Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

El objetivo general de este procedimiento es construir una vía de inyección asequible para microinyectar neurotransmisores en el colículo superior de la rata mientras se monitorea la actividad neuronal de unidades múltiples. Esto se logra creando primero una pipeta de vidrio utilizando un capilar de vidrio y un extractor de micropipetas vertical. El segundo paso es insertar un alambre plateado en el capilar con una sección de alambre que sobresale del extremo no cónico.

A continuación, se utiliza pegamento para crear un sello hermético entre la pipeta de vidrio y una aguja hipodérmica. Los pasos finales son llenar la pipeta con una solución de GABA de color azul cielo Chicago conectada a una microjeringa llena de aceite mineral y fijada a un microinyector. En última instancia, esta construcción de una inyección con piezas accesibles y asequibles se puede utilizar para inactivar estructuras cerebrales profundas mientras se registra la actividad neuronal del área inactivada antes, durante y después de la inyección de un medicamento.

Hay algunas ventajas de esta técnica sobre otros métodos existentes, como los pulsos de presión basados en gas y los sistemas de inyección fótica. Una es que es un método rentable que permite un control basado en la función sobre la administración del fármaco, lo que limita el daño tisular causado por la sobreinyección. Otra ventaja que ofrece este sistema es una capacidad de grabación combinada, que permite un control eficiente sobre el componente temporal de la desactivación neuronal.

Para preparar las pipetas de inyección de registro, primero extraiga un capilar de siete centímetros con un diámetro exterior de un milímetro para un modelo vertical de policía. Siete unidades de 20 o similar. Ponga el calentador a 18 y el solenoide a uno siguiente, usando guantes rompa manualmente la punta para hacer una apertura y verifique bajo un microscopio que el diámetro interior esté entre 30 y 40 micrómetros.

Mídelo con la regla de los visores. Producirá una impedancia relativamente baja de 0,3 a 0,6 mega ohmios. Luego, desde el extremo no cónico, inserte un alambre de plata en la pipeta de unos siete centímetros de largo y deje uno o dos centímetros colgando de la pipeta.

Doble este exceso de alambre ortogonalmente al capilar. A continuación, tome una aguja hipodérmica de calibre 30 y aplique adhesivo plástico flexible en el eje. A continuación, inserte lentamente la aguja en la pipeta.

En la medida de lo posible. Agregue más adhesivo para crear un sello en la unión entre la pipeta y la aguja. Con la punta de la pipeta hacia arriba, deje secar el conjunto durante unas 12 horas.

Después de anestesiar y colocar a la rata en un marco estereotáxico, aplique ungüento oftálmico para afeitar su cabeza. Después de aplicar un anestésico local y confirmar un plano quirúrgico de anestesia, proceda a incidir el cuero cabelludo a lo largo de la mediana con una hoja de bisturí número 10. Esto expondrá las suturas coronales y sagitales.

Luego, con una espátula quirúrgica, identifique las referencias anatómicas de Lambda y bgma. Ajuste la posición de la cabeza para que estos puntos de referencia estén nivelados en el mismo plano horizontal. Luego cero, un puntero fino y rígido como un tubo de vidrio en el bgma.

A continuación, ajuste la posición del tubo a una ubicación de interés utilizando las coordenadas del bgma. Use el rotulador para dibujar un cuadrado alrededor del área objetivo para la craneotomía. Ahora, con el taladro quirúrgico esterilizado, retire lentamente el hueso a lo largo de las marcas.

Comience usando la menor presión posible y mantenga el taladro en movimiento para evitar el daño tisular inducido por la cabeza debido a la fricción cuando el hueso se ha vuelto delgado, retire con cuidado la sección cuadrada con pinzas. No es necesario retirar el Dora MA, ya que la inyección lo penetrará en el futuro. Mantenga la corteza expuesta irrigada con líquido cefalorraquídeo.

Prepare la inyección llenando primero una jeringa de cinco a 10 microlitros con aceite mineral. A continuación, prepare el fármaco de interés con un tinte en solución salina fisiológica. Aquí se mezcla el 0,5% de azul cielo de Chicago con 300 micromolares de gaba.

Ahora llene la pipeta de inyección cargando primero una jeringa de un mililitro con una solución preparada y, a continuación, utilizando la jeringa para cargar la pipeta. Al retirar la jeringa, mantenga una ligera presión sobre el émbolo, de modo que una aspiradora no elimine la solución de la vía de inyección. Compruebe si hay fugas de líquido en posibles puntos de fuga.

Limpie con un hisopo el exceso de líquido y vuelva a comprobar si hay fugas. Ahora, conecte la jeringa micros con aceite mineral a la carretera de inyección. A continuación, limpie el exceso de solución.

Con gasa. Compruebe la punta de la inyección. Debería ser posible hacer fluir pequeñas gotas de solución a través de él, de lo contrario, está bloqueado o ahora montar de forma segura el inyector en un sistema de microbomba.

A continuación, mueva la posición de la carretera de inyección a las coordenadas objetivo y baje el electrodo hasta el colo superior, que se puede identificar mediante el registro de potenciales evocados visuales. Mientras se baja el electrodo, aplique una pequeña presión positiva aplicando una tasa baja de inyección para evitar obstrucciones. Interrumpa la inyección cuando se alcance la estructura.

Después de insertar la inyección, cubra la corteza expuesta con agar tibio para evitar la desecación. Después de la colocación final del electrodo, espere 30 minutos para permitir la estabilización del tejido que rodea el electrodo. Luego inyecte de 400 a 800 nanolitros de solución a una velocidad de 40 nanolitros por minuto hasta que se active la actividad neuronal en el colo superior, el electrodo debe mostrar una reducción de picos durante la inyección de la solución inhibitoria.

Los potenciales evocados visualmente se obtuvieron en el colo superior. Después de un destello de 300 milisegundos en el ojo contralateral tras la inyección de gaba, la actividad de aumento en respuesta a un estímulo de destello se suprimió durante 45 a 60 minutos. Mientras asiste a este procedimiento, es importante verificar si hay fugas durante la carga y verificar que la solución del medicamento fluya libremente a través de la punta de la inyección.