Name: Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a reconstituir el canal iónico KvAP en vesículas unilamelares gigantes mediante deshidratación-rehidratación para estudios de electrofisiología con técnica de patch clamp.

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Agradecemos a Susanne Fenz por discutir la posibilidad de reconstituir proteínas mediante la hinchazón de agarosa, a Feng Ching Tsai por las mediciones actuales, y a los miembros actuales y anteriores del grupo de Bassereau por su apoyo y asistencia. El proyecto fue financiado por la Agence Nationale de la Recherche (subvención BLAN-0057-01), por la Comisión Europea (NoE SoftComp), por la Université Pierre et Marie Curie (subvención de la FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. ha contado con el apoyo de una beca internacional de doctorado del Institut Curie, S.A., de la Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T., de una beca Marie Curie Incoming International Fellowship de la Comisión Europea y de una beca de la Université Pierre et Marie Curie. Los gastos de publicación fueron cubiertos por el Labex 'CelTisPhyBio' (ANR-11-LABX0038).

1. Preparación de la solución <ol><li> Preparar 5 ml de búfer SUV &#39;que contiene 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) o TRIS (pH 7,5), y la trehalosa 2 mM. Filtrar el tampón con un filtro de jeringa de 0,2 micras y se dividen en alícuotas de 1 ml que se pueden almacenar a -20 ° C. NOTA: Los detalles adicionales de los reactivos e instrumentos se dan en la lista de materiales. </li><li> Preparar 40 ml de &#39;Crecimiento Buffer&#39; GUV que llenará el GUV interior durante la rehidratación película. Para un crecimiento &#39;baja en sal &quot;, se combinan 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) o 1 mM TRIS (pH 7,5), y sacarosa ~ 400 mM. Para un crecimiento &#39;salina fisiológica&#39;, combinar mM KCl 100, 5 mM HEPES (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), y ~ 200 mM de sacarosa. </li><li> Preparar 40 ml de &#39;Observación Buffer&#39; para la solución externa en la cámara experimental mediante la combinación de KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), y ~ 200 mM de glucosa. NOTA: Estos amortiguadores son sólo examples. Véase la discusión para adaptar los tampones para otros experimentos. </li><li> Mida las osmolaridades de los buffers de crecimiento y de observación con un osmómetro. Añadir gránulos de sacarosa o glucosa para que coincida con ellos dentro del 1% de manera que GUVs no lisar o contraer cuando se transfieren desde la cámara de crecimiento a la cámara de observación. NOTA: En este rango de concentración, la adición de 1 mM de sacarosa (13,7 mg por cada 40 ml) o glucosa (7,2 mg por 40 ml) aumenta la osmolaridad por ~ 1 mOsm. </li><li> Filtrar los buffers de crecimiento y observación con un filtro de 0,2 micras y almacenar a 4 ° C para inhibir el crecimiento bacteriano. </li><li> Disolver 50 mg de beta-caseína en 10 ml de TRIS 20 mM (pH 7,5) tampón para formar una solución de beta-caseína 5 mg / ml necesaria para pasivar las superficies de cámaras experimentales de modo que GUVs no se adhieren, se propagan y se rompen. Una vez que la beta-caseína se disuelve por completo (hasta varias horas a 4 ° C), el filtro (0.2 m) en alícuotas de 0,5 ml que se puede flash congelado y almacenadoa -20 ° C para su uso posterior (alícuotas descongeladas almacenados a 4 ° C por lo general se puede utilizar durante un máximo de un 1 semana). </li></ol> 2. Preparación SUV <ol><li> Prepare y congele alícuotas de Proteo-SUV siguiendo el protocolo detallado publicado previamente 28. Use KvAP marcada con fluorescencia con Alexa-488 maleimida, reconstituida en DPhPC SUVs (10 mg / ml) a una proteína a la relación de lípido de 1:10 (en masa). NOTA: De tipo salvaje KvAP contiene una cisteína por monómero situado cerca del extremo C-terminal intracelular (aminoácido 247). </li><li> Fluorescentes, en lípidos sólo SUV: NOTA: Maneje cloroformo bajo una campana de humos con guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Evite el uso de cualquier plástico como cloroformo puede disolverlos. Soluciones de cloroformo se pueden almacenar en viales de vidrio ámbar con tapas de teflón y se transfieren utilizando jeringas de vidrio. Tener cuidado para enjuagar todo el material de vidrio al menos 5 a 10 veces con cloroformo antes y después de pipetear los lípidos. <ol><li> Preparar 100 l de10 SUVs mg / ml DPhPC que contienen 0,5% en moles del lípido fluorescente de color rojo, rojo de Texas-DHPE, mediante la mezcla de 100 l de solución de DPhPC (10 mg / ml en cloroformo) con 8,2 l de solución de Rojo Texas-DHPE (1 mg / ml en metanol) en un vial de vidrio de 1,5 ml de color ámbar. </li><li> Secar los lípidos hacia abajo bajo una corriente de nitrógeno en una campana química mientras gira el vial. Cuando la película parece estar seca, coloque los lípidos en condiciones de vacío durante 3 horas para eliminar cualquier disolvente residual. </li><li> Añadir 100 l de tampón SUV a los lípidos, y agitar vigorosamente hasta que no lipídico queda pegado a las paredes del vial y la solución es uniformemente lechoso. </li><li> Sonicar la solución de lípidos para formar SUVs. Ajuste la posición del vial hasta que el ultrasonido hace que la mayor parte del movimiento y el flujo en el interior del vial, y tener cuidado de no calentar la solución innecesariamente. Continuar sonicación hasta que la solución se vuelve traslúcido, o cuando sea posible, transparente (2-5 minutos de sonicación punta, ~ 20 min de tratamiento con ultrasonidos de baño). </li><li> Aliquot SUV (por ejemplo, 10 l ó 20 l) y de congelación (-20 ° C) para su uso posterior. NOTA: Los lípidos, especialmente los lípidos insaturados, puede fácilmente avería. Soluciones de lípidos tienda a 