 95 ° C durante 5 min, amplificar con 35 ciclos a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min, seguido de un ciclo final a 72 ° C durante 10 min. Ejecute el producto de PCR en un gel de agarosa al 1%. </li></ol> 7. La inmunocitoquímica <ol><li> Lávese las EB con PBS dos veces a temperatura ambiente. Fijar los EBS a TA en el 4% paraformaldehyde durante 10 min. Enjuagar una vez con PBS a RT. Almacene las muestras en PBS a 4 ° C hasta su uso para la tinción. </li><li> En el día de la tinción, el tratamiento de las células fijadas con fijación y permeabilización de reactivos. Incubar las muestras con solución de bloqueo (10% suero de cabra en solución de permeabilización) durante 1 hora a RT. </li><li> Realizar inmunoquímica en 10% suero de cabra en solución de permeabilización utilizando los siguientes anticuerpos primarios en las diluciones indicadas: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1:30), y anti- ZO1 (1: 100). Incubar las muestras con anticuerpos O / N correspondiente a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, eliminar el anticuerpo primario de las células y lavar las muestras tres veces con PBS. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado durante 1 hora a RT. </li><li> Eliminar el anticuerpo secundario de las células y lavar las muestras tres veces en PBS. Monte la cubierta se desliza sobre portaobjetos de vidrio con DAPI que contiene medio de montaje y deje muestras para establecer O / N en una cámara oscura.Utilice un microscopio de fluorescencia para visualizar la tinción. </li></ol> 8. La tinción para el análisis de FACS <ol><li> Lavar los EBS cultivadas en PBS dos veces. Incubar EBS con 0,5 ml de tripsina al 0,25% durante 5-10 min para hacer una suspensión de células individuales. Neutralizar la tripsina con solución neutralizante de tripsina (1 ml / pocillo). </li><li> Transferir la suspensión de células individuales a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 600 xg durante 10 min. </li><li> Descartar el sobrenadante y añadir 10 ml de DMEM / F12 a las células en el tubo. Invierta suavemente para mezclar las células. Se centrifuga a 600 x g. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender las células en tampón de tinción FACS. </li><li> Cuente el número total de células. Centrifugar a 600 xg durante 10 min. Después de la centrifugación el sobrenadante de descarte. Fijar las células inmediatamente por la adición de 0,5 ml de paraformaldehído al 4%. Mezclar bien por agitación suave. Se incuban las células a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 10 min y retirar elsobrenadante. Vortex suavemente para perturbar el sedimento celular. Permeabilizar las células mediante la adición de 1 ml de solución de permeabilización enfriada. Vortex suavemente para mezclar e incubar en hielo durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 10 min y separar el sobrenadante. Añadir 3 ml de tampón de tinción FACS y resuspender. Repita este paso para una vez más. Resuspender las células en tampón de tinción FACS a una concentración final de 5 x 10 6 células / ml. </li><li> Transferir 100 l de la suspensión de células (células de 0,5 x 10 6) a cada uno de los tubos de microcentrífuga y añadir el volumen recomendado de anticuerpo primario. Para Pax6, añadir 5 l de PE anti-Pax6 en 100 l de suspensión celular. Para MITF, añadir 5 l de anti-MITF en 100 l de suspensión celular. </li><li> Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 60 min. Añadir 3 ml de tampón de tinción FACS. Mezclar y centrifugar a 600 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y repetir 8.16 por dos veces más. </li><li> Para la tinción MITF, se incuban las células en Antibo secundariady, de cabra anti-ratón de Alexa Fluor 488 a una dilución de 1: 2000 durante 1 hora a 4 ° C. Para la tinción de Pax6, evitar este paso. </li><li> Lavar las células con 5 ml de tampón de tinción FACS y se centrifuga a 600 xg durante 10 min. Repita el proceso para dos veces más. </li><li> Resuspender las células en 500 l de tampón de tinción FACS y agitar suavemente para alterar el sedimento celular. Las muestras están listas para el análisis de citometría de flujo. </li></ol> 9. iPS-RPE Aislamiento y cultivo <ol><li> En el día 29, corte con cuidado alrededor de las colonias pigmentadas seleccionados de la placa de cultivo con una punta de pipeta de 200 l. Transferencia de las colonias flotantes a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las colonias a 600 xg durante 10 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las colonias de células en 10 ml de DMEM / F12 y centrifugar a 600 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Preparar una suspensión de células individuales mediante la incubación de las colonias con 2 ml de tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 7-10 min. Vórtice suavemente la suspensión de células para disociar las colonias. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la adición de 2 ml de medio iPS-RPE. Centrifugar a 600 xg durante 10 min y descartar el sobrenadante. Resuspender las células individuales en 2 ml de medio iPS-RPE. Transferir las células en una matriz de proteína placa de 6 pocillos recubiertos y el lugar en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Para conseguir plenamente las promesas de las células madre pluripotentes para la terapia celular, es necesario regular su diferenciación de una manera consistente y reproducible. Este informe describe los protocolos para formar EBS tamaño controlado utilizando la tecnología de placas de pocillos, iniciar la diferenciación hacia RPE e identificar marcadores de proteínas y genes de RPE. Para sincronizar la diferenciación in vitro, tamaños homogéneos de EB fueron formados por un número conocido de células iPS cen...

