Método simple de ADN de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es utilizar hibridación in situ de ADN para mapear secuencias heterocromáticas en cromosomas mitóticos. Esto se logra primero mediante la disección de cerebros de larvas de Drosophila de tercer estadio, u otro tejido de interés. El segundo paso consiste en fijar el tejido sobre un portaobjetos.

A continuación, el tejido se aplasta entre la cubreobjetivo y una portaobjetivo. Para preparar los cromosomas para la hibridación, el paso final consiste en hibridar sondas oligonucleotídicas sintetizadas cortas con el tejido aplastado. Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia para mostrar la localización de las secuencias complementarias a las sondas oligonucleotídicas en los cromosomas.

La principal ventaja de este método frente a los métodos existentes es su simplicidad. La mayoría de los otros métodos de hibridación cromosómica y C dos implican lavados con grandes cantidades de formamida, lo cual puede ser costoso y complicado. Nuestro método no requiere lavados con formamida, lo que lo convierte en una técnica más económica, más limpia y más rápida.

Aunque este método proporciona una forma sencilla de mapear visualmente secuencias en los cromosomas somáticos de cerebros de Drosophila, también puede utilizarse para mapear secuencias en otros tipos de cromosomas procedentes de distintos tejidos y organismos. Para cada portaobjetos que se prepare, tome cuatro o cinco tejidos, pero no más en las disecciones de cerebro. Comience seleccionando larvas de tercer estadio errantes y reuniéndolas en una gota de 1x PBS.

Seleccione viales para recolectar que no estén demasiado poblados. Bajo el microscopio de disección, use pinzas ultrafinas para sujetar los ganchos bucales y otro par de pinzas para agarrar a dos tercios de la longitud del cuerpo. Luego, tire suavemente de los ganchos bucales para exponer el cerebro, los ganglios ventrales, las glándulas salivales y partes del tracto digestivo.

A continuación, separe con pinzas el cerebro y los ganglios ventrales del resto de los tejidos y transfiéralos a una gota de XPBT 1X en una placa de plástico. Para las disecciones de testículo de nasia, recolecte pupas macho de tres días de edad. Las pupas de tres días de edad tienen cuerpos amarillos y ojos rojos.

Los que tienen placas alares más pequeñas son machos. Sujete la pupa en la parte superior del abdomen, cerca de la región torácica, con un par de pinzas y, con un segundo par de pinzas, tome la punta más distal del abdomen; luego, extraiga los testículos con forma de lágrima.

Están rodeados por cuerpos grasos que pueden eliminarse suavemente agitándolos, retire cualquier parte corporal externa de los testículos, lo cual evitará un aplastamiento adecuado, y transfiera los testículos a una gota de XPBT 1× en una placa limpia. Una vez recolectados todos los tejidos, trátelos con una solución hipotónica para mejorar la separación de las cromátidas hermanas. En las regiones eucromáticas, transfiera los tejidos a una gota de citrato de sodio al 0,5 % durante 10 minutos.

Para obtener este efecto, no se recomienda el uso de colchicina porque puede causar artefactos en la morfología cromosómica. Ahora, fije los tejidos utilizando pinzas ultrafinas. Trasládelos a una gota de 20 microlitros de PFA al 2,5% recién preparado en ácido acético al 45% sobre un portaobjetos limpio tratado con recubrimiento sigma, distribuya los tejidos uniformemente en el fijador e incube durante cuatro minutos a temperatura ambiente; luego continúe con la aplastamiento de los cubreobjetos. Comience colocando ligeramente un portaobjetos recubierto con polilisina hacia abajo sobre el tejido y el cubreobjetos.

Deje que el cubreobjetos se adhiera al reverso del portaobjetos sin presionar. Tratar los cubreobjetos con sigma coat ayuda a garantizar que el tejido aplastado permanezca en el portaobjetos tras la retirada del cubreobjetos. Sin embargo, en raras ocasiones el tejido podría permanecer adherido al cubreobjetos.

Durante este paso, recomendamos realizar réplicas de apliados de tejido. Ahora gire el portaobjetos y colóquelo en un trozo de papel grueso doblado. Luego, sobre una superficie estable, presione firmemente hacia abajo con el pulgar directamente sobre el cubreobjetos.

No presione de forma que deslice la cubierta, ya que esto manchará el tejido. Presionar con mucha firmeza normalmente produce cromosomas bien definidos dentro del tejido aplastado. Sin embargo, en ocasiones, podría observar variabilidad en la calidad de los cromosomas, como cromosomas incompletos, aplastados o fragmentados.

Nuevamente, recomendamos realizar dos o tres aplastamientos tisulares por réplica. Transfiera el montaje a un bloque de hielo durante unos minutos, luego sumérjalo en nitrógeno líquido hasta que deje de hervir el nitrógeno, o por más tiempo. Después de retirar el portaobjetos inmediatamente antes de que el tejido se derrita, use una cuchilla de afeitar nueva para levantar una esquina del cubreobjetos. Así retirándolo.

