Name: Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a detectar células B productoras de IgE verdadera en ratones mediante tripsina, fijación con formol y citometría de flujo. Este método económico elimina la IgE unida a receptores para un análisis preciso del cambio de clase de inmunoglobulinas.

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DRW es apoyado por subvenciones del NIH AI089972 y AI113217, y por el de la mucosa Estudios de Inmunología del equipo, y tiene una concesión de carrera para los científicos médicos del Fondo Burroughs Wellcome.

NOTA: Todos los experimentos descritos aquí estaban de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) directrices y aprobado por el Hospital de Niños de Investigación Animal (ARCH), Boston, Mass. 1. Preparación de los reactivos <ol><li> 1,000x IL-4 Stock: Diluir IL-4 de citoquinas a 20 mg / ml en H 2 O o 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA). Distribuir en 200 ml de alícuotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C. </li><li> 1.000 x anti-CD40: Obtener del fabricante a 1,0 mg / ml, se almacena a 4 ° C. </li><li> B medios de estimulación de células: Para 425 ml de medio RPMI-1640, añadir 75 ml de suero de ternera fetal recién descongelado (FCS), 10 ml de 1,0 M de tampón HEPES, 5 ml de L-glutamina Stock, 5 ml de penicilina: Foto de estreptomicina, 5 ml Esenciales Medio no esenciales Aminoácidos l (MEM-NEAA), y 3,5 mínimas de 2-mercaptoetanol. Mantenga los medios a 4 ° C durante un máximo de una semana. Añadir IL-4 (20 ng / ml) y anti-CD40 (1.0 mg / ml) inmediatamente antes de su usosólo para el volumen de los medios necesarios. </li><li> 2% FCS-FACS Buffer: Añadir 10 ml de FCS a 490 ml de PBS 1x. Mantenga a 4 ° C. </li><li> 2x solución de tripsina-EDTA: Diluir 5 ml de 10x solución de tripsina-EDTA de stock (5,0 g de tripsina, EDTA 2,0 g por litro) en 20 ml de PBS 1x. Tienda tripsina-EDTA en 2x alícuotas de trabajo a 4 ° C. Se deja calentar hasta la temperatura ambiente antes de su uso. </li><li> El suero fetal de ternero: Mantenga FCS descongelaron a 4 ° C durante un máximo de dos semanas. Colocar en hielo 15 min antes de que el procedimiento de tinción citoplásmica. </li><li> -Neutral formalina tamponada: Preparar una solución de formalina al 10% (3,7% de paraformaldehído). La formalina es tóxico y, por tanto, manejar bajo una campana de extracción de laboratorio mientras usa el EPP apropiado. Formalina tienda a temperatura ambiente en un armario de almacenamiento de químicos. </li><li> Metanol: tienda metanol absoluto (100%) a -20 ° C hasta que las células están listas para ser permeabilizadas. Tenga en cuenta que el metanol es inflamable y se debe almacenar en un congelador apropiado. </li></ol> 2.La purificación y activación de células B <ol><li> Desde un bazo de ratón recién cosechado-, preparar una suspensión de células individuales presionando suavemente el órgano a través de un filtro de células de 70 micras con el émbolo de una jeringa de 3 ml. En un tubo de centrífuga cónico de 15 ml, recoger las células en 10 ml de 1x PBS y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de glóbulos rojos tampón de lisis durante 5 min. Neutralizar con 13,5 ml de 1x PBS y centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> (Opcional) separar magnéticamente las células B utilizando anti-CD45R (B220) marcado con perlas, siguiendo el protocolo de purificación MACS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Estimular las células B purificadas a 1,0 x 10 6 células / ml en medio de estimulación de células B calentado que contiene IL-4 (20 ng / ml) y anti-CD40 (1.0 g / ml) durante 5 días a 37 ° C. Empiece con 8 ml de cultivo divididos en 2 pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos (4 ml cada una). </li><li> Compruebe culture diariamente para mantener a 1,0 x 10 6 células / ml. Ajustar la concentración dividiendo en otros pozos y diluyendo la cultura con los medios de comunicación la estimulación de células B