Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores
7 de julio de 2015
Aquí, creamos una pipeta de vidrio con doble función: inhibición de estructuras cerebrales profundas mediante microinyecciones de fármacos y monitorización en tiempo real de sus efectos mediante registros electrofisiológicos simultáneos.
El objetivo general de este procedimiento es construir una cánula inyectable asequible para microinyectar neurotransmisores en el colículo superior de la rata mientras se monitorea la actividad neuronal multiunidad. Esto se logra primero creando una pipeta de vidrio utilizando un capilar de vidrio y un micropipeteador vertical. El segundo paso consiste en insertar un alambre de plata en el capilar, dejando una sección del alambre sobresaliendo desde el extremo no afilado.
A continuación, se utiliza pegamento para crear un sello hermético entre la pipeta de vidrio y una aguja hipodérmica. Los pasos finales consisten en llenar la pipeta con una solución de GABA teñida de azul Chicago, conectarla a una microjeringa llena de aceite mineral y fijarla a un microinyector. En definitiva, esta construcción de una microinyección con piezas accesibles y asequibles puede utilizarse para inactivar estructuras cerebrales profundas mientras se registra la actividad neuronal de la zona inactivada antes, durante y después de la inyección de un fármaco.
Existen algunas ventajas de esta técnica frente a otros métodos existentes, como los pulsos de presión basados en gas y los sistemas de inyección fótica. Una de ellas es que se trata de un método económicamente eficiente que permite un control basado en la función sobre la administración del fármaco, lo que limita el daño tisular causado por la sobrealimentación. Otra ventaja que ofrece este sistema es una capacidad combinada de grabación, que permite un control eficiente sobre el componente temporal de la desactivación neuronal.
Para preparar las pipetas de inyección para grabación, primero estire un capilar de siete centímetros con un diámetro externo de un milímetro en un modelo cop vertical 720 o unidad similar. Configure el calentador en 18 y el solenoide en uno. A continuación, usando guantes, rompa manualmente la punta para crear una abertura y verifique bajo un microscopio que el diámetro interno esté entre 30 y 40 micrómetros.
Mida esto con la regla del visor. Esto producirá una impedancia relativamente baja de 0,3 a 0,6 megaohmios. Luego, desde el extremo no cónico, inserte un alambre de plata en la pipeta de aproximadamente siete centímetros de longitud, dejando uno o dos centímetros sobresaliendo de la pipeta.
Doble este exceso de alambre ortogonalmente respecto al capilar. A continuación, tome una aguja hipodérmica de calibre 30 y aplique adhesivo plástico flexible sobre el vástago. Luego inserte lentamente la aguja en la pipeta.
En la medida de lo posible, agregue más adhesivo para crear un sello en la unión entre la pipeta y la aguja. Con la punta de la pipeta hacia arriba, deje que el conjunto se seque durante aproximadamente 12 horas.
Después de anestesiar y colocar la rata en un marco estereotáxico, aplique pomada oftálmica y afeite su cabeza completamente. Después de aplicar un anestésico local y confirmar un plano quirúrgico de anestesia, proceda a incisionar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media utilizando una hoja de bisturí número 10. Esto expondrá las suturas coronal y sagital.
Luego, utilizando una espátula quirúrgica, identifique las referencias anatómicas Lambda y bgma. Ajuste la posición de la cabeza para que estos puntos de referencia estén alineados en el mismo plano horizontal. A continuación, nivele un puntero fino y rígido, como un tubo de vidrio, sobre el bgma.
A continuación, ajuste la posición del tubo a una ubicación de interés utilizando las coordenadas del bgma. Use el rotulador para dibujar un cuadrado alrededor del área objetivo para la craneotomía. Ahora, con el taladro esterilizado quirúrgicamente, retire lentamente el hueso siguiendo las marcas.
Comience utilizando la menor presión posible y mantenga el taladro en movimiento para evitar daños tisulares inducidos por calor debido a la fricción cuando el hueso se haya vuelto delgado; retire cuidadosamente la sección cuadrada con pinzas. No es necesario retirar la Dora MA, ya que la inyección la atravesará en los pasos siguientes. Mantenga la corteza expuesta irrigada con líquido cefalorraquídeo.
Prepare la inyección llenando primero una jeringa de cinco a 10 microlitros con aceite mineral. A continuación, prepare el fármaco de interés con un colorante en solución salina fisiológica. Aquí, se mezcla azul cielo de Chicago al 0,5 % con gaba a 300 micromolar.
Ahora llene la pipeta de inyección cargando primero una jeringa de un mililitro con una solución preparada, y luego use la jeringa para cargar la pipeta. Al retirar la jeringa, mantenga una ligera presión sobre el émbolo, para que un vacío no extraiga la solución del conducto de inyección. Verifique la presencia de fluido que se escape en los posibles puntos de fuga.
Elimine cualquier líquido excesivo con un hisopo y verifique nuevamente si hay fugas. A continuación, conecte la microjeringa con aceite mineral al conducto de inyección. Luego, retire con un hisopo cualquier solución sobrante.
Con gasa. Verifique la punta de inyección. Debe ser posible hacer pasar pequeñas gotas de solución a través de ella; de lo contrario, está obstruida o ahora monte firmemente el inyector en un sistema de bomba micro.
Luego mueva la posición de la vía de inyección a las coordenadas objetivo y baje el electrodo hasta el colículo superior, que puede identificarse mediante el registro de potenciales evocados visuales. Mientras se introduce el electrodo, aplique una pequeña presión positiva mediante una tasa baja de inyección para evitar obstrucciones. Interrumpa la inyección cuando se alcance la estructura.
