Name: Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprende a construir una pipeta de vidrio de doble función para microinyectar GABA en el colículo superior de ratas mientras registras actividad neuronal multiunidad simultáneamente. Este método económico permite inactivar estructuras cerebrales profundas con control temporal preciso.

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Apoyado por subvenciones de CIHR (MOP231122) y NSERC (RGPIN-2014-06503). Nos gustaría agradecer a Geneviève Cyr por su ayuda en la preparación de experimentos y la supervisión del trabajo de laboratorio. MAL recibió una beca del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).

NOTA: Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense para la Protección de los Animales y de la junta de revisión de Ética de la Universidad de Montreal. 1. Asamblea de la pipeta de grabación por inyección <ol><li> Tire de un capilar de vidrio de aproximadamente 7 cm de largo (1 mm de diámetro exterior) con un extractor pipeta. </li><li> Romper la punta del capilar y compruebe la abertura con un microscopio óptico. Confirmar que el diámetro interior es de entre 30 micras a 40 micras. </li><li> Insertar un alambre de plata 7 cm de largo en el capilar de vidrio con aproximadamente 1 cm que sobresale del extremo no ahusada de la pipeta de vidrio. </li><li> Doble el exceso de filamento ortogonal al capilar de vidrio. </li><li> Aplicar una gota de adhesivo de plástico flexible en el eje de una aguja hipodérmica 30 G. </li><li> Inserte una aguja hipodérmica 30 G en la pipeta de vidrio de acuerdo con los esquemas presentados en la Figura 1 </strong&gt;. </li><li> Añadir un segundo recubrimiento de pegamento para asegurar un sellado adecuado de la unión entre la pipeta de vidrio y la aguja hipodérmica. </li><li> Deja la pipeta para secar con la punta hacia arriba durante aproximadamente 12 horas para asegurar un curado adecuado de la cola. El resultado final se muestra en la Figura 2. </li></ol> NOTA: Este procedimiento se realiza en experimentos agudos y esterilización de la punta de la pipeta no es necesario. 2. Preparación de los animales <ol><li> Coloque la rata en una caja de la anestesia. </li><li> Inducir la anestesia utilizando 4% isoflurano por 5 a 10 minutos. </li><li> Colocar el animal sobre una mesa estereotáxica con el cojín de calefacción y sonda rectal para mantener una temperatura corporal de 37 ° C. Use un cono de la nariz para mantener la anestesia con isoflurano 2%. Asegure la cabeza de la rata utilizando barras de oído y titular de los dientes. </li><li> Aplicar pomadas o gotas oftálmicas oculares, que incluyen 1% atropina gotas para ayudar en la dilatación de la pupila. Para evitar la sequedad, aplicar lubricante gotas aproximadamente cada 30 min. </li><li> Afeitarse la cabeza y límpielo con un 10% de povidona-yodo. </li><li> Para anestesia local, inyectar 0,5 ml de lidocaína al 2% bajo el cuero cabelludo en 2-3 ubicaciones levantando la piel y la inserción de la punta de la aguja. </li><li> Confirmar nivel adecuado de anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie y la observación de la falta de movimiento. Además, controlar la frecuencia cardíaca para asegurar que está dentro de los valores normales (300 a 400 latidos / min). </li><li> Incisión en el cuero cabelludo en una línea recta a lo largo de la mediana con una cuchilla de bisturí # 10 para exponer tanto las suturas coronal y sagital. </li><li> Revela los puntos Lambda y bregma por empujar a un lado el tejido que cubre el cráneo con una espátula quirúrgica. </li><li> Nivelar el cráneo de modo que las posiciones de bregma y lambda están en el mismo plano. </li><li> Para establecer el punto de referencia, utilice un dispositivo estereotáxico con un tubo de vidrio montada para configurarlo justo encima Bregma. Este será el &quot;cero&quot; para el antero-posterior y medmediciones ial-laterales coordenadas. </li><li> Establecer el lugar de interés moviendo el estereotáxica montaje a las coordenadas necesarias, tenga en cuenta las coordenadas estereotáxicas y dibujar un cuadrado alrededor de la zona objetivo que marca donde se realizará la craneotomía. </li><li> Use un taladro con una broca quirúrgica esterilizada a lo largo del marcado plaza lentamente y sin presión para eliminar lentamente el material óseo. Tenga cuidado de no perforar demasiado tiempo en la misma zona, ya que producirá calor y causar lesiones en la corteza. </li><li> Cuando el hueso que delimita la craneotomía se ha convertido en lo suficientemente delgada, retire con cuidado la sección craneal con pinzas para exponer la corteza. </li><li> Irrigar frecuentes la corteza expuesta con líquido cefalorraquídeo artificial para evitar la desecación de los tejidos. NOTA: la eliminación mater Dura es innecesario en la rata como la punta de la injectrode es lo suficientemente resistente como para penetrar. </li></ol> 3. Llenar y Montaje del Sistema de Inyección <ol><li> Llenar el5-10 l microjeringa por aspiración con aceite mineral. </li><li> Llene la aguja hipodérmica con la pipeta de vidrio fijo con una solución de 0,5% Chicago Sky Azul (CSB) y 300 M-γ aminobutírico (GABA) o una solución de lidocaína al 2% con 0,5% CSB 9. Diluir todas las soluciones con solución salina. <ol><li> En el caso de una sustancia abundante, llenar utilizando una jeringa regular y utilizar las técnicas habituales de precaución para evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> En el caso de las sustancias más caras, utilice aceite mineral para llenar el injectrode y el agente químico puede ser introducido por aspiración. Como la diferencia de densidad entre el aceite mineral y el agua es relativamente alta, esta sustancia es un buen candidato para la inyección de soluciones acuosas. NOTA: Un colorante puede ser añadido a confirmar la separación entre ambos líquidos. </li></ol></li><li> Para llenar la pipeta de inyección, llenar una jeringa de 1 ml con la solución por aspiración y luego inyectar lentamente la soluciónen la pipeta de inyección. </li><li> Prestar especial atención para detectar fugas en las regiones indicadas en la Figura 1 en muestras de secreciones estas áreas limpias y la observación de fugas mediante la inyección aún más la solución lentamente con la jeringa. </li><li> Retire la jeringa de 1 ml. Al hacerlo, asegúrese de mantener una ligera presión sobre el émbolo para que el vacío no elimina la solución de la pipeta de inyección. </li><li> Llene el microjeringa con aceite mineral por aspiración y adjuntarlo firmemente a la pipeta de inyección lleno, a continuación, limpie cuidadosamente cualquier exceso de solución de la injectrode montado con una gasa. </li><li> Verifique que la punta no está bloqueada mediante la inyección de un volumen muy pequeño, lo suficiente para ver una pequeña formación en la punta de la pipeta de vidrio gota. </li><li> Monte el injectrode en el sistema microbomba y asegurarse de que está bien fijada. </li><li> Coloque con cuidado la punta injectrode en las coordenadas de destino y de bajar la punta a la superficie de la corteza. </li><li> Baje lentamente la injectrOda usando el aparato estereotáxico a la estructura objetivo (colículo superior en este caso) utilizando las coordenadas anatómicas apropiadas. </li><li> Cubra la corteza expuesta con agar caliente para evitar la desecación de los tejidos. </li></ol> 4. Inyección y inactivación reversible <ol><li> Ajuste la bomba de microinyección para inyectar 400 a 800 nl a 40 nl / min y pulse Ejecutar para iniciar la inyección. Tenga en cuenta que la tasa pico mostrará reducción durante la inyección. NOTA: En la configuración experimental, la actividad neuronal se recuperó dentro de una hora después del final de la entrega de GABA. Cualquier dispositivo mecánico calibrado se puede utilizar para aplicar presión en la jeringa la microinyección con el fin de llevar a cabo la inyección. </li><li> Después de la adquisición de los datos electrofisiológicos, la eutanasia utilizando un método aprobado por la Comunidad de Ética Animal local. </li></ol>

