TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

El objetivo general de este procedimiento es investigar la dinámica de las vesículas de los neurotransmisores en las células de neuroblastoma utilizando sondas sensibles al pH y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total o tierra de césped. Esto se logra primero colocando las células en cubreobjetos de vidrio y seccionándolas con sondas fluorescentes sensibles al pH codificadas genéticamente para la fusión y el reciclaje de vesículas, que se dirigen selectivamente a las vesículas sinápticas. La expresión de la proteína se espera dentro de las 24 a 48 horas.

El segundo paso es registrar la dinámica de las vesículas mediante microscopía de reflexión interna total. Este paso es particularmente crítico para el éxito del experimento y se proporciona una descripción paso a paso sobre cómo lograr la configuración del césped. Próximo. Una vez que se alcanza la configuración correcta del césped, las imágenes secuenciales pueden ser registradas automáticamente por el software en condiciones basales o estimuladas.

El paso final es procesar las imágenes y extraer los datos de los videos utilizando software comercial o algoritmos caseros. En última instancia, el uso de la microscopía de césped para registrar los cambios en la señal fluorescente derivada de la fusión de vesículas a la membrana plasmática. Es posible obtener información sobre la frecuencia de los eventos de fusión y el modo de fusión de las vesículas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como por ejemplo, la electromicroscopía y la electrofisiología, es que proporciona la solución especial y temporal necesaria para detectar la dinámica de las vesículas. De hecho, las imágenes altamente contrastadas obtenidas por esta técnica permiten detectar señales de vesículas individuales. El análisis de adquisición de imágenes base baratas proporciona la solución temporal necesaria para detectar la dinámica.

Este método puede ayudar a responder a una pregunta clave en el campo de la ciencia nerviosa, como la comprensión del papel de una proteína sináptica particular en la dinámica de la bicicleta, o el mecanismo de acción de los fármacos que actúan sobre las transmisiones sinápticas. Generalmente, las personas nuevas en este tema, luchamos con ese análisis porque los procedimientos completamente automáticos para seguir la vesícula y registrar la fluctuación de la señal PROE no siempre están disponibles. La idea de este método fue cuando decidimos investigar el impacto de la proteína mutante o sináptica patógena en la liberación de vesículas transmisoras de Nevo.

Los métodos existentes no eran lo suficientemente exhaustivos, por lo que decidimos montar esta técnica en la línea celular de neuroblastoma SH SY five one para llegar a la solución adecuada. La demostración visual de este método es fundamental, ya que algunos pasos clave, como la forma de lograr la configuración de nivel cuatro y cómo extraer los datos cuantitativos de los videos, son fundamentales para explicar usando Word, mientras que puede ser más comprensible y persuasivo. Si se visualiza.

Para realizar imágenes del césped, configure un microscopio invertido motorizado, una fuente láser y el control deslizante del césped como se describe en el protocolo de texto. Para lograr la iluminación del césped. Retire la cubierta de vidrio con células transfectadas e insértela en la cámara de imagen adecuada.

Monta la cámara y añade 500 microlitros de solución de timbre Krebs en el centro del vaso. Luego agregue aceite sobre el objetivo. Coloque la cámara de imágenes en la platina del microscopio y coloque el objetivo debajo de la cubierta de vidrio.

Coloque la cubierta de seguridad sobre la muestra en modo de epifluorescencia. Concéntrese en el cubreobjetos y elija las células transfectadas colocadas en el centro de la cámara bajo el control del software. Cambie a la iluminación del césped en el modo en vivo.

Para establecer la configuración del césped, verifique la posición del haz que emerge del objetivo en la cubierta de muestra. Cuando el haz se coloca en el centro de la lente del objetivo, se ve un punto en el centro de la cubierta de la muestra de césped y la célula se visualiza en modo de epifluorescencia. Para alcanzar el ángulo crítico, mueva el punto enfocado en la dirección Y usando el tornillo de ajuste de ángulo en el control deslizante de césped.

Cuando el haz converge en el plano de la muestra en un ángulo mayor que el ángulo crítico, la mancha desaparece y se hace evidente una línea recta y delgada en el centro de la cubierta de la muestra. Para afinar el ángulo del césped, use una muestra de celda. Vea la imagen de fluorescencia en el video.

En esta etapa, todavía es visible una imagen similar a la epifluorescencia. Mueva suavemente el tornillo hasta lograr la condición del césped. Aquí solo se enfoca un plano óptico de la célula, lo que da como resultado una imagen plana con alto contraste.

Para realizar imágenes de muestra, configure el experimento de lapso de tiempo de un solo canal, los tiempos de exposición apropiados están entre 40 y 80 milisegundos. Adquiera imágenes a una frecuencia de muestreo de uno o dos hercios. Agregue 500 microlitros de solución de timbre Krebs y registre las células en modo de microscopía de césped.

Guarde las imágenes secuenciales de tiempo de la condición de reposo. Concéntrese en la misma celda y registre en las mismas condiciones de reposo. Después de cinco fotogramas, agregue cinco microlitros de solución de cloruro de potasio Krebs ringer y mantenga el cloruro de potasio en la cámara.

Ahorre tiempo. Imágenes secuenciales de la condición estimulada. Utilice un macro de intensidad de fluorescencia de secuencia para la intensidad de fluorescencia, la cuantificación en una región de interés o el retorno de la inversión de la imagen a lo largo de la película.

Para ello, primero, abra las imágenes secuenciales de tiempo. Vaya al menú de macros y seleccione la intensidad de fluorescencia de la secuencia. En la ventana de análisis, navegue.

