Método simple de ADN de fluorescencia In Situ Hibridación a los cromosomas aplastado

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la hibridación in situ de ADN para mapear secuencias heterocromáticas a cromosomas mitóticos. Esto se logra diseccionando primero los cerebros de las larvas de Drosophila u otro tejido de interés. El segundo paso es fijar el pañuelo en un cubreobjetos.

A continuación, el pañuelo se aplasta entre el cubreobjetos y un portaobjetos. Para preparar los cromosomas para la hibridación, el paso final es hibridar sondas de oligonucleótidos sintetizadas cortas con el tejido aplastado. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para mostrar la localización de secuencias complementarias a las sondas de oligo en los cromosomas.

La principal ventaja de este método sobre los métodos existentes es su simplicidad. La mayoría de los otros métodos de hibridación de cromosomas y C dos implican lavados con grandes cantidades de forma amida, lo que puede ser costoso y desordenado. Nuestro método no requiere lavados de forma IDE, lo que lo convierte en una técnica más barata, limpia y rápida.

Aunque este método proporciona una forma sencilla de mapear visiblemente las secuencias en los cromosomas somáticos de los cerebros de Drosophila, también se puede utilizar para mapear secuencias en otros tipos de cromosomas de diferentes tejidos en los diferentes organismos. Para cada portaobjetos que se haga, prepare cuatro o cinco tejidos, pero no más para las disecciones cerebrales. Comience seleccionando las larvas errantes del tercer estadio y recolectándolas en una gota de un XPBS.

Elija viales para recolectar que no estén abarrotados. Bajo el endoscopio de disección, use pinzas ultrafinas para agarrar los ganchos de la boca y otro par para agarrar dos tercios a lo largo del cuerpo. A continuación, tire suavemente de los ganchos bucales para exponer el cerebro, los ganglios ventrales, las glándulas salivales y partes del tracto digestivo.

A continuación, separe el cerebro y los ganglios ventrales de los otros tejidos y transfiéralos a una gota de un XPBT en una placa de plástico. Para las disecciones de nasia testículos, recoja el puy macho de tres días de edad. Los puy de tres días de edad tienen el cuerpo amarillo y los ojos rojos.

Los que tienen almohadillas alares más pequeñas son machos. Agarre la pupa en la parte superior del abdomen cerca de la región torácica con un par de pinzas y con un segundo par de pinzas. Agarra la punta muy distal del abdomen y luego saca los testículos en forma de lágrima.

Están rodeados de cuerpos de grasa que se pueden sacudir suavemente, separar cualquier parte exterior del cuerpo de los testículos, lo que evitará el aplastamiento adecuado y transferir los testículos a una gota de un XPBT en una placa limpia. Una vez recolectados todos los tejidos, trátelos con una solución hipotónica para mejorar la separación de las cromátidas hermanas. En las regiones cromáticas e, transfiera los tejidos a una gota de citrato de sodio al 0,5% durante 10 minutos.

Para obtener este efecto, no se recomienda la colchicina porque puede causar artefactos en la morfología de los cromosomas. Ahora, fija los pañuelos con unas pinzas ultrafinas. Transfiéralos a una gota de 20 microlitros de 2,5 % de PFA recién hecho en ácido acético al 45 % en un cubreobjetos limpio tratado con una capa Sigma, espacie los tejidos de manera uniforme en el fijador e incube durante cuatro minutos a temperatura ambiente y luego proceda a aplastar los cubreobjetos, comience colocando ligeramente un portaobjetos recubierto de polilisina boca abajo sobre el pañuelo y el cubreobjetos.

Deje que el deslizamiento de la cubierta se pegue a la parte inferior de la corredera sin presionar. Tratar. Los cubreobjetos con capa sigma ayudan a garantizar que el tejido de la calabaza permanezca en el portaobjetos después de la eliminación del cubreobjetos. Sin embargo, con poca frecuencia, el tejido podía permanecer adherido al cubreobjetos.

Durante este paso, recomendamos realizar calabazas de tejido replicadas. Ahora dale la vuelta a la diapositiva y colócala en un trozo de papel grueso doblado. Luego, sobre una superficie estable, con el pulgar, presione muy firmemente hacia abajo sobre el cubreobjetos.

No presione de manera que deslice la cubierta o manchará el tejido. Un prensado muy firme normalmente da como resultado cromosomas bien resueltos dentro del tejido de la calabaza. Sin embargo, en ocasiones, puede encontrar variabilidad en la calidad de los cromosomas, como cromosomas incompletos, aplastados o fragmentados.

Así que, de nuevo, recomendamos realizar dos o tres calabazas de tejido replicadas. Transfiera el conjunto a un bloque de hielo durante unos minutos, luego sumérjalo en nitrógeno líquido hasta que el nitrógeno deje de hervir o más. Después de quitar el portaobjetos inmediatamente antes de que el pañuelo se descongele, use una hoja de afeitar nueva para mover una esquina del cubreobjetos. Por lo tanto, eliminándolo.