20 ° C (o 80 ° C) en atmósfera de argón y utilizan dentro de los 6 meses. Productos de degradación de lípidos pueden ser detectados con cromatografía de capa fina. </li></ol></li></ol> 3. GUV Crecimiento por Electroformation <ol><li> Prepare la cámara electroformation. <ol><li> Si la cámara no se ha limpiado, retire las ventanas, elimine todo el sellador y la grasa, extraiga los cables, y enjuague y frote la cámara con un paño con agua y etanol (≥70%) alternativamente. </li><li> Frotar los cables así, se sumergen los alambres y la cámara en acetona, y sonicar durante 5 min. Limpie todo con un tejido nuevo utilizando acetona. Ponga la cámara en etanol y se somete a ultrasonidos durante 5 min. </li><li> Montar la cámara mediante la inserción de los cables a través de los agujeros, y girar y limpie los cables para asegurarse de que are limpio. Ponga la cámara en agua destilada, sonicar durante 5 min y secar la cámara con una corriente de nitrógeno o aire. </li></ol></li><li> Preparar 30 l de 3 mg / suspensión SUV ml en tampón SUV. Para formar GUVs que contienen proteínas, combine 8 l de Proteo-SUV (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), 2 l de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5% en moles TexasRed-DHPE) y 20 l de SUV tampón en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para una proteína final de lípidos (masa) relación de 1 a: 12,5 y 0,1% en moles TexasRed-DHPE. Mezclar enérgicamente la solución. <ol><li> Alternativamente, para practicar el protocolo de sólo con lípido SUVs, simplemente combinar 10 l de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC y 0,5% en moles TexasRed-DHPE) con tampón de SUV 20 l. </li></ol></li><li> Deposite la Solución SUV. <ol><li> Usar una pipeta de 2 l o 5 l jeringa de vidrio para depositar pequeños (&lt;0,2 mu l) gotitas de la solución SUV en los cables. Aproximadamente se necesita 1 l de solución para formar una serie de gotas a lo largo1 cm de alambre. Asegúrese de que las gotas son lo suficientemente pequeños y espaciados lo suficientemente aparte que no se toquen o fusible. </li><li> Deje que los SUVs depositados sequen durante ~ 30 minutos en el aire libre. Cuando todas las gotas se han asentado, gire el cable por lo que los depósitos de lípidos son más fáciles de observar con el microscopio. NOTA: Si los SUVs no se sequen lo suficiente, que sólo puede lavar los cables cuando se añade el tampón de crecimiento, mientras que el secado en exceso puede dañar la proteína. Debido a la humedad del aire influye en la velocidad de secado, el tiempo de secado y / o la humedad del aire se puede ajustar para obtener resultados óptimos 30. La película de lípidos en los cables debe ser visible en el microscopio. </li></ol></li><li> Montar la cámara. <ol><li> Sellar el fondo de la cámara: Utilice una jeringa para aplicar grasa de vacío a la parte inferior de la cámara alrededor de los tres pozos y presione un 40 mm x 22 mm cubreobjetos suavemente contra él para sellar el fondo de la cámara para que se adhiera sin un hueco. Selle los lados de la cámara (en la salida cables) consellado pasta. Aplicar grasa de vacío en la parte superior de la cámara de esbozar los tres pozos. </li><li> Agregue lentamente tampón crecimiento hasta cada pozo se llena hasta el tope. Evite cualquier movimiento rápido de la solución en los pozos, ya que esto puede pelar la película de lípido de los electrodos. </li><li> Cerrar la cámara pulsando el portaobjetos cubierta superior con cuidado sobre la grasa, teniendo cuidado de no desplazar el portaobjetos inferior. Utilice un tejido para eliminar las gotas de tampón a los bordes de la hoja de la cubierta superior. NOTA: Este es un buen momento para examinar la cámara bajo el microscopio para confirmar que la película de lípido se ha mantenido en los cables. </li></ol></li><li> Conecte el generador de señales a los cables utilizando dos pinzas de cocodrilo. Ajuste la frecuencia (10 Hz / 500 Hz onda sinusoidal de tampón salino de baja / alta) y usar un multímetro para medir y ajustar el voltaje a través de los cables de 0,7 / 0,35 V raíz cuadrada (Vrms) para el búfer de sal baja / alta significar. Cubra la cámara con papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz. Deja tél GUVs crecer durante 2 a 3 h para el tampón bajo en sal, y 12 hr o O / N para el tampón de alta sal. </li><li> Desconecte la cámara del generador y que lo coloque en un microscopio invertido para evaluar el crecimiento GUV. Utilice, movimientos lentos y firmes o flujo de líquido en los pozos pueden desprenderse prematuramente GUVs de los cables. NOTA: GUVs en los bordes de alambre son generalmente visibles en contraste de fase (40X mucho trabajo objetivo distancia), mientras GUVs en cualquier lugar en la mitad inferior de los cables se pueden ver con epifluorescencia. Si no hay GUVs son visibles, intente girar los cables a mirar a la cara superior. GUVs se pueden almacenar a 4 ° C en una cámara de crecimiento durante varios días. </li></ol> 4. GUV Crecimiento por Hinchazón asistida-Gel <ol><li> Preparar 10 ml de una solución de agarosa al 1% mediante la mezcla de 100 mg de agarosa con 10 ml de agua pura. Calentar hasta que hierva colocándolo en un microondas a 480 W durante ~ 20 seg. Revuelva para asegurarse de que la agarosa se disuelva por completo. NOTA: La soluciónse puede almacenar a 4 ° C y recalentado cuando sea necesario. </li><li> -Plasma limpia (plasma de aire) a-corredera de cobertura de 1 min de manera que la solución de agarosa se extenderá muy bien en él. Utilice los toboganes de cobertura dentro de los próximos 15 minutos como el efecto de limpieza por plasma desaparece rápidamente. </li><li> Aplicar 200 l de solución de agarosa caliente a cada 22 x 22 mm 2 diapositiva para la solución moja toda la superficie. Inclinar la placa verticalmente