que contiene IL-4 fresca y anti-CD40. </li></ol> 3. La tripsinización, Fijación y permeabilización <ol><li> La tripsinización <ol><li> Obtener hasta 1,0 x 10 7 de las células cultivadas en un tubo cónico de 15 ml, se centrifuga a 300 xg durante 5 min, y decantar el sobrenadante. </li><li> Lavar con 10 ml de PBS para eliminar la proteína residual de los medios de recogida de células. Repita el paso de centrifugación y decantar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en el volumen residual después de la decantación (aproximadamente 100 l). </li><li> Añadir cuidadosamente 800 l de temperatura ambiente 0,1% (2x) tripsina-EDTA a las células. Dispensar lentamente en un ángulo de 45 ° hacia abajo el lado del tubo cónico. </li><li> Cerrar el tubo y mezclar suavemente por la inclinación del tubo de manera que el líquido corre a lo largo de la longitud del tubo de tiempo de 5-6s. A, precipitado blanco fibroso puede formar en la solución. Limite el tiempo de tratamiento con tripsina a menos de un minuto. </li><li> Interrumpir la reacción tripsinización con 1 ml de FCS fríos. Diluir el FCS inmediatamente por la adición de 10 ml de PBS frío. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, a continuación, decantar el sobrenadante y volver los tubos en hielo. </li></ol></li><li> Fijación <ol><li> Resuspender las células en el volumen residual después de la decantación. Si es necesario, llevar el volumen hasta 100 l con PBS frío. </li><li> En una campana de humos, añadir 800 l de solución de formalina tamponada neutra al 10% a las células y pipetear arriba y abajo. El tubo se calentará tras la adición de formalina. Incubar a 37 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Permeabilización <ol><li> Configurar un vórtex de sobremesa a una velocidad de agitación suave. </li><li> Dibuje 9 ml de frío (-20 ° C) de metanol en un 10 ml pipeta serológica. </li><li> Sostenga el tubo que contiene las células sobre el mezclador de vórtice y empezar suavemente shaking las células. </li><li> Añadir metanol frío para el tubo de manera que cae gota a gota sobre las células mientras que el tubo todavía está sacudiendo de modo que el metanol se mezcla continuamente. Después de los primeros 2 ml de metanol la velocidad de dispensación se puede aumentar a una corriente lenta. </li><li> Deje que el tubo de sentarse en hielo durante 30 minutos para completar la permeabilización. Alternativamente, las células pueden almacenarse a -20 ° C hasta por un mes. </li></ol></li></ol> 4. La fluorescencia de tinción para IgG1 e IgE Class Switching <ol><li> Muestra Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos y decantar la solución de metanol. Un precipitado blanco puede sedimentar con las células. </li><li> Añadir 10 ml de la temperatura ambiente 1x PBS y centrifugar a 300 xg durante 5 min para lavar las células. Repetir una vez. Nota: Lavar el pellet con temperatura ambiente PBS disuelve precipitado adicional que puede formar después del paso 4.1. </li><li> Realizar un lavado adicional con 10 ml de 2% de tampón FCS-FACS. </li><li> Distribuir las muestras a un redondo de 96 pocillos placa inferiory centrifugar a 300 xg durante 5 min. Decantar el sobrenadante y poner la placa en el hielo. </li><li> Las manchas en 60 l de 2% de tampón FCS-FACS por pocillo con las siguientes diluciones de anticuerpos: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li> Después de 5 min de la tinción, se lava la placa con 150 l de 2% de tampón FACS-FCS y se centrifuga durante 5 min a 300 x g. </li><li> Resuspender en 400 l de 2% de tampón FACS-FCS y pipeta a través de un filtro de células de 40 m de nylon en un tubo de FACS 5 ml. </li></ol> 5. Utilice la estrategia de apertura de puerta a seguir: <ol><li> Aislar CD45R (B220) células positivas de la población de linfocitos voladura situado en la / parcela SSC FSC (Figura 1). </li><li> De las células positivas B220, usar el diagrama de IgE y IgG1 para revelar las poblaciones correspondientes. </li></ol>