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son un tipo de células madre pluripotentes obtenidas por la reprogramación de células adultas con factores extrínsecos 1. En contraste, las células madre embrionarias (CES), otro tipo de células madre pluripotentes, se generan a partir de la masa celular interna del blastocisto 2-3. A pesar de sus diferentes orígenes, las células iPS y las CME son comparables en su ilimitada capacidad para replicarse in vitro y en su capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula 4-5. Estas características de las células iPS les hacen candidatos ideales para aplicaciones en medicina regenerativa personalizada. Los recientes esfuerzos de investigación se centran en el desarrollo de protocolos de diferenciación robustos para la producción de células adultas especializadas incluyendo epitelio pigmentario de la retina (EPR) 6-11. Para posibles aplicaciones clínicas de las células iPS derivadas, una diferenciación dirigida para ese tipo específico de célula es esencial. Hay varios métodospublicado para la diferenciación dirigida de ambas CES e iPS células RPE en que varía mucho en su eficacia 6-7, 12-16. Todavía no sabemos muchos de los eventos moleculares que gobiernan el destino de las células / tejidos durante el desarrollo o diferenciación. En los últimos años, se han hecho esfuerzos para desarrollar el protocolo de diferenciación que puede imitar el desarrollo embriológico tanto como sea posible. Durante la fase de blastocisto, la población no comprometido de las células madre están juntos en un microambiente tres dimensiones. Así, varias estrategias se aplicaron para hacer las células ESC / iPS reunidos juntos y crecer en tres dimensiones. Estos agregados de células madre se denominan cuerpos embrionarios (EBS). Los estudios han demostrado que la EB diferenciación de células madre imitan etapa temprana del desarrollo del embrión y espontáneamente puede dar lugar a endodermo primitivo en su superficie exterior. Más tarde, como el desarrollo EB progresa, fenotipos de células diferenciadas de los tres linajes germinales aparecen 17-18. Therefore, protocolos de diferenciación basada EBS han atraído mucha atención para la diferenciación in vitro de células ESC / iPS y son un buen candidato para la generación EPR a partir de células madre pluripotentes 13. EB se pueden hacer usando varios métodos a partir de células / iPS DESC. Inicialmente, los OC fueron hechas por el raspado de las colonias adheridas y mantenerlas en cultivo en suspensión no adherente. Sin embargo, este enfoque produce población heterogénea de EBS que provoca una baja reproducibilidad. Colgando de cultivo celular de caída y la formación de micro pozos EBS basada otras técnicas populares para la formación de EB que producen EBS homogéneos de tamaños definidos que son altamente reproducible. Además, la técnica de micropocillos puede producir gran número de agregados con menos esfuerzo. La diferenciación de las células dentro de EBS es regulada por un múltiplex de señales morfogénicas del microambiente extracelular e intracelular. En contraste con la diferenciación en una lunformato olayer, EB proporcionar una plataforma para el complejo ensamblaje de las células y la señalización intercelular que ocurra 17. Curiosamente, se observó el número de células madre pluripotentes utilizados para hacer EBS individuales para influir en el destino de las células. Por ejemplo, en un estudio de la diferenciación hematopoyética de los CES humanos, se observó que las células 500 EB promovió la diferenciación hacia el linaje mieloide de las células mientras que 1.000 EB empujado hacia el linaje eritroide 20. En otro estudio, los OC pequeños favorecieron diferenciación endodermo mientras que EB mayores promovidos hacia la diferenciación neuro-ectodermo 11, 17. Estos estudios anteriores sugieren fuertemente que el número de células ESC / iPS utilizados para hacer EBS individuales afectan EBS diferenciación basado en cualquier tipo de células. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay estudios actuales que han dilucidado el impacto del tamaño de EB en su propensión a diferenciarse hacia RPE. El objetivo de este estudio es caracterizar la influencia deTamaño de EB en las células (iPS) madre pluripotentes inducidas - epitelio pigmentario de la retina (iPS-RPE) diferenciación y para identificar el número de células óptimo para hacer los EBS para la diferenciación dirigida hacia linaje RPE.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 media + 5x suplemento</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Inhibidor de rocas)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Suero knockout reemplazo</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM medios</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 suplemento</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovino Hiclon sérico</td><td>(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triyodo-L-tironina sodio&nbsp; sal</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Hiclon (Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Placa Aggrewell 400</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>Medio AggreWell</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Kit de fijación/permeabilización Cytoperm BD</td><td>Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PAX6 de ratón</td><td>Estudios de desarrollo Banco</td><td></td><td></td>de hibridomas</tr><tr><td>Conejo Anticuerpo anti-RX</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>Ratón &nbsp; Anticuerpo anti-MITF</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Anticuerpo anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ARN a ADNc de alta capacidad</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