<ol><li>Martin, J. H., Ghez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inactivation+in+the+analysis+of+the+central+control+of+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).</li>
<li>Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+indirect+pathways+to+visual+response+properties+in+macaque+middle+temporal+area+MT%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT.</a> The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).</li>
<li>Lomber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+and+limitations+of+permanent+or+reversible+deactivation+techniques+in+the+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).</li>
<li>Malpeli, J., Schiller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).</li>
<li>Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryoloop%3A+an+adaptable+reversible+cooling+deactivation+method+for+behavioral+or+electrophysiological+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+deep+brain+structures+with+microinjections+for+delivery+of+drugs%2C+viral+vectors%2C+or+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants.</a> Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).</li>
<li>Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+parameters+of+cortical+inactivation+by+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).</li>
<li>Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+Reorganized+Primary+Somatosensory+%28SI%29+Cortex+after+Local+Inactivation+of+Normal+SI+Cortex+in+Chronic+Spinal+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+%26+Motor+Research%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats.</a> Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).</li>
<li>Malpeli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).</li>
<li>Minville, K., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+frequency+processing+in+posteromedial+lateral+suprasylvian+cortex+does+not+depend+on+the+projections+from+the+striate-recipient+zone+of+the+cat%E2%80%99s+lateral+posterior-pulvinar+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex.</a> Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).</li>
<li>Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+the+binocular+visual+field+in+the+superior+colliculus+of+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat.</a> Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

