Name: TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprende a evaluar la dinámica de vesículas de neurotransmisor en células SH-SY5Y mediante microscopía TIRFM y sondas GFP sensibles al pH. Este método permite analizar la fusión y reciclaje vesicular con alta resolución.

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Los autores desean reconocer la Università degli Studi di Milano para el apoyo a Eliana Di Cairano (beca post-doctoral) y Stefania Moretti (beca de doctorado). Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de la Universidad de PUR CP Nos gustaría dar las gracias al profesor Jeremy M. Henley, Facultad de Bioquímica de la Universidad de Bristol, Reino Unido, por el pHluorin construir y el Dr. Francesco Dotti para la asistencia en el análisis de datos, y Silvia Marsicano para la asistencia técnica.

1. Cultivo celular y transfección <ol><li> Cultivo de células SH-SY5Y NOTA: Los experimentos se han realizado utilizando el neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. Células SH-SY5Y crecen como una mezcla de grupos flotantes y las células adherentes. Siga las instrucciones indicadas en el protocolo (densidad celular, relación de división, etc.) Para tener células que crecen firmemente unidos a la cubierta de cristal, que es crucial para TIRFM. <ol><li> Antes de comenzar, bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, hacer que el volumen oportuna de solución de fosfato estéril solución salina tamponada (PBS) y medio de cultivo. <ol><li> Hacer 50 ml de PBS con concentraciones de NaCl 150 mM, tampón fosfato 24 mM, pH 7,4. Se filtra la solución. </li><li> Hacer 50 ml de medio de células de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml), L-glutamina ( 2 mM), ypiruvato de sodio (1 mM). Se filtra la solución. </li></ol></li><li> Retire medio de crecimiento completo y lavar las células con 3 ml de PBS. </li><li> Se incuban las células con 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,05% (EDTA) (por 6 cm plato Petri) durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 y separar las células con una pipeta. </li><li> Inactivar la tripsina mediante la adición de 2 ml de DMEM, y recoger las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante, añadir 1 ml de DMEM al sedimento y la pipeta la solución arriba y hacia abajo suficientemente para dispersar las células en una sola suspensión celular. </li><li> Ellos dividieron 1: 4 en una nueva placa de Petri de diámetro 6 cm que contiene 3 ml de medio completo. Mantener las células en cultivo en placas de 6 cm de diámetro Petri, a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Sub-cultivo una vez a la semana o cuando se han cubierto 80 - 90% de la superficie. </li></ol></li><li> Chapado de células SH-SY5Y para imágenes <ol><li> Para los experimentos TIRFM, placacélulas sobre cubiertas de vidrio. Emplear vidrio cubre con 0,17 ± 0,005 mm de espesor y un índice de refracción 1,5255 ± 0,00015. Antes de empezar, prepare los cubreobjetos de vidrio de la siguiente manera: <ol><li> Limpie el vidrio cubre con etanol al 90%, O / N. </li><li> Enjuague bien en agua destilada (tres cambios de agua destilada). Vidrio seco cubre en un horno de secado. </li><li> Lugar cubre en platos Petri de vidrio y esterilizar en un horno precalentado a 200 ° C durante 3 horas. </li></ol></li><li> El día antes de la transfección, coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 3,5 cm, agregar 1 ml de medio de cultivo y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. </li><li> Tripsinizar las células como se describe en los pasos 1.1.3 - 1.1.5, suspender el sedimento celular en 1 ml de medio completo y contar. Calcular el volumen correcto de la suspensión celular para añadir a cada plato Petri para producir 3 x 10 5 células / pocillo. Se requiere esta densidad óptima para el crecimiento celular y transfección eficiente. Se incuba a 37 ° Cen un incubador de CO2 al 5% O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection por polietilenimina (PEI) NOTA: Para visualizar la dinámica de las vesículas sinápticas, se ha utilizado vector que contiene pCB6 synapto-pHluorin. El synapto-pHluorin ha sido generada por fusión en el marco de una variante sensible al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) 16 y la proteína de membrana vesicular sinaptobrevina 2. La construcción se ha empleado ampliamente para investigar las propiedades de vesículas sinápticas dentro de las neuronas 9. <ol><li> Antes de iniciar la transfección, hacer 10 ml de las siguientes soluciones. Mantenga las soluciones como máximo 1 mes. <ol><li> Hacer una solución 150 mM de NaCl. Ajustar el pH a 5,5 con HCl 0,01 N. </li><li> Prepare una solución de PEI en el 10% de polietilenimina (PEI; 25 kDa lineal) en solución de NaCl 150 mM. El pH de la solución se eleva a 8,8. Ajustar el pH a 7,8 con HCl 0,01 N. </li></ol></li><li> 24 horas después de la siembra, se elimina el medio y refrescar con 1,5 ml demedio completo. Mantenga las células a 37 ° C, en un incubador de CO2 al 5%. </li><li> Bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 3 g de ADN plásmido a 25 l de solución de NaCl 150 mM y 100 l de solución de PEI por 3,5 cm de placa de Petri. </li><li> Vortex durante 10 segundos, a continuación, incubar la mezcla de ADN / PEI durante 30 min a RT. </li><li> Añadir con cuidado la mezcla de ADN / PEI a la placa de Petri que contiene cubreobjetos con células y agitar suavemente para distribuir por igual el reactivo en la placa de Petri. </li><li> Después de 4 horas cambiar el medio y se incuban las células O / N a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Realizar experimentos de imagen 24 a 48 horas después de la transfección. </li></ol></li></ol> Imagen 2. Celular por reflexión interna total microscopía de fluorescencia (TIRFM) <ol><li> Imaging configuración <ol><li> Realizar imagen TIRF con la puesta a punto se describe en la Figura 1. Comprende un motorizado invertidamicroscopio (Figura 1, recuadro