Para seleccionar el ROI, elija una de las herramientas de selección en el menú. Para crear el ROI, coloque tres ROI en regiones de la membrana celular sin manchas. Para la ósmosis inversa de fondo, empleo este ROI de fondo para evaluar el blanqueo de fotos y establecer el umbral para el análisis de eventos de fusión.

Con los ROI seleccionados, haga clic en Aceptar. Calcule automáticamente la intensidad de fluorescencia promedio de cada ROI en el transcurso de la película, exporte los datos a un programa de hoja de cálculo para su posterior análisis. Para evaluar el fotoblanqueo, abra la intensidad de fluorescencia aumentada.

Los ROI de fondo normalizan los valores de intensidad de fluorescencia en cada fotograma al valor de intensidad inicial y promedian los valores. Resalte los datos promedio y cree un gráfico de líneas utilizando las opciones del menú del gráfico. En el menú de análisis de datos, seleccione línea de tendencia para abrir el cuadro de diálogo de análisis de trazado.

Establezca el tipo de regresión en regresión exponencial. A continuación, seleccione la ecuación de visualización en el gráfico. En la ventana del gráfico, aparece la ecuación exponencial y los valores de los parámetros se asignan automáticamente.

Después de aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad como se describe en el protocolo de texto, establezca el umbral abriendo un fondo normalizado y corregido. A continuación, el ROI calcula la señal fluorescente media y su desviación estándar. El valor promedio más tres unidades de desviación estándar representa el umbral.

Para seleccionar los eventos de fusión. Primero, abra las imágenes secuenciales de tiempo con un software de análisis de imágenes, aplique un filtro gaussiano a la secuencia de imágenes activa. Analice imágenes utilizando la herramienta contar objetos o una macro, que permite seleccionar un objeto cuyos píxeles tienen una intensidad de fluorescencia media dentro de un rango definido.

Establezca el rango de intensidad manualmente utilizando la función de umbral, aplique una macro de filtros de objetos para seleccionar solo los objetos que cumplan con criterios específicos. Primero aplique la opción de rangos para el aspecto. Aspecto informa de la relación entre el eje mayor y el eje menor de la elipse equivalente al objeto.

Los valores adecuados para el aspecto son un mínimo de uno y un máximo de 2,3. A continuación, aplique rangos para el criterio de diámetro en píxeles que informa de la longitud media de los diámetros medidos a intervalos de dos grados, uniendo dos puntos delineados y pasando por el OID del objeto. A continuación, seleccione Mostrar objetos.

Los objetos seleccionados aparecerán superpuestos a la pista de la imagen de microscopía de césped en el análisis, solo aquellos puntos que muestren un breve aumento transitorio en la intensidad de la fluorescencia, seguido inmediatamente por una marcada pérdida de señal. Emplee manualmente la selección circular para crear un ROI de aproximadamente un diámetro de punto radialmente alrededor de la vesícula seleccionada. Con el ROI seleccionado, calcule la intensidad de fluorescencia promedio de cada ROI en el transcurso de la película.

Exporte el curso temporal de los cambios de fluorescencia medidos en cada ROI experimental a una hoja de cálculo para normalizar el valor de intensidad en cada fotograma a la intensidad de fluorescencia inicial. Después de aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada fotograma, como antes, aplique funciones lógicas utilizando hojas de cálculo o paquetes matemáticos para calcular el número total de eventos de fusión, el momento en que se produce cada fusión y la amplitud del pico fluorescente. Supongamos el aumento de la intensidad de fluorescencia que excede el umbral como fusión de vesículas a la membrana plasmática y el pico resultante como un evento de fusión.

Calcule el ancho del pico como la diferencia entre el último y el primer valor X de cada pico. A continuación, multiplique este valor por uno sobre la frecuencia de muestreo. Considere este valor como el tiempo de fusión de la vesícula y adhesión en la membrana plasmática antes de la vesícula, la reacidificación y el reciclaje.

A continuación, calcule el área total de la celda debajo de la curva como una suma de los valores sobre el umbral. Considere este valor como un cambio fluorescente neto Durante el tiempo de registro debido a la actividad sináptica espontánea o evocada, calcule la altura del pico como la diferencia entre el valor y máximo de cada pico y el umbral, y considere este valor como indicativo del tipo de fusión. En el análisis de células completas, el número total y la frecuencia de los eventos de fusión que ocurren en la célula se analizan en condiciones de reposo.

Las vesículas ocasionalmente se acercan a la membrana plasmática y se fusionan con ella en el gráfico de intensidad fluorescente. Esto se refleja por un cambio brusco de la intensidad fluorescente sobre el umbral después de la aplicación del estímulo secretario. De repente aparecen diferentes picos de intensidad de fluorescencia variable en el gráfico del perfil de intensidad de fluorescencia.

Nótese el aumento en el número de picos y la altura después de la estimulación con potasio. En el análisis de pico único, se analiza cada evento de fusión. Se miden dos parámetros.

La anchura del pico, que corresponde al tiempo de vesícula, adhesión y fusión a la membrana plasmática, así como la altura del pico, que refleja el mecanismo de fusión del pico. Bajo la despolarización de potasio, la altura y el ancho del pico aumentan, reflejando un cambio en la fusión de la vesícula motora a la membrana plasmática. Al asistir a este procedimiento, es importante recordar que esta técnica puede permitir solo la visualización del evento que tiene lugar en la membrana plasmática o inmediatamente después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como una microscopía rica, para responder preguntas adicionales como el destino de las bicicletas internalizadas, las proteínas dentro de las células después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores que trabajan en el campo de la biología y la fisiología celular estudien los eventos dinámicos que ocurren en la membrana personal, como la exocitosis vesical, la edición de la matriz celular y los flujos iónicos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo lograr una configuración de nivel cuatro, registrar dinámicas verticales y analizar datos.