y tocar el borde inferior de un pañuelo de papel para eliminar el exceso de líquido y dejar sólo una capa lisa fina de agarosa en la diapositiva. </li><li> Colocar el portaobjetos en una placa caliente o un horno a 60 ° C y se deja secar durante al menos 30 minutos. La película de agarosa es apenas visible a simple vista. Después de las diapositivas se enfríen a temperatura ambiente, utilizar inmediatamente o almacenar durante un máximo de una semana en un recipiente cerrado a 4 ° C. </li><li> Coloque el cubreobjetos de agarosa recubiertas de 3,5 cm en un plato de Petri estándar. </li><li> Preparar la solución SUV como en la Sección 3.2 y aplicar ~ 15 l de la solución SUV (3 mg / ml de lípidos) en~ 30 gotas muy pequeñas suavemente sobre la superficie de agarosa. Tenga cuidado de no distorsionar la capa de agarosa demasiado. </li><li> Colocar el portaobjetos bajo una corriente suave de nitrógeno durante aproximadamente 10-15 min y seguir la evaporación de la memoria intermedia por el ojo como las gotitas se secan. </li><li> Tan pronto como las SUVs se han secado, añadir tampón de crecimiento para cubrir la superficie de deslizamiento. Para un pequeño 3,5 cm placa de Petri de uso ~ 1 ml de tampón. </li><li> Deje que la hinchazón de proceder para ~ 30 min, y luego examinar el crecimiento de GUVs en la cámara usando un microscopio invertido con contraste de fase o de contraste de interferencia (DIC). NOTA: la observación de epifluorescencia es difícil debido a la sólida formación de fluoróforos en el gel y la auto-fluorescencia de la agarosa. </li></ol> 5. La cosecha y de Observación GUVs <ol><li> Pasivar la cámara de observación (por ejemplo, pequeña placa de Petri o cubreobjetos de vidrio) para que GUVs no se pegan, se extendió y estalló en el fondo de la cámara. Cubra el chamBER parte inferior con una solución de beta-caseína, incubar durante 5 min, enjuagar la solución de caseína con agua pura, seca con una corriente de aire o nitrógeno, y finalmente añadir tampón de observación (por ejemplo, ~ 5 mm de profundidad para una pequeña placa de Petri). </li><li> Recoger las GUVs. Corte el extremo de unos 100 puntas de pipeta mu l por lo que la apertura es más grande (~ 2 mm de diámetro), y aspirar lentamente a medida que la tensión de corte de pipeteo puede destruir fácilmente GUVs. <ol><li> Para GUVs electro-formado, abrir la cámara de crecimiento quitando suavemente el cubreobjetos superior. Coloque la punta de la pipeta directamente sobre cada cable y aspirar ~ 50 l mientras se mueve la punta de la pipeta a lo largo del alambre para desprender las GUVs. NOTA: Puede ser útil para hacer girar el alambre para recoger GUVs en el &quot;otro lado&quot; del alambre. </li><li> Para GUVs &quot;gel asistida inflamación&quot;, primero toque el lado de la placa de Petri un par de veces para ayudar a los GUVs se desprenden de la superficie de cubreobjetos. Coloque la punta de la pipeta justo por encima del cubreobjetos y aspirado de 50 l mientras que Pulling la punta hacia atrás sobre la superficie. Transferir directamente GUVs cosechadas a una cámara de observación, o almacenar en un tubo de 1.5 ml a 4 ° C hasta por 1 semana. </li></ol></li><li> Coloque la cámara de observación en un microscopio invertido, agregue las GUVs a la cámara de observación, y espere unos minutos para que los GUVs que se depositan en el fondo de la cámara. </li><li> Encuesta de la cámara con contraste de fase o CID para localizar rápidamente, esféricas (&#39;defecto libres &quot;)&quot; candidatos GUV &quot;lisas. Examine cada &quot;candidato GUV&quot; en epifluorescencia para excluir cualquier liposomas más pequeños que contienen anidadas dentro. Por último, compruebe que la intensidad de la fluorescencia de lípidos es uniforme y compatible con una sola membrana (es decir, unilaminar). NOTA: En algunos bilaminar (o multi-lamelares) vesículas, las membranas son demasiado juntos por resolver para que aparezcan unilaminar en contraste de fase o DIC imágenes. Sin embargo, estos objetos se pueden distinguir de unilame realGUVs llar por su fluorescencia de lípidos, que es dos veces (o más) más brillantes. </li></ol> 6. GUVs Parche de sujeción <ol><li> Haga pipetas de parche con un diámetro de la punta 1-2 micras de vidrio estándar capilar borosilicato utilizando el programa recomendado para el extractor de la pipeta. NOTA: Los tratamientos especiales tales como pulido al fuego no son necesarios, y las pipetas se pueden utilizar durante varios días después de haber sido tirados si se mantienen en una caja cerrada. </li><li> Pasivar la cámara mediante la incubación con una solución de beta-caseína (5 mg / ml) para asegurar que GUVs no se adhieren, se propagan y ruptura en superficies de la cámara. Enjuague la caseína después de 5 min. </li><li> Inserte el electrodo de tierra, llenar la cámara con tampón de observación, transferir 10 l de la suspensión GUV como se describe en el paso 5.2 y 5.3, y espere unos minutos para que los GUVs se asienten en la parte inferior. </li><li> Llenar una pipeta parche nuevo con la solución (buffer de observación u otra solución iso-osmótica) ymontarlo en el patch-clamp amplificador cabezal de la platina. </li><li> Buscar a través de la cámara de la localización de un GUV &quot;sin defectos&quot; como se describe en la sección 5.4, y compruebe que contiene proteína fluorescente. </li><li> Aplique una presión positiva constante (&gt; 100 Pa, o aproximadamente 1 cm H 2 O en un manómetro) para mantener el parche pipeta interior limpio e inserte la pipeta parche en la cámara. Traiga la pipeta parche en el campo de visión, aplicar pulsos de prueba para medir / compensar el desplazamiento y la resistencia de tensión pipeta, y examinar la pipeta con iluminación fluorescente para confirmar que la punta esté limpio. </li><li> Lleve el parche