A), la fuente de láser (Figura 1, recuadro B) y el TIRF deslizante (Figura 1, recuadro C). Alcanzar la iluminación TIRFM a través de una alta apertura numérica (NA 1.45 Alfa Plan-Fluar) aceite de 100X, objetivo de inmersión. </li><li> Para la iluminación TIRFM, emplear una multilínea (458/488/514 nm) 100 mW láser de argón-ion. El uso de una fibra monomodo, introducir la luz láser polarizada linealmente en la trayectoria del rayo, mediante el control deslizante TIRF. Insertar el control deslizante TIRF en el plano diafragma de campo luminoso de la trayectoria del haz de luz incidente. <ol><li> Por amplia iluminación de campo, conecte el microscopio a una lámpara de mercurio de arco corto convencional HBO luz blanca. Un doble prisma mantenedora de polarización en el control deslizante asegura la combinación simultánea de TIRF iluminación y luz blanca. </li></ol></li><li> Se filtra la luz láser con un filtro de excitación (banda ancho de 488/10 nm) montado en una rueda de filtros, introducido en la trayectoria del láser. Emplearuna alta velocidad, controlado por software, obturador para permitir un control rápido de la iluminación láser. Para el análisis pHluorin, montar una banda paso 525/50 nm filtro de emisión. Captura imágenes digitales (512 x 512 píxeles) en una cámara CCD enfriado rápido con el software Image ProPlus. </li></ol></li><li> El logro de la iluminación TIRF (Figura 2) <ol><li> Encienda el láser, el ordenador, la cámara y la rueda de filtros, y los controladores de obturación; luego, esperar 20 minutos antes de comenzar el experimento como los láseres necesitan calentarse y estabilizarse. </li><li> Antes de formación de imágenes, hacer que el volumen oportuno de las siguientes soluciones. <ol><li> Hacer 50 ml de solución de Krebs (KRH) en NaCl 125 mM, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) (tamponada a pH 7,4), 2 mM CaCl 2, y glucosa 6 mM. </li><li> Hacer 10 ml de solución de KCl-KRH (pH 7,4) en NaCl 80 mM, KCl 50 mM, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (tamponada a pH 7,4), 2 mM CaCl 2, y glucosa 6 mM. </li></ol></li><li> Retire la cubierta de cristal con células transfectadas e insertarlo en la cámara de imagen apropiado. Montar la cámara y añadir 500 l de solución KRH en el centro del cristal. </li><li> Añadir el aceite sobre el objetivo. Coloque la cámara de imágenes en la platina del microscopio y la posición del objetivo bajo el cubreobjetos de vidrio. Colocar la tapa de seguridad sobre la muestra. </li><li> En el modo de epifluorescencia, se centran en el cubreobjetos (superficie superior) y elija células transfectadas colocados en el centro de la cámara. Seleccione las celdas cuya señal fluorescente puede grabarse claramente utilizando un tiempo de exposición por debajo de 80 ms. </li><li> Bajo el control del software, cambiar a la iluminación TIRF en modo directo. </li><li> Para establecer la configuración TIRF, compruebe la posición del haz que emerge del objetivo, en la portada de la muestra (Figura 2B). Cuando el haz se coloca en el centro de tél lente objetivo (Figura 2A, izquierda), un lugar es visible en el centro de la cubierta de la muestra TIRF (Figura 2B, a la izquierda) y la célula se forma la imagen en el modo de epifluorescencia (varios planos de enfoque, de alta fluorescencia de fondo; Figura 2C, izquierda) . </li><li> Para alcanzar el ángulo crítico, mover el punto enfocado en la dirección Y (hacia adelante o hacia atrás; Figura 2B, centro) con el tornillo de ajuste del ángulo en el control deslizante TIRF (Figura 1C). Cuando el haz converge en el plano de la muestra en un ángulo mayor que el ángulo crítico (Figura 2A, derecha), el punto desaparece y una, delgada, línea recta centrado es evidente en el medio de la cubierta de la muestra (Figura 2B, derecha). </li><li> Para ajustar el ángulo TIRF utilizar la muestra de células (Figura 2C). Ver la imagen de fluorescencia en el video, en esta etapa, una imagen-epifluorescencia como aún es visible. Con cuidado, mueva el tornillo hasta TIRF concondición se logra: un solo plano óptico de la celda está en el foco (es decir, la membrana plasmática en contacto con la hoja de la cubierta), esto resulta en una imagen plana con alto contraste (Figura 2C, derecha). </li></ol></li><li> Muestra imágenes <ol><li> Ajuste el canal único experimento de lapso de tiempo. Para minimizar fotoblanqueo, capturar la imagen con bajo tiempo de exposición y de alta ganancia. Tiempos de exposición apropiados son entre 40 - 80 ms. Adquirir imágenes en 1 - 2 Hz de frecuencia de muestreo. La cinética de vesículas de muestreo pueden ser mejor apreciado en mayor frecuencia (10 Hz). El tiempo regular de observación es generalmente de 2 min. </li><li> Añadir 500 l de células de solución KRH y grabar en el modo de TIRFM. Esta es la condición de reposo. Guarde las imágenes secuenciales de tiempo. </li><li> Centrarse en la misma celda y registro en las mismas condiciones de reposo (potencia láser, tiempo de exposición, de número de fotograma). Después de cinco marcos, añadir 500 l de solución de KCl-KRH y mantener KCl en la cámara.Esta es la condición estimulada; guardar las imágenes secuenciales de tiempo. </li></ol></li></ol> Análisis 3. Imagen y Procesamiento de Datos NOTA: Para analizar las imágenes, macros se han desarrollado en el laboratorio, basado en funciones existentes del software de análisis de imagen; macros similares están disponibles en línea (URL proporcionado en la Tabla de Materiales y Equipos). <ol><li> Cuantificación intensidad de fluorescencia <ol><li> Utilice una macro &quot;intensidad de fluorescencia Sequence&quot; para la cuantificación intensidad de fluorescencia en una región de interés (ROI) de la imagen, en el transcurso de la película. </li><li> Abra las imágenes en tiempo secuencial. Ir al menú de macro y seleccione &#39;intensidad de fluorescencia Secuencia&#39;. En la ventana &quot;Análisis&quot; aparece &quot;seleccione el retorno de la inversión&quot;. </li><li> Elija