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<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen divulgaciones.

La estimulación de células B de ratón esplénica en cultivo con anti-CD40 y IL-4 simulará T helper de tipo 2 (T H 2) las interacciones, el cambio de clase alentador IgG1 e IgE 5. Las células B pueden ser activados para la RSE en el contexto de esplenocitos totales 12 o células B esplénicas purificadas 11. Como se ha indicado en el protocolo (etapa 2.3), el enriquecimiento de células B es opcional, y es a discreción del experimentador para determinar si sería beneficioso. Separa...

Durante inmunoglobulina de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) en ratones y seres humanos, la IgH μ exones de la región constante (Cμ) se eliminan y sustituyen por uno de varios conjuntos de los exones de la región constante aguas abajo (C H s) (por ejemplo Cγ, Cε, y Cα), resultando en un cambio de la producción de IgM a la producción de otras clases de Ig (por ejemplo, IgG, IgE, o IgA). RSE se produce dentro de conmutación (S), que son regiones 1-10 kb secuencias localizadas 5 &#39;a cada conjunto de C H 1 s. La activación inducida por citidina deaminasa (AID) enzima inicia la RSE a través de la actividad de citidina deamination. La IgE es un mediador clave de la enfermedad alérgica 2 y una mayor comprensión de cómo se produce y regulada puede abrir las puertas a nuevos enfoques terapéuticos para la enfermedad atópica IgE. En los ratones y los seres humanos, IgE es el isotipo Ig más estrechamente regulado. IgE normalmente se detecta en niveles miles de times menor que otro IgH isotipos 3, pero puede ser muy elevado en estados de enfermedad 4. Sin embargo, la RSE a la IgE no se conoce bien. In vitro la activación de células B usando IL-4 en combinación con anti-CD40 o LPS, induce CSR tanto a IgG1 e IgE 5. Las células B activadas expresan el receptor de baja afinidad IgE FcεRII / CD23 2,6, que se une la IgE soluble secretada en la cultura después de la RSE. Por lo tanto, al analizar con citometría de flujo, las células B con receptor de IgE unida mancha similar a las células B que expresan endógenamente IgE 7. Aunque se sabe que el ratón B células expresan el receptor de baja afinidad IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, en nuestra experiencia, no parece interferir con la medición del cambio de clase a IgG1. Sin embargo, en la medición de conmutación IgE después de la activación de las células B en la cultura, unida a la superficie específica IgE puede oscurecer el análisis. Con los métodos de tinción comunes, las células no expresan IgE tiñen positivamente para IgE. Esbozado aquí es una estrategia que se ha utilizado para llevar a cabo ensayos de RSE y detectar verdaderas células IgE-B que expresan de ratones 9-11. El tratamiento de células B activadas con tripsina, un reactivo de laboratorio común para digerir las proteínas, elimina unido a la superficie tanto citofílicos y la membrana IgE. Permeabilización posterior y tinción citoplasmática de IgE por lo tanto revela las verdaderas células productoras de IgE.

<table><tbody><tr><td>Anti-Ratón IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>553415 clon R35-72</td></tr><tr><td>Rata Anti-Ratón IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>clon A85-1</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Mantener en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Colador de celdas Falcon 40 y micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 70 &micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>clon RA3-6B2</td></tr><tr><td>anti-Mouse/Rat CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>clon HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medio 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) microperlas&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>Columna de purificación MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Reconstituir en agua o 0,1% BSA</td></tr><tr><td>Solución de formalina, tamponado neutro, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5,0 g de tripsina, 2,0 g de EDTA&#8226; 4 Na por litro de NaCl al 0,9%</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10.000 U Penicilina; 10 mg/ml Estreptomicina (100x)</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Rata Anti-Ratón IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>clon 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Suero de ternera fetal</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Medios de estimulación de células B</td> Los medios de estimulación <td></td><td></td><td>de células B consisten en RPMI con suero de ternero fetal (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamina, &nbsp; 1x Penicilina-Estreptomicina (Penicilina: 100 U/ml, Estreptomicina: 100 y micro; g/ml), beta-mercaptoetanol (7 y micro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) y anti-CD40 (1 y micro; g/ml)</td></tr></tbody></table>

detección de true ige que expresan las células del linaje b de ratón

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B inmunoglobulina de linfocitos de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) es un proceso en el que expresa inicialmente IgM cambia a otros isotipos de IgH, tales como IgA, IgE e IgG. Medición de la IgH CSR in vitro es un método clave para el estudio de una serie de procesos biológicos que van desde la recombinación y reparación del ADN a los aspectos de la inmunología molecular y celular. Ensayo in vitro RSE implica la superficie de medición expresión Ig de citometría de flujo en células B activadas. Si bien la medición de IgA e IgG subclases es sencillo, la medición de IgE por este método es problemático debido a la IgE soluble unión a FcεRII / CD23 expresado en la superficie de las células B activadas. Aquí se describe un procedimiento único para la medición precisa de IgE productoras de células B de ratón que han sido objeto de la RSE en la cultura. El método se basa en la escisión de tripsina-mediada de complejos IgE-CD23 en la superficie celular, lo que permite la detección de células de linaje B productoras de IgE por CYtinción toplasmic. Este procedimiento ofrece una solución conveniente para el análisis de citometría de flujo de la RSE a la IgE.