Tenga cuidado de evitar rascarse el tejido. Luego, coloque rápidamente el portaobjetos en un frasco de coplin lleno de etanol al 100% y déjelo en remojo durante al menos cinco minutos. Retire la mecha del portaobjetos para eliminar el exceso de etanol sin tocar el tejido y deje que el portaobjetos se seque al aire durante una hora.

Los portaobjetos se pueden almacenar durante semanas o meses en una cámara de desecación. Comience agregando 100 nanogramos de cada sonda a 20 microlitros de tampón de hibridación 1.1 x para una solución de 22 microlitros de un tampón de hibridación. A continuación, pipetee la mezcla sobre el tejido fijado, dejando el tejido intacto, y aplique suavemente un cubreobjetos.

Una pequeña burbuja de aire que no entre en contacto con el tejido no presentará problemas, pero más burbujas justifican la reaplicación del cubreobjetos. Coloque el portaobjetos en el lado plano de un bloque de calor a 95 grados centígrados y cúbralo con papel de aluminio. Espere cinco minutos durante los cuales puede preparar la cámara de humedad agregando toallas de papel húmedas a una caja de propinas.

A continuación, retire la corredera. Envuelva cuidadosamente el portaobjetos en un paraforma estirado y transfiéralo a una cámara humidificada compuesta por una toalla húmeda En una caja de puntas, incube el portaobjetos en la cámara durante cuatro horas o toda la noche a 30 grados centígrados. Esta temperatura funciona bien para sondas de bajo contenido de GC, pero para sondas con mayor contenido de GC, es posible que sea necesario solucionar algunos problemas con las temperaturas de hibridación.

Después de la incubación, retire con cuidado la película para y levante lentamente el cubreobjetos por una esquina. A continuación, lave el portaobjetos tres veces con un tampón XSSC de 0,1 durante 15 minutos por lavado. Cubra el frasco con papel de aluminio durante los lavados para minimizar la exposición a la luz.

Para sondas biotiniladas largas, agregue varilla domine avadon y lave antes de continuar. En primer lugar, seque el área alrededor del tejido y cubra el tejido con 100 microlitros de solución bloqueante. A continuación, aplique suavemente un nuevo cubreobjetos sin que queden burbujas atrapadas.

De nuevo, envuelve la diapositiva con param. A continuación, incuba el portaobjetos a 37 grados centígrados durante 30 minutos. En segundo lugar, después de la incubación, retire el cubreobjetos y seque alrededor del tejido con una toallita.

A continuación, sobre el tejido, aplicar 100 microlitros de uno por cada 1000 de agave rumine diluidos en SBT. A continuación, cubre, envuelva e incube el portaobjetos como se hizo con el bloque. Por último, retire con cuidado el cubreobjetos y lave la corredera.

Utilice tres lavados en cuatro x SSC T, seguidos de tres lavados en 0.1 XSSC. Cada paso de lavado debe durar al menos cinco minutos. Siguiendo con el protocolo, seque los portaobjetos secando el exceso de tampón sin tocar el tejido.

A continuación, coloque el portaobjetos con el pañuelo hacia arriba en un lugar oscuro durante 10 a 15 minutos o hasta que la humedad se disipe por completo. Ahora, monte la corredera con 11 microlitros de escudo vectorial con DPI y baje con cuidado sobre un deslizamiento de cubierta de capa no sigma. Si el medio no llega a todos los bordes, aplique unos pocos microlitros más de medio desde el borde y limpie el exceso.

A continuación, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y guarde el portaobjetos en posición vertical en un lugar oscuro mientras se seca el esmalte de uñas, lo que suele tardar al menos media hora. A continuación, guarde el portaobjetos a menos 20 grados centígrados durante un máximo de una semana y obtenga imágenes del tejido lo antes posible. Un conjunto de pequeños oligonucleótidos sintetizados comercialmente con conjugados fluorescentes y una sonda biotinilada más larga fabricada por Nick Translation se hibridaron con cromosomas de varios tipos de tejidos diferentes.

Utilizando la metodología descrita, la sonda a la repetición de satélite de par de bases Drosophila Melanogaster 359 reconoció un gran bloque de pares de megabases en el cromosoma x y una región mucho más pequeña en el cromosoma tres. Una sonda más larga contra el satélite de respuesta detectó bloques de repetición que consisten en un número relativamente bajo de copias repetidas, de unas 700. Por lo tanto, este método permite la visualización de bloques de satélite muy pequeños.

Cuando el paso de tratamiento con solución hipotónica se duplicó en duración a 10 minutos, la separación de las cromátidas hermanas aumentó hacia el este. Este procedimiento se puede combinar con otros métodos, como la tinción de anticuerpos, para responder a preguntas como si se localizaran ciertas proteínas de la cromatina en secuencias específicas.