una de las herramientas de selección en el menú para crear el ROI. Coloque 3 ROIs en las regiones de la membrana celular sin manchas (fondo ROI). Emplear this &quot;fondo ROI&quot; para evaluar la photobleaching y para establecer el umbral para el análisis de actividad de fusión (Figura 3A). </li></ol></li><li> Corrección Photobleaching y determinación del umbral (Figura 3B) <ol><li> Para evaluar la fotoblanqueo, abra las filas de fluorescencia intensidad &quot;ROI de fondo&quot;, (Figura 3ba). Normalizar los valores de intensidad de fluorescencia en cada marco para el valor de intensidad inicial (F0) (F / F0) (Figura 3BB). La media de los valores. </li><li> Resaltar los datos medios y crear un esquema lineal utilizando las opciones de menú gráfico. </li><li> Desde el menú de análisis de datos, seleccione &quot;línea de tendencia&quot; para abrir el diálogo de análisis de la representación. Seleccione el tipo de regresión. Ajuste de regresión &quot;exponencial&quot;. A continuación, seleccione &quot;ecuación de pantalla en la carta&quot;. En la ventana gráfica, la ecuación exponencial aparece y los valores de los parámetros se asignan automáticamente, (Figura 3bc </strong&gt;). </li><li> Aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada trama de la siguiente manera: Fn (corregido) = Fn / exp (-n * a) Fn = intensidad de la fluorescencia experimental medido en la trama n; n = número de fotogramas; a = factor de blanqueo (constante que expresa la tasa de pérdida de intensidad debido a photobleaching; &#160; Figura 3Bd). </li><li> Para establecer el umbral, abrir un normalizado y corregido &quot;fondo ROI&quot;, calcular la media de la señal de fluorescencia y su desviación estándar (SD). El valor promedio más 3 SD representa el umbral (Figura 3be). Utilice este umbral para el análisis de datos. </li></ol></li><li> Selección de los eventos de fusión utilizando un procedimiento semiautomático <ol><li> Abra las imágenes secuenciales en el tiempo con el software de análisis de imágenes. Aplicar un filtro de Gauss a la secuencia de imagen activa. </li><li> Analizar las imágenes con la función &quot;contar objetos&quot; o una macro que permite la selecciónde un objeto cuya píxeles tienen intensidad media de fluorescencia dentro de un rango definido. Ajuste el rango de intensidad de forma manual, utilizando la función de umbral (ir al menú de la barra, defina medida → umbral para resaltar el área de interés). Un umbral adecuado es 30% más que la señal de fondo fluorescente local. </li><li> Aplicar una macro &quot;Filtros de objetos&quot; para seleccionar sólo los objetos que cumplan los siguientes criterios: <ol><li> Aplicar opción rangos (mínimo y máximo incluido) para los aspectos. Aspecto informa de la relación entre el eje mayor y el eje menor de la elipse equivalente al objeto. Aspect es siempre ≥1. Valores adecuados min = 1, max = 3. </li><li> Aplicar rangos de diámetro. Diámetro informa de la duración media de los diámetros medidos a intervalos de dos grados que une dos puntos de contorno y que pasa a través del centroide del objeto. Ajuste el rango de píxeles (o en micras, si se utiliza un sistema calibrado). </li><li> Defina el rango óptimo en preliminexperimentos ary: seleccionar manualmente los puntos de interés y luego medir su diámetro utilizando la función de perfil parcela. </li></ol></li><li> Seleccione &quot;objetos de visualización&quot;: los objetos seleccionados se presentarán superpuestas a la imagen TIRFM (Figura 4B). </li><li> Incluir en el análisis sólo aquellos puntos que muestran un corto (uno a tres marcos) aumento transitorio de la intensidad de fluorescencia, seguido inmediatamente por una marcada pérdida de señal (puntos transitorios). Emplear la selección circular para crear un retorno de la inversión de diámetro aproximadamente un punto radialmente alrededor de las vesículas seleccionados / spots (ROI experimental). Realice este paso manualmente. </li><li> Con las ROIs seleccionado, calcular la intensidad media de fluorescencia de cada ROI en el transcurso de la película. </li></ol></li><li> Análisis de los datos (Figura 3C-D) <ol><li> Exportar el curso de tiempo de los cambios de fluorescencia medidos en cada &quot;ROI experimental&quot; a una hoja de cálculo; (Figura 3DA). Normalizar el valor de intensidad en cada trama a la intensidad de fluorescencia inicial (F / F0), (Figura 3Db). </li><li> Aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada trama como se informó en el paso 3.2.4 (Figura 3Dc). </li><li> Para calcular el número total de eventos de fusión (número de pico), el tiempo se produce cada fusión (anchura de pico) y la amplitud de pico fluorescente (altura del pico y AUC) aplicar funciones lógicas utilizando los paquetes de hojas de cálculo o matemáticas. Un ejemplo de análisis de eventos de fusión usando fórmulas lógicas se informó en la Figura 3Dd y 3De. </li><li> Suponga que el aumento de la intensidad de fluorescencia que excede el umbral (intensidad media de fluorescencia de fondo ± 3SD) como la fusión de vesículas a la membrana plasmática y el pico resultante como un evento de fusión. </li><li> Calcular la anchura de pico como diferencia entre el último y el primer valor de x de cada pico. Multiplique este valor por 1 / (frecuencia de muestreo). Considere este valor uns el momento de la fusión de vesículas y la adhesión a la membrana plasmática antes vesícula re-acidificación y reciclaje (Figura 3Dd). </li><li> Calcular el AUC de células enteras como una suma de los valores por encima del umbral. Considere este valor como el cambio neto fluorescente durante el tiempo de grabación debido a la espontánea (en reposo) o evocada (estimulado) la actividad sináptica. </li><li> Calcular la altura del pico como la diferencia entre el valor máximo y de cada pico y el umbral. Considere este valor como indicativo del tipo de fusión (fusión única vs. simultánea / secuencial o transitoria vs. fusión completa). </li></ol></li></ol>