pipeta hacia el GUV, y si es necesario, al mismo tiempo reducir la presión positiva por lo que el flujo hacia el exterior de la pipeta parche no hace que el GUV &quot;huir&quot;. Cuando el parche pipeta está cerca del GUV, aplique una presión negativa (hasta 5 cm H 2 O) para tirar del GUV contra la pipeta parche. Vigilar la resistencia como la &quot;; La lengua &quot;de la membrana GUV entra en la pipeta de parche y las formas gigaseal. </li><li> Si un gigaseal no se formó, retire el parche pipeta de la cámara y vuelva al paso 6.4. Si el parche de la membrana forma una gigaseal, pero el GUV permanece unido a la pipeta, escindir el parche tirando lejos de la GUV, estallando la GUV contra el fondo de la cámara, o brevemente mover la pipeta de la solución. </li><li> Cuando el parche de membrana de dentro a fuera se ha escindido del GUV y la gigaseal es estable, apagar los pulsos de prueba y aplicar un protocolo de voltaje tal como la que se muestra en la Figura 13. NOTA: La Figura 13 sigue la convención electrofisiológico estándar para un parche de dentro a fuera, en la que la corriente que fluye en el parche-electrodo es &quot;positivo&quot;, y V = V baño - V pipeta. Sosteniendo el parche a un potencial negativo (por ejemplo, V = -100 mV) para ~ 30 seg KvAP lugares en el estado de reposo, mientras que los pasos (100 ms a 5 s) a potenciales más positivos (por ejemplo, V = 100 mV) se puede conducir en la realización (es decir, abiertos) estados activos. </li><li> Después de que se terminaron las mediciones en un parche de membrana, romper el parche con un pulso zap o presión y comprobar que el desplazamiento del electrodo de conexión de tensión no se ha desviado. Retire el parche pipeta de la cámara, y vuelva al paso 6.4. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Sistemas de modelos biomiméticos son una herramienta importante para el estudio de las propiedades e interacciones de proteínas y membranas. En comparación con otros sistemas reconstituidos como BLM o membranas de lípidos compatibles, GUV sistemas basados ​​presentes varias oportunidades incluyendo considerable control de la composición de la membrana, la tensión y la geometría, así como ser verdaderamente libre de aceite. Sin embargo, la incorporación de proteínas transmembrana, como KvAP, en GUVs requiere adaptaciones...

Al estudiar los principios físicos que rigen los sistemas vivos, los enfoques ascendentes permiten un experimentalista para controlar la composición del sistema y otros parámetros que no son fácilmente manipulables en sistemas basados ​​en células 1. Para los procesos basados ​​en membranas, vesículas unilamelares gigantes (GUVs, diámetro ~ 1-100 micras) han demostrado ser un sistema muy útil biomimético 2 - 7 ya que son muy adecuado para estudios de microscopía y micromanipulación 8 - 10. Si bien hay muchos protocolos diferentes para producir GUVs, la mayoría caen en dos categorías - emulsión a base aproxima 11,12 y técnicas basadas en la rehidratación de una película lipídica 13-16. En los métodos basados ​​en emulsión, las láminas interior y exterior de las membranas GUV se ensamblan secuencialmente a partir de monocapas de lípidos en las interfases agua / aceite. Este método es ideal para la encapsulación de proteínas solubles conen los GUVs, y para la formación de GUVs con composición lipídica valva asimétrica. Sin embargo, GUVs formados a partir de emulsiones pueden retener trazas de disolvente que cambian las propiedades mecánicas de la membrana 17, y el enfoque no es especialmente adecuado para la reconstitución de proteínas trans-membrana. Métodos de rehidratación de película se basan en el hecho de que el secado (deshidratación) causa muchas mezclas de lípidos para formar una pila multi-lamelar de las membranas. Si esta pila se coloca entonces en contacto con un tampón acuoso, las membranas de la pila se moverán flujos separados como disolvente entre ellos y en la superficie de la pila, las membranas individuales pueden separar para formar GUVs 13,18 (así un verdadero zoológico de otros objetos lipídicos). Sin embargo, incluso para las composiciones de amortiguación y de lípidos óptimos, este método clásico &quot;inflamación espontánea&quot; tiene un rendimiento relativamente bajo de GUVs libres de defectos. Un método muy utilizado para aumentar el rendimiento de GUVs sin defectos es &quot;electroformation221 ;, en el que se aplica un campo de corriente alterna (AC) durante la rehidratación de la película. Mientras que el mecanismo sigue siendo poco conocida, &quot;electroformation&quot; puede dar rendimientos GUV espectaculares (&gt; 90% en circunstancias favorables) para los búferes de baja concentración de sal (&lt;5 mM) 14,19, e incluso se puede trabajar en tampones fisiológicos (~ 100 mM) usando una mayor frecuencia (500 Hz frente a 10 Hz) de campo de CA y electrodos de platino 15. Un enfoque alternativo para aumentar el rendimiento de GUVs libres de defectos es &quot;gel asistida inflamación&quot;, en el que se deposita la solución de lípidos sobre un sustrato de gel polimérico en lugar de la pasiva sustratos (por ejemplo, vidrio, PTFE) utilizado en &quot;inflamación espontánea clásica &quot;. Cuando se rehidrata la película de lípido / gel resultante, GUVs pueden formar rápidamente incluso para tampones fisiológicos 16,20. Todos estos métodos pueden producir GUVs lípidos sólo que se pueden utilizar para estudiar los fenómenos asociadas a la membrana tales como lala interacción entre las proteínas y las membranas solubles. Sin embargo, para incorporar una proteína trans-membrana en GUVs, se necesitan modificaciones importantes para asegurar que la proteína permanece en un estado funcional durante todo el procedimiento de reconstitución. Mientras que las soluciones de lípidos en disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo, ciclohexano) son