derivadas del epitelio pigmentario de la retina (epr) de madre pluripotentes inducidas (ips) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Las células madre pluripotentes poseen la capacidad de proliferar indefinidamente y de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula. Además, el desarrollo de técnicas para reprogramar células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ha generado interés y entusiasmo hacia la posibilidad de una medicina regenerativa personal personalizada. Sin embargo, la eficiencia de la diferenciación de las células madre hacia un linaje deseado sigue siendo baja. El propósito de este estudio es describir un protocolo para derivar epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células iPS (iPS-EPR) mediante la aplicación de un enfoque de ingeniería de tejidos para generar poblaciones homogéneas de cuerpos embrioides (EB), un intermediario común durante la diferenciación in vitro. El protocolo aplica la formación de tamaños específicos de EB utilizando la tecnología de placas de micropocillos. También se explican los métodos para identificar marcadores de proteínas y genes de EPR mediante inmunocitoquímica y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Finalmente, se describe la eficiencia de la diferenciación en diferentes tamaños de EBs monitorizados por el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de marcadores RPE. Estas técnicas facilitarán la diferenciación de las células iPS en EPR para futuras aplicaciones.

En este experimento, las células iPS fueron cultivadas y diferenciarse en el linaje RPE de EBS. EBS de tamaños controlados se formaron utilizando placas de micropocillos. Como se ve en la figura 1 la formación de EB fue homogénea en las placas de micropocillos. Estos EB fueron recogidos y se sembraron en placas de 6 pocillos (Figura 2). RPE puede ser identificado por su clásica hexagonal morfología, pigmentación, y la expresión de marcadores de RPE. Después ...

El objetivo de este informe es describir los protocolos para derivar el epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando diferentes tamaños de cuerpos embrionarios.

Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la influencia del tamaño corporal del embrión en la diferenciación del EPR de las células IPS para dirigir la diferenciación del cuerpo del embrión hacia el linaje del EPR. Esto se logra utilizando primero la técnica de micropocillos para generar cuerpos embrionarios homogéneos de tamaños definidos. En el segundo paso, se inicia la diferenciación dirigida de las células IPS hacia el linaje de la retina, y luego se identifican y aíslan las células I-P-S-R-P-E.En el paso final, las células I-P-S-R-P-E se enriquecen y expanden. En última instancia, las células I-P-S-R-P-E se pueden analizar para determinar su expresión de marcadores específicos I-P-S-R-P-E. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la diferenciación espontánea, es que nuestra técnica da como resultado una mayor RP. Este asunto puede ayudar a optimizar la diferenciación dirigida de las células IPS hacia el linaje RP.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina como la degeneración macular, la retinitis o la enfermedad de Stargardt. Dado que la sustitución del EPR enfermo por un EPR sano derivado de células IPS puede ser la mejor opción para prevenir la pérdida de visión, en general las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las células madre son muy delicadas y los cambios sutiles en su mango pueden afectar al proceso de diferenciación. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el paso de recolección del cuerpo del embrión desde el lugar del microondas es difícil.Antes de la siembra, caliente el medio de cultivo de células madre libres del alimentador a 37 grados Celsius, y luego caliente rápidamente las células IMR 90 dash one IPS en un baño de agua a 37 grados Celsius. Cuando las células estén descongeladas, agregue cinco mililitros de cultivo de células madre libres de alimentador caliente, medio a las células, gota a gota y mezcle suavemente. A continuación, centrifuga las células y luego vuelve a suspender cuidadosamente los grupos de células en dos mililitros de cultivo de células madre libres de alimentador.Siembre los grupos en pocillos individuales de una placa recubierta de matriz, y luego coloque las células en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad y cambios diarios de medio. De cinco a siete días después, observe las colonias indiferenciadas con un centro denso que están listas para ser pasadas bajo un microscopio óptico. Cuando las células estén listas, agregue un miligramo por mililitro de 37 grados centígrados de espacio caliente a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante siete minutos.A continuación, aspire el espacio DYS y enjuague suavemente las colonias celulares con dos mililitros de DM MF MF 12 precalentado. Dos veces. Después de enjuagar, agregue dos mililitros de medio de cultivo de células madre libres de alimentador a cada pocillo y use una pipeta de cinco mililitros para raspar suavemente las colonias, liberando los grupos de células.Luego, transfiera los grupos separados a un tubo cónico de 15 mililitros y agregue suficiente medio de cultivo de células madre libres para sembrar el próximo paso de células para generar los cuerpos embrionarios. Primero, enjuague las celdas IPS con dos mililitros de DMMF 12 y luego agregue 750 microlitros de Accutane a cada pocillo de la placa de seis pocillos durante cinco a 10 minutos. En una incubadora de cultivo celular, cuando las células hayan comenzado a desprenderse, use una pipeta para disociar suavemente las células en una sola suspensión celular y luego transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros.Enjuague la placa con cinco mililitros de DM MF 12, agrupando el lavado con las células en el tubo cónico. A continuación, pase la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micrómetros para eliminar los grumos de células residuales. Ahora gire las celdas hacia abajo para eliminar el Accutane y resus.Suspenda el pellet en el medio de formación del cuerpo embrionario a una concentración de 0,5 a una veces 10 a la séptima célula por mililitro. Después de determinar el número de células viables por exclusión de azul triano, agregue el número apropiado de células a cada pocillo de una placa de micropocillos para generar el embrión deseado. Tamaños corporales.Pipetear suavemente los cultivos para facilitar una distribución uniforme de las células, y luego ajustar el medio de formación del cuerpo embrionario suplementado con inhibidor de roca a un volumen final de 2,0 mililitros. Después de un pipeteo más suave, centrifugar los cultivos celulares de micropocillos e incubar la placa en una incubadora de cultivos celulares durante 24 horas. Al día siguiente, pipetee el medio hacia arriba y hacia abajo en cada micro pocillo con una micropipeta de un mililitro para recolectar la mayoría de los cuerpos embrionarios y luego pase la suspensión del cuerpo del embrión a través de un colador de células invertido de 40 micrómetros para eliminar cualquier célula individual.A continuación, enjuague la placa de micropocillos cinco veces con un mililitro de DMMF 12 para eliminar el resto de los cuerpos embrionarios que pasan los lavados por el colador. A continuación, coloque el colador de células boca abajo en una placa de Petri y filtre los cuerpos embrionarios recogidos con más medio de formación de cuerpos embrionarios. Después de contar las células recolectadas, incube los cuerpos embrionarios en placas de seis pocillos recubiertas de matriz de proteínas a menos de 1000 cuerpos embrionarios por pocillo en el medio de formación de cuerpos embrionarios, complementados con 10 inhibidores de rocas micromolares en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas.Finalmente, reemplace el medio de formación del cuerpo embrionario con el medio de diferenciación para iniciar la diferenciación. Recolección de muestras a los días 6, 17, 29 y 60 para realizar el análisis posterior adecuado. Después de 12 semanas de cultivo, 200 cuerpos embrionarios celulares desarrollan una morfología de astrocitos y fibroblastos sin pigmentación visible, mientras que los cuerpos embrionarios más grandes desarrollan una monocapa de morfología y pigmentación clásicas de RPE, como se demuestra en estas imágenes.En este gráfico, el marcador neuroectodérmico PAC seis se midió en cuerpos embrionarios de diferentes tamaños en diferentes puntos de tiempo mediante citometría de flujo. Por ejemplo, en los 3000 cuerpos de embriones celulares, aproximadamente el 50% de las células analizadas fueron positivas para PAC seis en el sexto día de cultivo. Además, el análisis por fax del marcador RPE MITF en cuerpos embrionarios de varios tamaños reveló que el 20% de las células expresaban MITF en el día 60 de diferenciación.Los EPR cultivados también se caracterizan por su capacidad de perder su pigmento y morfología poligonal y de obtener un fenotipo de fibroblastos en el momento del envasado. Por ejemplo, aquí se muestran células recién pasadas que han perdido su pigmento y han adquirido una morfología de fibroblastos. A continuación, estas células proliferan, recuperando su morfología poligonal clásica en la confluencia y, en pocas semanas, recuperan su pigmentación.Al intentar este procedimiento, es importante recordar identificar y aislar adecuadamente las colonias de IPS RP después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de células madre exploraran la diferenciación dirigida hacia muchos tipos de células adultas imitando el desarrollo embriológico normal. No olvide que trabajar en el tejido, los laboratorios virtuales pueden ser extremadamente peligrosos, y que las repercusiones, como el uso de abrigos para las piernas, guantes y anteojos, siempre deben tenerse en cuenta mientras se realizan estos procedimientos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar cuerpos embrionarios homogéneos del tamaño deseado para dirigir la deforestación hacia I-P-S-R-P-E y para aislar y enriquecer las células EPP.

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El perfil de madre humanas pluripotentes inducidas (iPS), el epitelio pigmentario de la retina (RPE) derivadas de células (iPS) (iPS-RPE) inducido por el hombre-madre pluripotentes, y RPE fetal microRNA (miRNA), fueron comparados.

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