Después de insertar el inyector, cubra la corteza expuesta con agar caliente para evitar la desecación. Después del posicionamiento final del electrodo, espere 30 minutos para permitir la estabilización del tejido que rodea al electrodo. Luego, inyecte de 400 a 800 nanolitros de solución a una velocidad de 40 nanolitros por minuto hasta una activación de la actividad neuronal en el colículo superior; en ese momento, el electrodo debería mostrar una reducción en los picos durante la inyección de la solución inhibitoria.
Se obtuvieron potenciales evocados visuales en el colículo superior. Tras un destello de 300 milisegundos en el ojo contralateral tras la inyección de GABA, la actividad de disparos en respuesta a un estímulo luminoso se suprimió durante 45 a 60 minutos. Durante este procedimiento, es importante verificar fugas durante la carga y comprobar que la solución del fármaco fluye libremente a través de la punta de inyección.
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Descripción general
Este artículo describe la construcción de una pipeta de vidrio diseñada con fines duales: administrar fármacos para inhibir estructuras cerebrales profundas y monitorear la actividad neuronal mediante grabaciones electrofisiológicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Neurofarmacología
Antecedentes
- Comprender las estructuras cerebrales profundas es fundamental para la investigación en neurociencia.
- Las microinyecciones permiten la administración dirigida de fármacos.
- La monitorización simultánea de la actividad neuronal mejora la precisión de los datos.
- Herramientas asequibles pueden facilitar aplicaciones de investigación más amplias.
Objetivo del estudio
- Crear un método rentable para la microinyección de neurotransmisores.
- Monitorear la actividad neuronal multiunidad durante la administración de fármacos.
- Mejorar el acceso a las técnicas experimentales en neurociencia.
Métodos Utilizados
- Construcción de una pipeta de vidrio utilizando un capilar de vidrio.
- Inserción de un alambre de plata para la grabación eléctrica.
- Hermetización de la pipeta a una aguja hipodérmica con pegamento.
- Llenado de la pipeta con una solución de GABA para microinyección.
Resultados principales
- La pipeta construida entregó eficazmente fármacos al colículo superior de la rata.
- Se obtuvieron con éxito grabaciones simultáneas de la actividad neuronal.
- El método demostró fiabilidad para inactivar estructuras cerebrales específicas.
- Los resultados indicaron un potencial para aplicaciones más amplias en la investigación neurocientífica.
Conclusiones
- La pipeta de función dual es una herramienta valiosa para estudios de neurociencia.
- Permite tanto la administración de fármacos como el monitoreo en tiempo real de la actividad neuronal.
- Este enfoque puede mejorar los resultados experimentales en neurofarmacología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la validación funcional en tiempo real de los efectos de fármacos sobre circuitos neuronales, apoyando la reducción de riesgos del blanco en la fase inicial del descubrimiento en neurofarmacología. Al combinar microinyección con registro electrofisiológico, proporciona confianza mecanicista en la selección de compuestos inhibidores. El enfoque ofrece una plataforma de bajo costo y adaptable para investigar farmacodinámicas específicas de regiones cerebrales antes de la optimización del fármaco líder.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de dianas terapéuticas mediante la administración localizada de fármacos y la monitorización simultánea de la actividad neuronal.
- Valor operativo: Apoya la validación basada en hipótesis de la participación de vías neuronales en modelos de enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas electrofisiológicas cuantitativas y en tiempo real como biomarcadores funcionales de la interacción con fármacos.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante parámetros reproductibles de microinyección y registro.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona hallazgos in vitro con la función de circuitos intactos al validar los efectos de fármacos en sistemas neuronales relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Apoya decisiones de avance o detención al vincular la inhibición del blanco con cambios medibles en la actividad de la red neuronal.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, donde debe establecerse la interacción con el blanco y su consecuencia funcional antes de avanzar con el compuesto.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al confirmar que la modulación del objetivo produce los resultados electrofisiológicos esperados.
- Tamizaje: Permite el tamizaje primario de agentes inhibidores utilizando el silenciamiento neuronal como lectura funcional.
- Análisis: Proporciona métricas de supresión de descargas y mediciones del tiempo de latencia del efecto para la comparación de compuestos.
- Investigación Translacional: Se alinea con la validación preclínica al demostrar efectos mediados por el objetivo in vivo.
- Reutilización Empresarial: El diseño del inyectrodo es adaptable a distintas regiones cerebrales y compuestos químicos, lo que favorece su amplia reutilización en programas de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al vincular la intervención farmacológica con la respuesta funcional neural.
- Valor operativo: Reduce la dependencia de sistemas separados de inyección y registro, mejorando la eficiencia del flujo de trabajo y la sincronización de los datos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al minimizar los falsos positivos mediante la confirmación funcional del blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en respuestas electrofisiológicas dependientes de la dosis.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, electrofisiología y localización estereotáxica.
- Depende del acceso a microinyectores, amplificadores y sistemas de adquisición de señales capaces de registro multiunidad.
- Necesita la estandarización de volúmenes de inyección, tasas y períodos de estabilización posteriores a la inyección en todos los estudios.
- La adaptación a diferentes regiones cerebrales puede requerir la recalibración de coordenadas y posicionamiento de electrodos.
- Las limitaciones potenciales incluyen daño tisular por inserciones repetidas y variabilidad en la integridad del sello que afecta la precisión en la administración del fármaco.