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<li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este artículo presenta un protocolo para la imagen y analizar la dinámica de vesículas en las células secretoras, utilizando vectores cDNA codificada fluorescentes y TIRFM. Los elementos clave del éxito de formación de imágenes por TIRFM son la selección del modelo celular y transfección celular con indicadores ópticos genéticamente codificados de la liberación de vesículas y el reciclaje. TIRFM es ideal para las células de crecimiento adherente a una cubierta de vidrio planas y suficienteme...

La transmisión sináptica química entre las neuronas es un mecanismo principal de la comunicación en el sistema nervioso. Se basa en la liberación de neurotransmisores a través de un ciclo dinámico de la fusión de vesículas y la recuperación en el sitio presináptica. Muchas de las proteínas implicadas en la dinámica de vesículas han sido identificados; Sin embargo, su contribución específica al fenómeno queda por aclarar 1. Nuestro entendimiento está parcialmente limitada por el hecho de que los ensayos más utilizados para exo / endocitosis no siempre son las más adecuadas. Varios estudios relacionados con la fusión de vesículas y la dinámica se basan en técnicas electrofisiológicas. Esta técnica proporciona una resolución temporal óptimo y es excelente para la investigación de la fusión inicial de vesículas a la membrana plasmática, pero es incapaz de detectar muchos de los eventos moleculares subyacentes que apoyan la función presináptica. La microscopía electrónica, en el otro lado, ofrece la mejor morphological descripción de cada paso singular, pero el aspecto dinámico del evento no puede ser capturado, ya que las muestras deben ser fijados con el fin de ser analizados. El advenimiento de nuevas técnicas de grabación óptica de 2,3, en combinación con los avances en el desarrollo de sondas moleculares fluorescentes 4-6, permite la visualización de los procesos de exocytic en células vivas, proporcionando así nuevos niveles de información sobre la estructura y la función sináptica. Los estudios iniciales explotadas tintes dependientes de la actividad de estirilo (FM1-43 y tintes orgánicos relacionados) 7,8. Estado-of-the-art técnicas de imagen emplean variantes sensibles al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) atado a proteínas vesículas luminales 9. Estas sondas están normalmente desconectados cuando está presente en las vesículas debido al bajo pH luminal. Después de la fusión con la membrana plasmática, el interior de vesículas se expone al espacio extracelular neutral, el pH<html> aumenta abruptamente, alivia la extinción de protones dependiente de pHluorin y la señal fluorescente aparece rápidamente. Como el cambio en pHluorin es más rápido que el evento de fusión, mediante el control de los incrementos de fluorescencia, la fusión de vesículas con la membrana se puede medir y analizar. Debido a que las moléculas de pHluorin-etiquetado de superficie se endocitosis, la señal de fluorescencia posteriormente vuelve al nivel basal, por lo tanto, la misma construcción puede utilizarse también para controlar la vesícula reciclaje 9. Mientras que el sensor de pH de vesículas etiquetado asegura la visualización solamente de las vesículas que realmente se fusionan con la membrana plasmática, se requiere formación de imágenes en alta resolución espacial y temporal para describir en detalle los pasos implicados en los procesos de endocitosis exo /. La técnica óptica que proporciona la resolución espacio-temporal es necesario microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM), una aplicación de la microscopía de fluorescencia 10. &quot;&gt; La reflexión interna total se produce en la interfase entre el cubre de vidrio y la muestra. Cuando la trayectoria de la luz alcanza el cubre de vidrio con un ángulo de incidencia mayor que el ángulo crítico, la luz de excitación no se transmite en la muestra, pero es completamente reflejada de nuevo. En estas condiciones, un evanescentes formas de onda de la luz en la interfase y se propaga en el medio con menos densidad óptica (la muestra). Como la intensidad del campo evanescente decae exponencialmente con la distancia desde la interfaz (con una profundidad de penetración de alrededor de 100 nm) sólo los fluoróforos en la proximidad más cercana a la hoja de la cubierta puede ser excitado mientras que aquellos más lejos de la frontera no lo son. En las células transfectadas con GFP-construcciones, esta profundidad corresponde a las proteínas expresadas en la membrana plasmática o en estructuras vesiculares acercarse a ella. Como fluoróforos en el interior de la célula no pueden ser excitados, la fluorescencia de fondo se reduce al mínimo, y una imagen con una señal de muy alta / fondo de rataio se forma 11. Varias características hacen TIRFM la técnica de elección para el seguimiento de la dinámica de las vesículas. El contraste perfecto y la relación señal a ruido más alta relación de permiten la detección de señales muy bajas derivadas de vesículas individuales. Adquisición de imágenes basado en un chip en cada cuadro proporciona la resolución temporal necesaria para detectar procesos altamente dinámicos. Por último, la mínima exposición de las células a la luz en cualquier otro plano de la muestra reduce fuertemente la fototoxicidad y permite la grabación de largo lapso de tiempo duradero 12. Análisis de los datos sigue siendo el aspecto más difícil y crucial de esta técnica. La manera más simple para monitorizar la fusión de vesículas es medir la acumulación de proteínas fluorescentes reportero en la superficie celular, con el tiempo 13. A medida que aumenta la fusión, neto aumenta señal de fluorescencia así. Sin embargo, este método puede subestimar el proceso, sobre todo en las células grandes y en condiciones de reposo,porque los procesos de endocitosis y fotoblanqueo compensar el aumento en la intensidad de fluorescencia debido a la exocitosis de vesículas. Un método alternativo es seguir cada evento de fusión única 14. Este último método es muy sensible y puede revelar detalles importantes sobre los mecanismos de fusión. Sin embargo, requiere la selección manual de los eventos individuales, porque los procedimientos completamente automatizados para seguir vesículas y registrar la fluctuación de sus señales fluorescentes no siempre están disponibles. Observación de la dinámica de vesículas requiere células de muestreo a alta frecuencia. Esto genera una gran cantidad de datos que difícilmente pueden ser analizados manualmente. La propuesta de este trabajo es optimizar la técnica de imagen TIRFM para el seguimiento de la basal y estimulado la liberación de neurotransmisores en la línea celular de neuroblastoma SH-5YSY, y describir, paso a paso, un procedimiento desarrollado en el laboratorio para analizar los datos, tanto en los niveles de células enteras y de una sola vesícula.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipamiento</td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>491912-9850-000</td><td>microscopio invertido</td></tr><tr><td>Láser de argón multilineal Lasos 77</td><td><a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lasos</a></td><td>00000-1312-752</td><td>multilínea (458/488/514 nm), 100&amp;nbsp;láser de iones de argón de mW</td></tr><tr><td>Deslizador láser TIRF</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>423681-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo 100X</td><td><a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;amp;p=us&amp;amp;f=o&amp;amp;a=v&amp;amp;m=a&amp;amp;id=421190-9900-000&amp;amp;ss=1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>421190-9900-000</td><td>Aceite, NA 1,45 Alpha-Plan</td></tr><tr><td>Cámara CCD RetigaSRV Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> QImaging</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cambiador de filtros ópticos LAMBDA 10-3 con SmartShutter</td><td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sutter Instrument Company</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Software Image ProPlus 6.3</td><td><a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td></td><td>selección de puntos, selección de regiones de interés (ROI), determinación de la intensidad de fluorescencia</td></tr><tr><td>Excel</td><td><a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td></td><td>corrección de fotoblanqueo, análisis de célula completa y de vesículas individuales</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 4.00</td><td><a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad Software, Inc.</a></td><td></td><td>análisis estadístico</td></tr></tbody></table>