ideales para la producción de películas de lípidos, las proteínas trans-membrana son típicamente sólo es estable cuando su dominio trans-membrana hidrófoba se incorpora en una bicapa lipídica, o rodeado por una micela detergente ( por ejemplo, durante la purificación de proteínas). Por lo tanto, el material de partida para una reconstitución es típicamente membranas nativas, proteína purificada en una solución de detergente, o pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas (Proteo-SUVs) y / o vesículas multilamelares (proteo-MLV) formado por la eliminación del detergente en el presencia de lípidos. La mayoría de los métodos para incorporar estas proteínas de membrana en GUVs se dividen en tres categorías. Insertio directon: Trans-proteína de membrana suspendida en el detergente se mezcla con, de sólo lípidos, GUVs solubilizadas ligeramente detergentes preformadas, y el detergente elimina a continuación usando Biobeads 21. Si bien conceptualmente simple, este método requiere un control preciso de la concentración de detergente, como una concentración demasiado alta de detergente puede disolver los GUVs mientras que una concentración demasiado baja puede causar la proteína se despliegue o agregado. GUV / Proteo-SUV Fusión: La proteína en Proteo-SUV se combina con preformadas, lípidos sólo para GUVs y fusión se facilita con péptidos de fusión especiales 22 o detergente 21. Normalmente la extensión de la fusión es limitada llevando a GUVs con baja densidad de proteínas. La deshidratación / rehidratación: Una película de lípidos que contiene proteína está formada por deshidratación parcial de un proteo-SUV (o proteo-MLV) solución y GUVs se cultivan como para una película lipídica pura. El reto es obvio para proteger a la proteína durante la dehydrati parcialen el paso 23, pero el método se ha utilizado con éxito para reconstituir proteínas trans-membrana tales como bacteriorodopsina, calcio-ATPasa, integrina y VDAC en GUVs 7,23 - 25. Este artículo describe protocolos de deshidratación / rehidratación para hacer GUVs que contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP, desde el Archaea, Aeropyrum pernix hiper-termófilo. KvAP tiene un alto grado de homología con los canales de potasio dependientes de voltaje eucariota 26 y una estructura cristalina conocida 27 , por lo que es un buen modelo para estudiar el mecanismo de compuerta de voltaje. La producción de los proteo-SUV ha sido descrito en detalle anteriormente y no es parte de este tutorial 26,28,29. Es importante destacar que, KvAP Proteo-SUVs no tienen que ser producidos para cada preparación GUV, ya que pueden ser almacenados en pequeñas alícuotas (por ejemplo, 10 l) a -80 ° C durante largos períodos de tiempo (&gt; 1 año). Electroformationo hinchazón gel asistida se puede usar entonces para crecer GUVs de los proteo-SUVs KvAP (o proteo-MLV). Los pasos clave para el protocolo electroformation se ilustran en la Figura 1. Gotitas de una solución de SUVs que contienen la proteína se depositan sobre alambres de platino (que se muestran en la Figura 2). Deshidratación parcial de la suspensión de SUV conduce a la formación de una película de lípidos y proteínas a través de la fusión de SUVs. Durante la rehidratación, un campo de corriente alterna se aplica a los electrodos para ayudar a las capas de lípidos a la delaminación y formar GUVs. Un campo de 10 Hz funciona bien cuando se utiliza &quot;bajo en sal&quot; (&lt;5 mM) rehidratación de amortiguación 28 y GUVs tardan varias horas para crecer. En contraste, los tampones fisiológicos (que contiene ~ 100 mM de sal) trabajar bien con un voltaje más bajo, campo 500 Hz AC pero requieren un prolongado (~ 12 h) hinchazón período 15. Este método se basa en un protocolo anterior usando ITO se desliza 24, pero utiliza un cont cámara de encargoaining dos alambres de platino, como se muestra en la Figura 2 (ver la discusión de los detalles de diseño y sugerencias para la más simple, cámaras improvisado). La Figura 3 ilustra el método hinchazón gel asistida. El protocolo funciona bien con tampones con concentraciones fisiológicas de sal, es rápida, y produce GUVs con una distribución más homogénea de proteínas. Sin embargo, el rendimiento de GUVs, aparentemente sin defectos aislados (es decir, la membrana GUV es uniforme en la longitud de las escalas ópticas y no encierra ningún objeto) es menor, a pesar de que ofrece un número suficiente de patch-clamp y experimentos de micro-manipulación . Este método se basa en un protocolo usando gel de agarosa para producir GUVs lípidos sólo 16 y requiere un equipo menos especializado que el método electroformation. La caracterización de GUVs con microscopía de fluorescencia se describe, así como los procedimientos que utilizan un estándar de patch-clamp set-up amedir la actividad KvAP en &quot;dentro-fuera&quot; extirpados parches de membrana. Cultivo GUVs que contienen proteínas pueden ser más difícil que GUVs lípidos solamente. En particular, el rendimiento GUV final puede depender sensiblemente de exactamente cómo la solución SUV se deposita y se deshidrata para formar la pila de membranas. Para alguien sin ninguna experiencia previa con GUVs, puede ser útil para crecer primero GUVs lípidos sólo siguiendo un protocolo convencional de 15,16 en el que la película de membrana se forma mediante el depósito de lípidos en un disolvente orgánico. Una vez que el protocolo convencional funciona bien, SUV deposición y deshidratación parcial luego se pueden dominar el uso de los SUV de lípidos sólo, que también son muy útiles cuando se ajusta el protocolo para una nueva composición de los lípidos. Cuando GUVs crecen de forma fiable de los SUV de lípidos sólo, entonces es sólo un pequeño paso para producir GUVs que contienen proteínas de Proteo-SUV.