El protocolo propuesto fue diseñado para resolver los retos derivados de los actuales métodos de inactivación reversible. En concreto, este proyecto destinada a perfeccionar los métodos utilizados para microinyecciones químicas de las sustancias que modulan la actividad neuronal, particularmente en las estructuras profundas del cerebro. Un reto técnico que emerge de este tipo de configuración es la necesidad de ambas sondas a ser colocalized en el mismo espacio restringido in vivo a fin de obtener grabaciones p...

La inactivación de áreas corticales y núcleos subcorticales es importante en el estudio de las relaciones funcionales entre varias estructuras cerebrales 2-4. La literatura reciente ha empleado química de pérdida de función o técnicas criogénicas para estudiar el papel de las estructuras cerebrales 2,5. En lo que se refiere a las microinyecciones farmacológicas, pequeños volúmenes de medicamentos pueden ser administrados en una región del cerebro a una velocidad controlada y reducir al mínimo el daño colateral al tejido circundante 6,7. Esta técnica se puede utilizar para entregar agonistas específicos, agonistas inversos o antagonistas para estudiar el efecto de diferentes dianas farmacológicas sobre la actividad neuronal. Estos efectos también se pueden estudiar mediante la medición de cambios en las respuestas neuronales desde lugares distantes, lo que permite a los investigadores estudiar las relaciones entre las diferentes estructuras corticales y subcorticales. Aquí, nos demuestran el montaje de un dispositivo, el injectrode, capaz de boº grabación de señales electrofisiológicas y entregar pequeñas cantidades de drogas en el lugar de destino. Se demuestra las capacidades de este sistema mediante la inyección de GABA, un inhibidor de la actividad neuronal común, en la rata colículo superior. Esta región es sensible a la estimulación visual, que nos permitió utilizar la actividad multiunit evocado visual para confirmar la localización injectrode. La reversibilidad de la inactivación se evaluó por la recuperación de la actividad neuronal normal tras el final de la inyección GABA. La capacidad de controlar la actividad de varias unidades de la zona de la inyección permite la puesta a punto de las tasas de inyección y los volúmenes necesarios para lograr la respuesta farmacodinámica deseada. Por lo tanto, una ventaja de esta técnica es el potencial de limitar el daño tisular causado por microperfusión, ya que se inyectan los más pequeños volúmenes efectivos. El protocolo propuesto proporciona un método rentable para generar la necessar hardware desechabley para la realización de experimentos donde se desea la administración de fármacos y la grabación de la actividad neuronal local.

<table><tbody><tr><td>Bomba de inyección (UltraMicroPump III)</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr>#UMP3 <tr><td>Consola de inyección (Micro4 Controller)</td><td>WPI</td><td>#SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Hamliton</td><td>(80301) 701LT 10 &micro; L SYR</td><td>Jeringas entre 5 y 10 &mu; l</td></tr><tr><td>Adhesivo plástico flexible</td><td>usado Lepage</td><td>393915</td><td>La forma de gel es más fácil de aplicar al eje del 30&nbsp; G Aguja hipodérmica que forma un sello impermeable cuando está seca.</td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio</td><td>WPI</td><td>#TW100F-4</td><td>Pared fina, 1&nbsp; mm OD, 0,75&nbsp; mm ID con pipetas de filamento utilizadas</td></tr><tr><td>720 Tirador de pipetas de aguja</td><td>Kopf</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de plata</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>782500</td><td>Desnudo 0.010"</td></tr></tbody></table>

grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Aquí se describe un método para la construcción de un solo uso &quot;injectrode&quot; utilizando piezas comercialmente accesibles y asequibles. Un sistema de sondeo fue desarrollado que permite la inyección de un medicamento durante la grabación de señales electrofisiológicas de la población neuronal afectada. Este método proporciona una alternativa sencilla y económica a las soluciones comerciales. Una pipeta de vidrio se modificó mediante la combinación con una aguja hipodérmica y un filamento de plata. El injectrode está unido a la bomba microjeringa comercial para la administración de fármacos. Esto resulta en una técnica que proporciona retroalimentación farmacodinámica en tiempo real a través de señales extracelulares de unidades múltiples originarios desde el sitio de administración de fármacos. Como una prueba de concepto, se registró la actividad neuronal del colículo superior provocada por destellos de luz en ratas, concomitantemente con la entrega de medicamentos a través de la injectrode. La capacidad de grabación injectrode permite la caracterización funcional de la injEl sitio de reflexión favoreciendo un control preciso sobre la localización del suministro del fármaco. La aplicación de este método también se extiende mucho más allá de lo que se ha demostrado aquí, como la elección de la sustancia química cargado en el injectrode es vasto, incluyendo rastreo de marcadores para experimentos anatómicos.

La construcción de la injectrode se ilustra en la Figura 1. Un alambre de plata (C) se alimenta a una pipeta de vidrio (D) con una porción de la alambre doblado y que sobresale hacia fuera de la abertura. Una aguja de 30 G (B) se une y se sella a la abertura de la pipeta de vidrio con pegamento. Después de la pipeta se ha llenado con la sustancia de la inyección, una jeringa micro de vidrio (A) está unido a la aguja. Es importante que haya un buen cierre hermético, donde la jeringa micro conecta con la ...

Aquí, creamos una pipeta de vidrio con doble función: inhibición de estructuras cerebrales profundas mediante microinyecciones de fármacos y monitorización en tiempo real de sus efectos mediante registros electrofisiológicos simultáneos.

Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

El objetivo general de este procedimiento es construir una cánula inyectable asequible para microinyectar neurotransmisores en el colículo superior de la rata mientras se monitorea la actividad neuronal multiunidad. Esto se logra primero creando una pipeta de vidrio utilizando un capilar de vidrio y un micropipeteador vertical. El segundo paso consiste en insertar un alambre de plata en el capilar, dejando una sección del alambre sobresaliendo desde el extremo no afilado.A continuación, se utiliza pegamento para crear un sello hermético entre la pipeta de vidrio y una aguja hipodérmica. Los pasos finales consisten en llenar la pipeta con una solución de GABA teñida de azul Chicago, conectarla a una microjeringa llena de aceite mineral y fijarla a un microinyector. En definitiva, esta construcción de una microinyección con piezas accesibles y asequibles puede utilizarse para inactivar estructuras cerebrales profundas mientras se registra la actividad neuronal de la zona inactivada antes, durante y después de la inyección de un fármaco.Existen algunas ventajas de esta técnica frente a otros métodos existentes, como los pulsos de presión basados en gas y los sistemas de inyección fótica. Una de ellas es que se trata de un método económicamente eficiente que permite un control basado en la función sobre la administración del fármaco, lo que limita el daño tisular causado por la sobrealimentación. Otra ventaja que ofrece este sistema es una capacidad combinada de grabación, que permite un control eficiente sobre el componente temporal de la desactivación neuronal.Para preparar las pipetas de inyección para grabación, primero estire un capilar de siete centímetros con un diámetro externo de un milímetro en un modelo cop vertical 720 o unidad similar. Configure el calentador en 18 y el solenoide en uno. A continuación, usando guantes, rompa manualmente la punta para crear una abertura y verifique bajo un microscopio que el diámetro interno esté entre 30 y 40 micrómetros.Mida esto con la regla del visor. Esto producirá una impedancia relativamente baja de 0,3 a 0,6 megaohmios. Luego, desde el extremo no cónico, inserte un alambre de plata en la pipeta de aproximadamente siete centímetros de longitud, dejando uno o dos centímetros sobresaliendo de la pipeta.Doble este exceso de alambre ortogonalmente respecto al capilar. A continuación, tome una aguja hipodérmica de calibre 30 y aplique adhesivo plástico flexible sobre el vástago. Luego inserte lentamente la aguja en la pipeta.En la medida de lo posible, agregue más adhesivo para crear un sello en la unión entre la pipeta y la aguja. Con la punta de la pipeta hacia arriba, deje que el conjunto se seque durante aproximadamente 12 horas.Después de anestesiar y colocar la rata en un marco estereotáxico, aplique pomada oftálmica y afeite su cabeza completamente. Después de aplicar un anestésico local y confirmar un plano quirúrgico de anestesia, proceda a incisionar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media utilizando una hoja de bisturí número 10. Esto expondrá las suturas coronal y sagital.Luego, utilizando una espátula quirúrgica, identifique las referencias anatómicas Lambda y bgma. Ajuste la posición de la cabeza para que estos puntos de referencia estén alineados en el mismo plano horizontal. A continuación, nivele un puntero fino y rígido, como un tubo de vidrio, sobre el bgma.A continuación, ajuste la posición del tubo a una ubicación de interés utilizando las coordenadas del bgma. Use el rotulador para dibujar un cuadrado alrededor del área objetivo para la craneotomía. Ahora, con el taladro esterilizado quirúrgicamente, retire lentamente el hueso siguiendo las marcas.Comience utilizando la menor presión posible y mantenga el taladro en movimiento para evitar daños tisulares inducidos por calor debido a la fricción cuando el hueso se haya vuelto delgado; retire cuidadosamente la sección cuadrada con pinzas. No es necesario retirar la Dora MA, ya que la inyección la atravesará en los pasos siguientes. Mantenga la corteza expuesta irrigada con líquido cefalorraquídeo.Prepare la inyección llenando primero una jeringa de cinco a 10 microlitros con aceite mineral. A continuación, prepare el fármaco de interés con un colorante en solución salina fisiológica. Aquí, se mezcla azul cielo de Chicago al 0,5 % con gaba a 300 micromolar.Ahora llene la pipeta de inyección cargando primero una jeringa de un mililitro con una solución preparada, y luego use la jeringa para cargar la pipeta. Al retirar la jeringa, mantenga una ligera presión sobre el émbolo, para que un vacío no extraiga la solución del conducto de inyección. Verifique la presencia de fluido que se escape en los posibles puntos de fuga.Elimine cualquier líquido excesivo con un hisopo y verifique nuevamente si hay fugas. A continuación, conecte la microjeringa con aceite mineral al conducto de inyección. Luego, retire con un hisopo cualquier solución sobrante.Con gasa. Verifique la punta de inyección. Debe ser posible hacer pasar pequeñas gotas de solución a través de ella; de lo contrario, está obstruida o ahora monte firmemente el inyector en un sistema de bomba micro. Luego mueva la posición de la vía de inyección a las coordenadas objetivo y baje el electrodo hasta el colículo superior, que puede identificarse mediante el registro de potenciales evocados visuales. Mientras se introduce el electrodo, aplique una pequeña presión positiva mediante una tasa baja de inyección para evitar obstrucciones. Interrumpa la inyección cuando se alcance la estructura.Después de insertar el inyector, cubra la corteza expuesta con agar caliente para evitar la desecación. Después del posicionamiento final del electrodo, espere 30 minutos para permitir la estabilización del tejido que rodea al electrodo. Luego, inyecte de 400 a 800 nanolitros de solución a una velocidad de 40 nanolitros por minuto hasta una activación de la actividad neuronal en el colículo superior; en ese momento, el electrodo debería mostrar una reducción en los picos durante la inyección de la solución inhibitoria.Se obtuvieron potenciales evocados visuales en el colículo superior. Tras un destello de 300 milisegundos en el ojo contralateral tras la inyección de GABA, la actividad de disparos en respuesta a un estímulo luminoso se suprimió durante 45 a 60 minutos. Durante este procedimiento, es importante verificar fugas durante la carga y comprobar que la solución del fármaco fluye libremente a través de la punta de inyección.

simultaneous-electrophysiological-recording-micro-injections

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Hemos desarrollado un método de traducción simultánea de imágenes de resonancia magnética funcional y de registro electrofisiológico en el cerebro de roedores, proporcionando una plataforma para la investigación de la relación entre la actividad neuronal y el nivel de oxigenación de la sangre depende de (BOLD) señal de resonancia magnética.