tirfm y gfp-sondas sensibles al ph para evaluar neurotransmisor vesícula dinámica en células sh-sy5y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Las vesículas sinápticas liberan neurotransmisores en las sinapsis químicas a través de un ciclo dinámico de la fusión y la recuperación. Supervisión de la actividad sináptica en tiempo real y la disección de los diferentes pasos de exo-endocitosis en el nivel de una sola vesícula son cruciales para la comprensión de las funciones sinápticas en salud y enfermedad. Genéticamente codificados sondas sensibles al pH directamente dirigidos a las vesículas sinápticas y Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) proporcionan la resolución espacio-temporal necesario seguir la dinámica de la vesícula. El campo evanescente generada por la reflexión interna total sólo puede excitar fluoróforos colocados en una capa delgada (&lt;150 nm) por encima de la cubierta de vidrio sobre el cual las células se adhieren, exactamente donde los procesos de exo-endocitosis tienen lugar. Las imágenes de alto contraste resultantes son ideales para vesículas de seguimiento y análisis cuantitativo de los eventos de fusión. En este protocolo, SH-SY5Y n humanaeuroblastoma células se proponen como un modelo valioso para el estudio de la liberación de neurotransmisores en el nivel de una sola vesícula por TIRFM, debido a su superficie plana y la presencia de vesículas dispersas. Los métodos para el cultivo de SH-SY5Y como células adherentes y para transfectar con synapto-pHluorin se proporcionan, así como la técnica para llevar a cabo TIRFM y de imagen. Por último, se presenta una estrategia con el objetivo de seleccionar, contar y analizar los eventos de fusión a nivel de células enteras y de una sola vesícula. Para validar el método de análisis de procedimiento de imágenes y datos, la dinámica de las vesículas de etiquetado pHluorin se analizan bajo reposo y estimuladas (despolarizar las concentraciones de potasio) condiciones. Despolarización de la membrana aumenta la frecuencia de eventos de fusión y causa un aumento paralelo de la señal de fluorescencia neta registrada en células enteras. Análisis de una sola vesícula revela modificaciones del comportamiento de fusión-evento (altura máxima y una mayor anchura). Estos datos sugieren ésimoen la despolarización de potasio no sólo induce una liberación masiva neurotransmisor sino también modifica el mecanismo de la fusión de vesículas y reciclaje. Con la sonda fluorescente apropiada, esta técnica se puede emplear en diferentes sistemas celulares para diseccionar los mecanismos de secreción constitutiva y estimulado.