<table><tbody><tr><td>DPhPC (1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina)</td><td>Avanti Lípidos Polares&nbsp;</td><td>850356P</td><td></td></tr><tr><td>Huevo PC L-&alfa;-fosfatidilcolina (Huevo, Pollo)&nbsp;</td><td>Avanti Lípidos Polares&nbsp;</td><td>840051P</td><td></td></tr><tr><td>Huevo PA L-&alfa;-ácido fosfatídico (Huevo, Pollo)</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>840101P</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta; 9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Lípidos Polares&nbsp;</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol (lana ovina, >98%)&nbsp;</td><td>Avanti Lípidos Polares&nbsp;</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>TRed-DHPE</td><td>Invirtogen</td><td>T-1395MP</td><td>lípido etiquetado</td></tr><tr><td>BPTR-Ceramida</td><td>Invirtogen</td><td>D-7540&nbsp;</td><td>Lípidos etiquetados</td></tr><tr><td>Choloroformo</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>20066.296</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton Bonaduz AG</td><td></td><td>diversos</td></tr><tr><td>viales de ámbar y vasos de teflón</td><td>Sigma</td><td>SU860083 y SU860076</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>diverso</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Euromex</td><td>LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>84097-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa</td><td>Sigma</td><td>T9531-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Euromex</td><td>EU0011-A</td><td></td></tr><tr><td>Osmómetro</td><td>Wescor</td><td>Vapro</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Schott instruments</td><td>Lab850</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Elmasonic</td><td>S 180 H</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0.2 &micro; m</td><td>Sartorius steim</td><td>Minisart 16532</td><td></td></tr><tr><td>Generador de funciones</td><td>TTi</td><td>TG315</td><td></td></tr><tr><td>Hilos de platino</td><td>Goodfellow</td><td>LS413074</td><td>99,99+%, d = 0,5 mm</td></tr><tr><td>Politetrafluoroetileno</td><td>Goodfellow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 'grasa de alto vacío'VWR</td><td></td> <td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>pasta de sellado</td><td>Vitrex medical A/S, Dinamarca</td><td>REF 140014</td><td>Sigillum</td></tr><tr><td>Wax Correderas de cubierta 22 x 40 mm Nº 1.5</td><td>VWR</td><td>631-0136</td><td></td></tr><tr><td>Correderas de cubierta 22 x 22 mm Nº 1.5</td><td>VWR&nbsp;</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td>de airplasma, ajuste 'alto'Placas</td></tr> <tr><td>de Petri</td><td>Falcon BD</td><td>REF 353001</td> amplificador de abrazadera de parche de <td>3,5 cm x 1 cm</td></tr><tr><td></td><td>Axon instruments</td><td>Multiclamp700B</td><td></td></tr><tr><td>Tarjeta DAQ</td><td>de National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>Versión de National Instruments</td><td> 8.6</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio de silicato de boro OD 1&nbsp; mm ID 0.58&nbsp; mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>Portaelectrodos</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>Q45W-T10P</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>P-2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>ProSilica&nbsp;</td><td>GC1380</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Zeiss</td><td></td><td>Axiovert 135</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Zeiss</td><td></td><td>40X larga distancia de trabajo, Contraste de fase</td></tr><tr><td>Objetivo&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>100X Plan-Apochromat NA 1.3</td></tr><tr><td>Filterset GFP (para Alexa-488)</td><td>Horiba</td><td>XF100-3</td><td></td></tr><tr><td>Filterset Cy3 (para TexasRed)</td><td>Horiba</td><td>XF101-2</td><td></td></tr><tr><td>beta-caseína</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6905-1G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Nikon Eclipse TE 2000-E</td><td></td><td>D-Eclipse C1 cabezal confocal</td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan Fluor 100X NA 1.3</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>para el procesamiento de imágenes y el análisis de las trazas actuales</td></tr></tbody></table>

reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, kvap, en gigante vesículas unilamelares para microscopía y patch clamp estudios

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Gigante vesículas unilamelares (GUVs) son un sistema biomimético popular para el estudio de la membrana fenómenos asociados. Sin embargo, comúnmente utilizados protocolos para crecer GUVs deben modificarse con el fin de formar GUVs que contienen proteínas transmembrana funcionales. En este artículo se describen dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e hinchazón gel asistida - para formar GUVs contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP. En ambos métodos, una solución de pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas es parcialmente deshidratado para formar una pila de membranas, que después se deja a hincharse en un tampón de rehidratación. Para el método de electroformation, la película se deposita sobre electrodos de platino de manera que un campo de corriente alterna puede ser aplicada durante la rehidratación de la película. En contraste, el método de la hinchazón gel asistida utiliza un sustrato en gel de agarosa para mejorar la rehidratación de la película. Ambos métodos pueden producir en GUVs (por ejemplo, 100 mM) concentraciones bajas (por ejemplo, 5 mM) y fisiológicas de sal. Los GUVs resultantes se caracterizan por medio de microscopía de fluorescencia, y la función de los canales reconstituidas midieron utilizando la configuración de patch-clamp de dentro a fuera. Mientras que la hinchazón en la presencia de un campo eléctrico alterno (electroformation) da un alto rendimiento de GUVs libres de defectos, el método hinchazón gel asistida produce una distribución más homogénea de proteínas y no requiere equipo especial.