Tenga cuidado de no rayar el tejido. Luego, coloque rápidamente la laminilla en un frasco Coplin lleno de etanol al 100 % y déjela en remojo durante al menos cinco minutos. Retire la laminilla, elimine el exceso de etanol por absorción sin tocar el tejido y deje que la laminilla se seque al aire durante una hora.

Las láminas pueden almacenarse luego durante semanas o meses en una cámara de desecación. Comience añadiendo 100 nanogramos de cada sonda a 20 microlitros de tampón de hibridación 1,1 x para obtener una solución de 22 microlitros de tampón de hibridación 1 x. Luego, aspire la mezcla sobre el tejido fijado, dejando el tejido intacto, y coloque suavemente una cubreobjetos.

Una pequeña burbuja de aire que no esté en contacto con el tejido no presentará problemas, pero cualquier burbuja adicional requiere reaplicar el cubreobjetos. Coloque el portaobjetos sobre el lado plano de un bloque calefactor de 95 grados Celsius y cúbralo con papel de aluminio. Espere cinco minutos, durante los cuales puede preparar la cámara de humedad agregando toallas de papel húmedas a una caja para puntas.

Luego retire el portaobjetos. Envuélvalo cuidadosamente con parafina estirada y colóquelo en una cámara humidificada compuesta por una toalla húmeda dentro de una caja para puntas. Incube el portaobjetos en la cámara durante cuatro horas hasta toda la noche a 30 grados Celsius. Esta temperatura funciona bien para sondas con bajo contenido de GC, pero para sondas con mayor contenido de GC, puede ser necesario realizar algunos ajustes con las temperaturas de hibridación.

Después de la incubación, retire cuidadosamente la película de parafina y levante lentamente la cubreobjetos por una esquina. Luego lave el portaobjetos tres veces en tampón 0.1 XSSC durante 15 minutos por cada lavado. Cubra el frasco con papel de aluminio durante los lavados para minimizar la exposición a la luz.

Para sondas biotiniladas largas, agregue rod domine avadon y lave antes de continuar. En primer lugar, seque el área alrededor del tejido y cubra el tejido con 100 microlitros de solución bloqueadora. Luego, coloque suavemente un cubreobjetos nuevo sin atrapar burbujas.

Nuevamente, envuelva el portaobjetos con parafina. Luego, incube el portaobjetos a 37 grados Celsius durante 30 minutos. En segundo lugar, después de la incubación, retire el cubreobjetos y seque alrededor del tejido con una toallita.

Luego, aplique sobre el tejido 100 microlitros de una dilución de uno a 1000 de rumina avadón en SBT. A continuación, cúbralo, enróllelo y incube el portaobjetos como se hizo con el bloque. Por último, retire cuidadosamente el cubreobjetos y lave el portaobjetos.

Utilice tres lavados en cuatro x SSC T, seguidos de tres lavados en 0,1 x SSC. Cada paso de lavado debe durar al menos cinco minutos. Continúe con el protocolo secando las laminillas mediante absorción del tampón excesivo sin tocar el tejido.

Luego, coloque la laminilla con el tejido hacia arriba en un lugar oscuro durante 10 a 15 minutos o hasta que la humedad se evapore completamente. Ahora, monte la laminilla utilizando 11 microlitros de Vector Shield con DAPI y coloque cuidadosamente una cubreobjetos no recubierta con sigma. Si el medio no alcanza todos los bordes, agregue unos microlitros adicionales de medio desde el borde y elimine cualquier exceso.

Luego, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y guarde el portaobjetos en posición vertical en un lugar oscuro mientras se seca el esmalte, lo cual generalmente toma al menos media hora. A continuación, almacene el portaobjetos a menos 20 grados Celsius durante hasta una semana e image el tejido lo antes posible. Un conjunto de pequeños oligonucleótidos sintetizados comercialmente con conjugados fluorescentes y una sonda biotinilada más larga elaborada mediante la técnica de traducción de mella se hibridaron todos a cromosomas procedentes de varios tipos de tejidos diferentes.

Mediante la metodología descrita, la sonda para la repetición satélite de 359 pares de bases de Drosophila Melanogaster reconoció un gran bloque de varios megapares de bases en el cromosoma X y una región mucho más pequeña en el cromosoma tres. Una sonda más larga frente al satélite respondedor detectó bloques de repeticiones que consisten en números relativamente bajos de copias repetidas, de aproximadamente 700. Por lo tanto, este método permite la visualización de bloques satélite muy pequeños.

Cuando el paso del tratamiento con la solución hipotónica se duplicó en duración hasta 10 minutos, aumentó la separación de las cromátidas hermanas. Este procedimiento puede combinarse con otros métodos, como la tinción con anticuerpos, para responder preguntas como si ciertas proteínas de la cromatina se localizan en secuencias específicas.