Los procedimientos de imágenes TIRF y datos de análisis descritos están diseñados para estudiar la dinámica de vesículas en los sistemas celulares. Esta técnica se puede utilizar para determinar los efectos de las moléculas de señalización y las drogas en los eventos de fusión y la dinámica de vesículas de neurotransmisores 17. El uso de proteínas de la membrana plasmática GFP-etiquetados, el análisis TIRFM se ha empleado para caracterizar el tráfico constitutiva de los transportadores de glutamato GFP-etique...

Este artículo proporciona un método para investigar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma, utilizando una construcción de sinaptobrevina2-pHluorin y Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total. También se reporta la estrategia desarrollada para el procesamiento de imágenes y análisis de datos.

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar la dinámica de las vesículas de los neurotransmisores en las células de neuroblastoma utilizando sondas sensibles al pH y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total o tierra de césped. Esto se logra primero colocando las células en cubreobjetos de vidrio y seccionándolas con sondas fluorescentes sensibles al pH codificadas genéticamente para la fusión y el reciclaje de vesículas, que se dirigen selectivamente a las vesículas sinápticas. La expresión de la proteína se espera dentro de las 24 a 48 horas.El segundo paso es registrar la dinámica de las vesículas mediante microscopía de reflexión interna total. Este paso es particularmente crítico para el éxito del experimento y se proporciona una descripción paso a paso sobre cómo lograr la configuración del césped. Próximo. Una vez que se alcanza la configuración correcta del césped, las imágenes secuenciales pueden ser registradas automáticamente por el software en condiciones basales o estimuladas.El paso final es procesar las imágenes y extraer los datos de los videos utilizando software comercial o algoritmos caseros. En última instancia, el uso de la microscopía de césped para registrar los cambios en la señal fluorescente derivada de la fusión de vesículas a la membrana plasmática. Es posible obtener información sobre la frecuencia de los eventos de fusión y el modo de fusión de las vesículas.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como por ejemplo, la electromicroscopía y la electrofisiología, es que proporciona la solución especial y temporal necesaria para detectar la dinámica de las vesículas. De hecho, las imágenes altamente contrastadas obtenidas por esta técnica permiten detectar señales de vesículas individuales. El análisis de adquisición de imágenes base baratas proporciona la solución temporal necesaria para detectar la dinámica.Este método puede ayudar a responder a una pregunta clave en el campo de la ciencia nerviosa, como la comprensión del papel de una proteína sináptica particular en la dinámica de la bicicleta, o el mecanismo de acción de los fármacos que actúan sobre las transmisiones sinápticas. Generalmente, las personas nuevas en este tema, luchamos con ese análisis porque los procedimientos completamente automáticos para seguir la vesícula y registrar la fluctuación de la señal PROE no siempre están disponibles. La idea de este método fue cuando decidimos investigar el impacto de la proteína mutante o sináptica patógena en la liberación de vesículas transmisoras de Nevo.Los métodos existentes no eran lo suficientemente exhaustivos, por lo que decidimos montar esta técnica en la línea celular de neuroblastoma SH SY five one para llegar a la solución adecuada. La demostración visual de este método es fundamental, ya que algunos pasos clave, como la forma de lograr la configuración de nivel cuatro y cómo extraer los datos cuantitativos de los videos, son fundamentales para explicar usando Word, mientras que puede ser más comprensible y persuasivo. Si se visualiza.Para realizar imágenes del césped, configure un microscopio invertido motorizado, una fuente láser y el control deslizante del césped como se describe en el protocolo de texto. Para lograr la iluminación del césped. Retire la cubierta de vidrio con células transfectadas e insértela en la cámara de imagen adecuada.Monta la cámara y añade 500 microlitros de solución de timbre Krebs en el centro del vaso. Luego agregue aceite sobre el objetivo. Coloque la cámara de imágenes en la platina del microscopio y coloque el objetivo debajo de la cubierta de vidrio.Coloque la cubierta de seguridad sobre la muestra en modo de epifluorescencia. Concéntrese en el cubreobjetos y elija las células transfectadas colocadas en el centro de la cámara bajo el control del software. Cambie a la iluminación del césped en el modo en vivo.Para establecer la configuración del césped, verifique la posición del haz que emerge del objetivo en la cubierta de muestra. Cuando el haz se coloca en el centro de la lente del objetivo, se ve un punto en el centro de la cubierta de la muestra de césped y la célula se visualiza en modo de epifluorescencia. Para alcanzar el ángulo crítico, mueva el punto enfocado en la dirección Y usando el tornillo de ajuste de ángulo en el control deslizante de césped.Cuando el haz converge en el plano de la muestra en un ángulo mayor que el ángulo crítico, la mancha desaparece y se hace evidente una línea recta y delgada en el centro de la cubierta de la muestra. Para afinar el ángulo del césped, use una muestra de celda. Vea la imagen de fluorescencia en el video.En esta etapa, todavía es visible una imagen similar a la epifluorescencia. Mueva suavemente el tornillo hasta lograr la condición del césped. Aquí solo se enfoca un plano óptico de la célula, lo que da como resultado una imagen plana con alto contraste.Para realizar imágenes de muestra, configure el experimento de lapso de tiempo de un solo canal, los tiempos de exposición apropiados están entre 40 y 80 milisegundos. Adquiera imágenes a una frecuencia de muestreo de uno o dos hercios. Agregue 500 microlitros de solución de timbre Krebs y registre las células en modo de microscopía de césped.Guarde las imágenes secuenciales de tiempo de la condición de reposo. Concéntrese en la misma celda y registre en las mismas condiciones de reposo. Después de cinco fotogramas, agregue cinco microlitros de solución de cloruro de potasio Krebs ringer y mantenga el cloruro de potasio en la cámara.Ahorre tiempo. Imágenes secuenciales de la condición estimulada. Utilice un macro de intensidad de fluorescencia de secuencia para la intensidad de fluorescencia, la cuantificación en una región de interés o el retorno de la inversión de la imagen a lo largo de la película.Para