FMRI simultánea y electrofisiología en el cerebro de roedores

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Este protocolo describe el ensamblaje y el uso de un inyecturo para la administración precisa de fármacos en regiones específicas del cerebro de una rata anestesiada, seguido de la monitorización de la actividad neuronal a través de señales eléctricas registradas.

Microinyección de fármacos con registro electrofisiológico en el cerebro de una rata

Este video muestra el procedimiento detallado para preparar a una rata anestesiada para registros electrofisiológicos de la actividad cerebral desde múltiples sitios. Se disecciona el cuero cabelludo para acceder al cráneo y se perforan agujeros en lugares precisos para instalar y asegurar los electrodos. A continuación, se insertan electrodos de microhilo de tungsteno en la ubicación objetivo para registrar los datos.

Registros electrofisiológicos in vivo de actividades cerebrales de múltiples sitios en ratas

El video muestra la grabación electrofisiológica simultánea de múltiples regiones del cerebro en una rata utilizando una matriz de micro-unidades integradoras. Los electrodos de registro se colocan en el bulbo olfatorio, los electrodos de referencia en la corteza frontal y los electrodos de matriz de microaccionamiento en el hipocampo. Se permite que la rata se alimente libremente, y el registro simultáneo de todos los electrodos implantados se registra utilizando la matriz.

Un método de matriz de microunidades para el registro electrofisiológico de múltiples regiones del cerebro

Este video demuestra el procedimiento para el registro simultáneo de electroencefalografía (EEG) colocalizada y potenciales de campo local (LFPs) en una rata anestesiada. El proceso consiste en preparar la rata y colocar electrodos estimulantes en sus almohadillas para bigotes. Se coloca un electrodo de araña de EEG en el cráneo de la rata para mediciones de EEG de superficie. Al mismo tiempo, se inserta un microelectrodo multicanal en una región específica del cerebro a través de un orificio...

Registros electroencefalográficos concurrentes y de potencial de campo local en una rata anestesiada

Fuente: Lai, J., et al. Registro electrofisiológico simultáneo y microinyecciones de agentes inhibidores en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra una técnica basada en microinyección para el registro e inhibición neuronal simultáneos en el colículo superior de rata. El procedimiento implica la focalización estereotáxica, la perforación del cráneo y la inserción de un inyectrode, que administra un neurotransmisor inhibidor mientras registra la actividad neuronal. La...

Inhibición de la actividad neuronal y su detección mediante electrofisiología en una rata

Presentamos métodos para la construcción de electrodos que registren simultáneamente la actividad neuronal extracelular y liberen múltiples sustancias neuroactivas en las proximidades de los sitios de registro en ratones despiertos. Esta técnica permite el análisis detallado de las entradas sinápticas locales putativas a la neurona de interés.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Este protocolo describe un método sencillo para grabación simultánea de co localizada electroencefalografía (EEG) y campo local multi-laminar en una rata anestesiado. Un orificio de trépano en el cráneo para la introducción de un microelectrodo se muestra para producir distorsión insignificante de la señal de EEG.

Grabación concurrente de electroencefalografía Co localizada y potencial de campo Local en roedores

Ilustramos cómo realizar grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme inducida por 4-aminopiridina en rebanadas de cerebro de roedores utilizando microelectrodos. Una cámara de grabación personalizada mantiene la viabilidad del tejido a lo largo de prolongadas sesiones experimentales. Asignación de electrodo en vivo y selección de pares estimulantes son realizados por una interfaz de usuario gráfica personalizada.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Presentamos un sistema de microinyección diseñado para electrofisiología y entrega asistida de sondas experimentales (es decir, nanosensores, microelectrodos), con infusión de fármacos opcional. Los componentes microfluídicos ampliamente disponibles se acoplan a una cánula que contiene la sonda. Se incluye un protocolo paso a paso para la construcción de microincrimógenos, con resultados durante la perfusión de muscimol en corteza macaca.

Sistema de Microinyección para Infusión Combinada de Drogas y Electrofisiología

Aprende a construir una pipeta de vidrio de doble función para microinyectar GABA en el colículo superior de ratas mientras registras actividad neuronal multiunidad simultáneamente. Este método económico permite inactivar estructuras cerebrales profundas con control temporal preciso.

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