Este procedimiento se ha aplicado con éxito para estudiar la RSE a la IgE en las células B de ratón. Para demostrar la eficacia en la medición de la RSE, estimulamos las células B esplénicas de ratón con anti-CD40 y IL-4 como se describió previamente 11. Después de cinco días de estimulación, se recogieron las células y se procesaron usando el protocolo descrito anteriormente y se tiñeron con B220 (CD45R) anticuerpos IgM marcado con fluorescencia, IgG1, IgE, y. Cerrado en los linfocitos de voladura (F...

El análisis in vitro de la recombinación de interruptores de clase en ratones es un desafío debido a las moléculas citofílicas de IgE unidas a los receptores Fc en la superficie de las células B. Describimos un método para la detección de IgE utilizando la escisión mediada por tripsina de IgE unida a la superficie antes de la fijación y permeabilización para la tinción con fluorescencia citoplasmática.

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

El objetivo general del siguiente experimento es distinguir los linfocitos B que expresan IgE verdadera de los linfocitos B, que expresan otros isotipos de IgE secretados por IgE. Durante los ensayos de conmutación de clase in vitro, los ensayos se unen a las proteínas de la superficie de las células B, lo que oscurece la capacidad de medir el cambio de clase a IgE. El objetivo se logra eliminando primero las moléculas de IgE unidas al receptor antes del análisis mediante el uso de tripsina, que no escinde específicamente las proteínas de la superficie celular mientras deja intactas las moléculas de inmunoglobulina intracelular producidas endógenamente.En segundo lugar, las proteínas intracelulares se exponen fijando las células B con formina y perme las células con metanol. A continuación, las células se tiñen con anticuerpos marcados con fluorescencia para revelar las inmunoglobulinas intracelulares. Los resultados muestran una población distinta de células B IgE positivas.Si se utiliza tripsina en base al análisis de citometría de flujo, los estudios sobre la biología de la IgE han sido limitados debido a la dificultad para detectar las células productoras de IgE. Este método proporciona una solución accesible que los laboratorios pueden adoptar fácilmente para acelerar nuestra comprensión de esta interesante molécula. Esta técnica es ventajosa sobre los métodos existentes para eliminar el efecto de la IgE unida al receptor.Por ejemplo, es menos costoso que bloquear la IgE de superficie con anticuerpos anti IgE y más tolerante que un tratamiento de lavado ácido. Aunque este método puede proporcionar información sobre el análisis de la clase de células B de ratón, el cambio al tratamiento con IgE con tripsina antes de la tinción también podría aplicarse a otros protocolos que requieren la eliminación de proteínas de superficie de un bazo de ratón recién recolectado. Prepare una suspensión de una sola celda.Presione suavemente el órgano a través de un filtro de células de 70 micras usando el émbolo de una jeringa de tres mililitros. Recoja las células en un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de un XPBS. A continuación, centrifugar las células a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Decantar el supra nadante y volver a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lisado de glóbulos rojos. Deje pasar la reacción de lisis durante cinco minutos antes de neutralizarla con 13,5 mililitros de un XPBS. A continuación, vuelva a centrifugar las células a 300 Gs durante cinco minutos y vuelva a suspender el pellet en el volumen residual.Ahora agregue medios de estimulación de células B calientes que contengan IL 4 y anti CD 40 a las células. Comience con un cultivo de ocho mililitros dividido en dos pocillos de una placa de cultivo de seis pocillos y estimule las células a 37 grados centígrados durante cinco días. Revise el cultivo diariamente para mantener las células en 1 millón por mililitro.Ajuste una concentración dividiendo los cultivos en otros pocillos y diluyéndolos con estimulación de células B. Medios que contienen IL 4 fresco y anti CD 40. Comience recolectando hasta 10 millones de células B estimuladas en un tubo cónico de 15 mililitros.A continuación, centrifugarlos a 300 Gs durante cinco minutos y decantar el sobrenadante para eliminar la proteína residual del medio de recogida de células. Lave las células B con 10 mililitros de PBS seguido