ello, primero, abra las imágenes secuenciales de tiempo. Vaya al menú de macros y seleccione la intensidad de fluorescencia de la secuencia. En la ventana de análisis, navegue.Para seleccionar el ROI, elija una de las herramientas de selección en el menú. Para crear el ROI, coloque tres ROI en regiones de la membrana celular sin manchas. Para la ósmosis inversa de fondo, empleo este ROI de fondo para evaluar el blanqueo de fotos y establecer el umbral para el análisis de eventos de fusión.Con los ROI seleccionados, haga clic en Aceptar. Calcule automáticamente la intensidad de fluorescencia promedio de cada ROI en el transcurso de la película, exporte los datos a un programa de hoja de cálculo para su posterior análisis. Para evaluar el fotoblanqueo, abra la intensidad de fluorescencia aumentada.Los ROI de fondo normalizan los valores de intensidad de fluorescencia en cada fotograma al valor de intensidad inicial y promedian los valores. Resalte los datos promedio y cree un gráfico de líneas utilizando las opciones del menú del gráfico. En el menú de análisis de datos, seleccione línea de tendencia para abrir el cuadro de diálogo de análisis de trazado.Establezca el tipo de regresión en regresión exponencial. A continuación, seleccione la ecuación de visualización en el gráfico. En la ventana del gráfico, aparece la ecuación exponencial y los valores de los parámetros se asignan automáticamente.Después de aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad como se describe en el protocolo de texto, establezca el umbral abriendo un fondo normalizado y corregido. A continuación, el ROI calcula la señal fluorescente media y su desviación estándar. El valor promedio más tres unidades de desviación estándar representa el umbral.Para seleccionar los eventos de fusión. Primero, abra las imágenes secuenciales de tiempo con un software de análisis de imágenes, aplique un filtro gaussiano a la secuencia de imágenes activa. Analice imágenes utilizando la herramienta contar objetos o una macro, que permite seleccionar un objeto cuyos píxeles tienen una intensidad de fluorescencia media dentro de un rango definido.Establezca el rango de intensidad manualmente utilizando la función de umbral, aplique una macro de filtros de objetos para seleccionar solo los objetos que cumplan con criterios específicos. Primero aplique la opción de rangos para el aspecto. Aspecto informa de la relación entre el eje mayor y el eje menor de la elipse equivalente al objeto.Los valores adecuados para el aspecto son un mínimo de uno y un máximo de 2,3. A continuación, aplique rangos para el criterio de diámetro en píxeles que informa de la longitud media de los diámetros medidos a intervalos de dos grados, uniendo dos puntos delineados y pasando por el OID del objeto. A continuación, seleccione Mostrar objetos.Los objetos seleccionados aparecerán superpuestos a la pista de la imagen de microscopía de césped en el análisis, solo aquellos puntos que muestren un breve aumento transitorio en la intensidad de la fluorescencia, seguido inmediatamente por una marcada pérdida de señal. Emplee manualmente la selección circular para crear un ROI de aproximadamente un diámetro de punto radialmente alrededor de la vesícula seleccionada. Con el ROI seleccionado, calcule la intensidad de fluorescencia promedio de cada ROI en el transcurso de la película.Exporte el curso temporal de los cambios de fluorescencia medidos en cada ROI experimental a una hoja de cálculo para normalizar el valor de intensidad en cada fotograma a la intensidad de fluorescencia inicial. Después de aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada fotograma, como antes, aplique funciones lógicas utilizando hojas de cálculo o paquetes matemáticos para calcular el número total de eventos de fusión, el momento en que se produce cada fusión y la amplitud del pico fluorescente. Supongamos el aumento de la intensidad de fluorescencia que excede el umbral como fusión de vesículas a la membrana plasmática y el pico resultante como un evento de fusión.Calcule el ancho del pico como la diferencia entre el último y el primer valor X de cada pico. A continuación, multiplique este valor por uno sobre la frecuencia de muestreo. Considere este valor como el tiempo de fusión de la vesícula y adhesión en la membrana plasmática antes de la vesícula, la reacidificación y el reciclaje.A continuación, calcule el área total de la celda debajo de la curva como una suma de los valores sobre el umbral. Considere este valor como un cambio fluorescente neto Durante el tiempo de registro debido a la actividad sináptica espontánea o evocada, calcule la altura del pico como la diferencia entre el valor y máximo de cada pico y el umbral, y considere este valor como indicativo del tipo de fusión. En el análisis de células completas, el número total y la frecuencia de los eventos de fusión que ocurren en la célula se analizan en condiciones de reposo.Las vesículas ocasionalmente se acercan a la membrana plasmática y se fusionan con ella en el gráfico de intensidad fluorescente. Esto se refleja por un cambio brusco de la intensidad fluorescente sobre el umbral después de la aplicación del estímulo secretario. De repente aparecen diferentes picos de intensidad de fluorescencia variable en el gráfico del perfil de intensidad de fluorescencia.Nótese el aumento en el número de picos y la altura después de la estimulación con potasio. En el análisis de pico único, se analiza cada evento de fusión. Se miden dos parámetros.La anchura del pico, que corresponde al tiempo de vesícula, adhesión y fusión a la membrana plasmática, así como la altura del pico, que refleja el mecanismo de fusión del pico. Bajo la despolarización de potasio, la altura y el ancho del pico aumentan, reflejando un cambio en la fusión de la vesícula motora a la membrana plasmática. Al asistir a este procedimiento, es importante recordar que esta técnica puede permitir solo la visualización del evento que tiene lugar en la membrana plasmática o inmediatamente después de este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos, como una microscopía rica, para responder preguntas adicionales como el destino de las bicicletas internalizadas, las proteínas dentro de las células después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores que trabajan en el campo de la biología y la fisiología celular estudien los eventos dinámicos que ocurren en la membrana personal, como la exocitosis vesical, la edición de la matriz celular y los flujos iónicos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo lograr una configuración de nivel cuatro, registrar dinámicas verticales y analizar datos.