El crecimiento de GUVs se puede evaluar de forma rápida mediante el examen de la cámara de crecimiento bajo el microscopio. Para electroformation, los GUVs tienden a crecer en racimos a lo largo de los alambres de platino, como se muestra en la Figura 4. Durante la hinchazón gel asistida, GUVs aparecen como estructuras esféricas que crecen y se fusionan juntos (Figura 5) rápidamente. GUVs sin defectos son más fácilmente identificados y evaluados después de t...

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en incorporar canales iónicos regulados por voltaje en vesículas unilamelares gigantes y caracterizar su actividad mediante mediciones de parche con electrodo. Esto se logra primero deshidratando parcialmente una solución de vesículas pequeñas que contienen el canal iónico KVAP para crear una película de lípidos y proteínas. A continuación, la película lipídica se rehidrata, lo que provoca la formación y crecimiento de vesículas gigantes del tamaño celular, llamadas vesículas gigantes unilamelares (GVs), que contienen el canal.Luego, las vgs se transfieren a nuestra cámara de registro y se excisa un fragmento de membrana de VUG mediante una pipeta de parche para medir las corrientes iónicas. Los resultados muestran que los canales iónicos en la membrana de VUG se activan en respuesta a cambios en el voltaje de la membrana, según el análisis de los registros de corriente. Las físicas unilaterales gigantes pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica relacionadas con las interacciones de proteínas de membrana.Por ejemplo, la interacción de las proteínas transmembrana con las propiedades físicas de la membrana lipídica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función del canal de hierro sensible al voltaje KVAP, también puede aplicarse a otros canales de hierro, transportadores y bombas, así como a proteínas transmembrana en general. La demostración visual de este método es fundamental, ya que lo son los pasos que implican la manipulación de vesículas gigantes.Cómo comenzar a leer solo artículos Después de preparar soluciones y vesículas pequeñas unilamelares que contienen KVAP. Según el protocolo descrito en el texto, prepare la cámara de electroformación insertando primero los alambres a través de los orificios y girándolos mientras los limpia, para asegurarse de que estén limpios, luego séllelos y séquelos bajo un flujo de nitrógeno o aire. Prepare 30 microlitros de una suspensión de vesículas pequeñas unilamelares (SUV) a 3 miligramos por mililitro en tampón SUV como se describe en el protocolo del texto, y mezcle vigorosamente la solución para depositar la suspensión de SUV.Utilice una pipeta de dos microlitros o una jeringa de vidrio de cinco microlitros para colocar pequeñas gotas de la solución de SUV sobre los alambres. Asegúrese de que las gotas sean lo suficientemente pequeñas y estén lo suficientemente separadas como para que no se toquen ni fusionen. Deje secar los SUV depositados durante aproximadamente 30 minutos al aire libre.Una vez que las gotas se hayan asentado, gire el alambre para que los depósitos lipídicos sean más fáciles de observar con el microscopio. A continuación, use una jeringa para aplicar grasa para vacío en la parte inferior de la cámara alrededor de los tres pozos y presione suavemente una cubreobjetos de 40 milímetros por 22 milímetros contra ella para sellar la base de la cámara, de modo que quede adherida sin espacios. Luego, use pasta para techos para sellar los lados de la cámara y aplique grasa para vacío en la parte superior de la cámara, delineando los tres pozos.Agregue lentamente el tampón de crecimiento hasta que cada pocillo esté lleno hasta el borde. Evite cualquier movimiento rápido de la solución en los pocillos, ya que esto puede. Retire la película lipídica de los electrodos.Cierre la cámara presionando suavemente la cubierta superior sobre la grasa, teniendo cuidado de no desplazar la laminilla inferior. Utilice dos pinzas de cocodrilo para conectar el generador de señales a los cables.Configure la frecuencia según la concentración de sal del tampón que se esté utilizando y, con un multímetro, mida y ajuste el voltaje entre los cables. Asimismo, según su tampón, use papel de aluminio para cubrir la cámara y proteger la flora fours de la luz. Deje que los G UUVs crezcan de dos a tres horas en el tampón de baja salinidad y 12 horas o durante la noche en el tampón de alta salinidad.Después de la incubación, desconecte la cámara del generador y colóquela cuidadosamente sobre un microscopio invertido. Para evaluar el crecimiento de las VUG en el plasma, limpie un portaobjetos durante un minuto para que la solución ARO se extienda adecuadamente sobre él. Dentro de los 15 minutos posteriores a la limpieza del portaobjetos, aplique 200 microlitros de la solución ARO tibia preparada según el protocolo descrito en el texto, de modo que humedezca toda la superficie.Incline la placa verticalmente y toque el borde inferior con un tejido para eliminar el exceso de líquido, dejando una capa fina y uniforme de aros sobre la placa. Coloque la placa en una placa calefactora o horno a 60 grados Celsius y déjela secar durante al menos 30 minutos. A continuación, coloque un cubreobjetos recubierto con AROS en una