de otra centrifugación y decantación del snat Después de la decantación, vuelva a suspender el pellet de la célula en el volumen residual de aproximadamente 100 microlitros y agregue con cuidado 800 microlitros de 0.1% a temperatura ambiente en EDTA. Agregue la solución lentamente a lo largo de la pared lateral del tubo.Agregue una inclinación, luego tape el tubo y mezcle suavemente pasando el líquido a lo largo del tubo. Cinco o seis veces puede formarse un precipitado blanco fibroso en la solución en un minuto. Apague la reacción con un mililitro de FCS frío.Mantén las células en hielo. Ahora siguen vivos y pueden expresar nuevas proteínas de superficie. Diluya inmediatamente el FCS agregando 10 mililitros de PBS frío.Elimine cualquier residuo flotante con una pipeta. Gira las celdas a cuatro grados centígrados. Decantar inmediatamente el snat y volver a suspender las celdas en el volumen residual.Si es necesario, aumente el volumen a 100 microlitros con PBS frío procediendo rápidamente en una campana extractora a 800 microlitros de pipeta de formina tamponada neutra al 10%, la mezcla hacia arriba y hacia abajo del tubo comenzará a calentarse una vez mezclada, incube las células en el fijador durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Mientras tanto, configure un mezclador de vórtice de sobremesa a una velocidad de agitación suave y prepare el metanol frío a menos 20 grados Celsius para su uso. Cuando las células terminen de incubarse.Extraiga nueve mililitros de metanol en una pipeta serológica. A continuación, destapamos suavemente el tubo mientras añadimos el metanol gota a gota. Después de dispensar dos mililitros de metanol, acelere gota a gota hasta un chorro lento.Ahora deje que el tubo se asiente sobre hielo durante 30 minutos para permear las células. Alternativamente, las celdas se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados durante un mes. Comience el procedimiento de tinción centrifugando primero las células de permea y decantando el metanol.Un precipitado blanco puede pellet con las células. A continuación, lavar las células mezclando en 10 mililitros de temperatura ambiente una centrífuga y decantación XPBS. Realice este paso de lavado dos veces.A continuación, realice un lavado adicional con 10 mililitros de fax 2%FCS, tampón y vuelva a suspender. El pellet en el volumen residual procede cargando la muestra en un pocillo de una placa de fondo redonda de 96 pocillos. Por lo general, muchas muestras se procesan en paralelo.Cargue de 20 a 50 microlitros con una centrífuga giratoria de placas y calófuga las celdas a 300 Gs durante cinco minutos. A continuación, decanta la nariz y pon el plato en hielo. Ahora tiñe las células a cada pocillo, agregue 60 microlitros de tampón de fax FCS al 2% que contiene cuatro anticuerpos diferentes.Deje que las células se incuben en la mancha durante cinco minutos después de la mancha. Lave las celdas agregando 150 microlitros de terciopelo de fax FCS al 2%. A continuación, centrifugar la placa como antes, a continuación, decantar la solución y volver a suspender las células.Utilice 400 microlitros de búfer de fax 2%FCS. Ahora pipetea las células a través de un colador de células de nailon de 40 micras en un tubo de fax de cinco mililitros para la puerta de fax. Las células, aislando primero las células CD 45 R positivas, también conocidas como B dos células 20 positivas de la población de linfocitos blasting en la gráfica F-S-C-S-S-C y luego de las B dos 20 células positivas.Utilice la gráfica de IgE e IgG para revelar las poblaciones correspondientes utilizando este procedimiento. Se estudió la recombinación de cambio de clase a IgE en células B de ratón utilizando una estrategia de activación basada en los linfocitos blasting. Una población clara de células IgE positivas no pudo discriminarse limpiamente sin la tripsina de las células, la tripsina antes de la fijación y la permeación permitieron la separación de las células productoras de IgE debido a la eliminación de la IgE unida a la superficie una vez dominada.Esta técnica de tinción se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Trabajar con formalina y metanol puede ser peligroso. Por lo tanto, siempre se debe utilizar una fuma y siempre se debe usar el equipo de protección personal adecuado mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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