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Investigación

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Neurociencia

Mediante el etiquetado de los dominios extracelulares de los receptores de membrana con pHluorin superecliptic, y por imágenes de estos receptores de fusión en las neuronas de ratón en cultivo, se puede visualizar directamente los eventos de inserción individuales vesiculares de los receptores a la membrana plasmática. Esta técnica será fundamental para elucidar los mecanismos moleculares que regulan la inserción del receptor en la membrana plasmática.

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

Este video demuestra cómo las vesículas neuronales se marcan con proteínas fluorescentes específicas para visualizar su movimiento. Primero, un plásmido que codifica para una proteína fluorescente se incuba con un agente de transfección y luego se introduce en un cultivo de neuronas. Posteriormente, se adquieren imágenes de las neuronas y se analizan para rastrear el movimiento de las vesículas.

Visualización de las motilidades de las vesículas en las neuronas mediante imágenes de fluorescencia

Fuente: Daniele, F., et. al TIRFM y sondas GFP sensibles al pH para evaluar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma SH-SY5Y: imágenes celulares y análisis de datos. J. vis. exp. (2015). Este video muestra la obtención de imágenes de células de neuroblastoma humano utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas con fluoróforos. Las células se enfocan primero en modo de...

Obtención de imágenes celulares mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total

Fuente: Lacin, E., et al. Construcción de reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células (CNiFER) para la detección óptica de neurotransmisores in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra una técnica para obtener imágenes de la liberación de neurotransmisores in vivo utilizando reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células (CNiFER), células reporteras especializadas preinyectadas en la corteza del ratón. Colocado bajo un...

Obtención de imágenes de liberación de neurotransmisores mediante reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

La unión neuromuscular de las larvas de pez cebra es un modelo atractivo para el estudio de la fisiología sináptica. Es susceptible de muchas técnicas experimentales, como la electrofisiología y las imágenes ópticas. Aquí, describimos un protocolo para la transmisión sináptica de imágenes utilizando una sonda basada en pHluorin bajo un microscopio de epifluorescencia vertical.

Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

Aprende a evaluar la dinámica de vesículas de neurotransmisor en células SH-SY5Y mediante microscopía TIRFM y sondas GFP sensibles al pH. Este método permite analizar la fusión y reciclaje vesicular con alta resolución.

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos (Video) | JoVE Journal

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

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