placa de Petri estándar de 3,5 centímetros.Luego, tras preparar la solución de SUV, aplique suavemente aproximadamente 15 microlitros en alrededor de 30 gotas muy pequeñas sobre la superficie de aros. Tenga cuidado de no deformar demasiado la capa de aros. Coloque el portaobjetos bajo una corriente suave de nitrógeno durante unos 10 a 15 minutos y observe visualmente la evaporación del tampón.Dado que las gotas se secan tan pronto como los SUV se han secado, agregue aproximadamente un mililitro de tampón de crecimiento para cubrir la superficie del portaobjetos. Permita que la hinchazón continúe durante unos 30 minutos y luego utilice un microscopio invertido con contraste de fase o DIC para examinar el crecimiento de los GU UUV en la cámara de crecimiento. Realice el registro de parche en gu UUV dentro de la cámara añadiendo una solución de beta caine de cinco miligramos por mililitro, que evita que los Gus se adhieran, se extiendan y se rompan. Incube durante cinco minutos, enjuague, inserte el electrodo de tierra y use tampón de observación para llenar la cámara.A continuación, transfiera los GU UUVs al recinto de observación para GU UUVs electroformados. Abra el recinto de crecimiento retirando suavemente la cubreobjetos superior. Coloque la punta de la pipeta directamente encima de cada alambre y, para desprender los GU UUVs, aspire lentamente unos 10 microlitros mientras mueve la punta de la pipeta a lo largo del alambre para los GU UUVs con hinchazón asistida por gel.Primero, golpee suavemente el costado de la placa de Petri varias veces para desprender los GU UUVs de la superficie del cubreobjetos. Coloque la punta de la pipeta justo encima del cubreobjetos y aspire 10 microlitros mientras retira la punta sobre la superficie, transfiriendo directamente los GVS recolectados a la cámara de observación. Espere unos minutos para que los Gus se sedimenten en el fondo antes de realizar el registro con parche adherido en los GVS.Utilice el tampón de observación para llenar una pipeta de registro nueva y colóquela en la etapa del cabezal del parche. Explore la cámara para localizar una GUV sin defectos y verifique que contenga proteína fluorescente. Aplique una presión positiva constante superior a 100 pascales para mantener limpia el interior de la pipeta de registro e inserte la pipeta en la cámara.Lleve la pipeta de registro al campo de visión y aplique pulsos de prueba para medir o compensar el desplazamiento de voltaje y la resistencia de la pipeta. A continuación, examine la pipeta bajo iluminación fluorescente para confirmar que la punta esté limpia. Acérquese con la pipeta de registro hacia la GUV y, si es necesario, reduzca simultáneamente la presión positiva para que el flujo hacia afuera desde la pipeta no haga que la GUV se desplace.Cuando la pipeta de registro esté cerca de la VUG, aplique presión negativa para atraer la VUG hacia la pipeta de registro. Monitoree la resistencia mientras la lengua de la membrana de la VUG entra en la pipeta de registro y se forma el sello gigohmio. Una vez que el parche de membrana de tipo inside-out haya sido diseccionado de la VUG y el sello gigohmio sea estable, desactive los pulsos de prueba y aplique un protocolo de voltaje según se describe en el texto.Esta figura muestra imágenes de DIC y de fluorescencia epifluorescente de una GUV sin defectos. La fluorescencia proteica uniforme en la membrana de la GUV confirma que KVAP se ha incorporado en la GUV en lugar de permanecer en la película lipídica, y que no ha formado agregados. Aquí se observan las GUV producidas mediante los tres métodos. Las señales fluorescentes de lípidos y proteínas se han ajustado a la misma densidad media para que las GUV con baja o alta densidad proteica presenten un tono magenta o verde en las imágenes superpuestas, mientras que las GUV con densidad proteica media aparecen en blanco.Se identificaron GUV individuales sin defectos y aquí se muestra la distribución del tamaño de los GUV. Por lo general, la electroformación produce más GUV sin defectos que la hinchazón asistida por gel, pero los GUV producidos por electroformación son más pequeños. Aquí se muestra la distribución de densidad proteica inferida a partir de la fluorescencia de los GUV.La formación electroquímica con tampón de alta salinidad produce UUV de GU con densidades proteicas variables. La densidad varía mucho menos en la formación electroquímica con tampón de baja salinidad, y la densidad proteica de las UUV de GU producidas mediante hinchamiento asistido por gel es notablemente uniforme, dependiendo de la concentración de proteína en el parche excisado. Los trazos de corriente muestran ya sea canales individuales o un conjunto de canales.KVAP muestra una apertura dependiente del voltaje. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las vesículas gigantes son objetos frágiles y no resistentes a tensiones cortantes y al estrés osmótico. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos como la tracción de nanotubos lipídicos para responder preguntas adicionales, como la detección de curvatura por proteínas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir GVS que contengan proteínas funcionalmente reconstituidas.

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