Name: Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a evaluar la traducción selectiva de ARNm en células de mamífero mediante perfiles de polisomas. Este protocolo utiliza ultracentrifugación en gradiente de sacarosa para identificar ARNm altamente traducidos bajo estrés.

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Agradecemos a los miembros pasados y presentes del laboratorio, en particular a Urszula Liwak, por la discusión crítica sobre los protocolos de perfilado de polisomas y el intercambio de datos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Sociedad de Investigación del Cáncer y el Consejo Nacional de Investigación en Ciencia e Ingeniería de Canadá para MH. MDF contó con el apoyo del Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award y la Ontario Graduate Scholarship, y este trabajo forma parte de su tesis doctoral.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Perfilado polysomal es una técnica poderosa que permite la cuantificación del estado de la traducción de las transcripciones específicas bajo diferentes condiciones de tratamiento. Es una técnica muy sencilla, en principio, sin embargo, requiere varios pasos de ejecución, algunos de los cuales son críticos para la producción de buenos perfiles de polisomas. Estos pasos clave son: 1) el uso de productos químicos de RNasa libre y utensilios de plástico, 2) la preparación de buenos gradientes de sacarosa (en nuestra experiencia de un 10-50% gradientes de sacarosa funcionan mejor para resolver de manera eficiente 40 / 60S subunidades y los ARNm con los ribosomas unidos), y 3 ) utilizando células que están creciendo de manera exponencial y no más del 80% de confluencia con el fin de capturar las tasas más altas de traducción. Este último paso debe ser tenido en cuenta a la hora de hacer los tratamientos con células largas, como la caída de genes o sobreexpresión, por lo que la cantidad de células a la placa estará en función de cuánto serán las células confluentes en el punto final. En los resultados presented aquí, polisomas análisis del perfil era un instrumento importante para evaluar el papel PDCD4 en la regulación de la traducción de los IRES-albergan los ARNm de XIAP y Bcl-XL 12. El hecho de que no se observó ningún cambio en los perfiles de polisomas generales sobre PDCD4 knock-down (Figura 1B) permitió concluir que PDCD4 no perjudicó la traducción celular global bajo las condiciones del experimento. A continuación utiliza el análisis de RT-qPCR para determinar la distribución de la XIAP y Bcl-xL mRNAs en células tratadas con siRNAs PDCD4 o de control. qPCR es un método de elección para el análisis de perfiles de polisomas, en contraposición a la norma RT-PCR o transferencia de Northern, ya que permite una cuantitativa en lugar de análisis semi-cuantitativo de la distribución de ARNm y para la detección de cambios sutiles en la eficiencia de traducción entre los tratamientos. Usando esta técnica, hemos sido capaces de demostrar que la distribución de los XIAP y Bcl-XL ARNm (expresado como un porcentaje del total de ARNm diana a través de la gradient) se cambió significativamente en polirribosomas pesados ​​(mRNAs con un gran número de ribosomas asociados con ellos) después PDCD4 ronda hacia abajo (Figura 1D, E), lo que indica un aumento en la traducción de estos mRNAs. Esto se confirmó además por un incremento en XIAP y Bcl-XL niveles de proteína, pero no en sus niveles de ARN de estado estable (Figura 1F, G). Es importante destacar que la distribución de polisomas de la variante no IRES de XIAP permaneció sin cambios entre las células tratadas y no tratadas (Figura 1C). Alternativamente, la eficiencia de traducción podría ser presentado como una relación de contenido de ARNm en polisomas (normalmente fracciones 5 a 10) versus monosomas (normalmente fracciones 2 a 4) 14. El uso de los controles en el protocolo es importante en la validación de perfiles de polisomas cualquier resultado, como picos observados a partir de las lecturas de absorbancia a 254 nm no pueden por sí mismos ser atribuidos a ARN ribosomal (detergentes, tales como Triton X-100 absorben fuertemente en esta región del espectro y puede oscurecer 40 / 60S picos en la parte superior del gradiente). Gradientes blanco sin lisado y / o con tampón de lisado deben ejecutarse para determinar la contribución relativa de los tampones para la absorbancia a 254 nm. Artefactual estructuras de orden superior también pueden dar lugar a interpretaciones erróneas de polisomas en los que hay, de hecho, ninguno (por ejemplo, &quot;pseudo-polisomas&quot; 20). Secuestrantes de magnesio (utilizado durante todo el procedimiento para estabilizar los ribosomas 80S) con el EDTA quelante de cationes divalentes añadidos a los lisados ​​y al tampón de gradiente (20 mM durante 15 min) hará que la separación del ribosoma en sus pequeños componentes (40S) y grandes (60S subunidades). Por lo tanto, si picos de absorbancia registrados a 260 nm son de hecho polisomas, el tratamiento EDTA colapsará el perfil tal que se observó un único máximo cerca de la parte superior del gradiente que corresponde a liberar el ARNm y las unidades ribosómicas (datos no presentados). Coincidentecon el colapso inducido por EDTA-del perfil, todos los objetivos específicos analizados por qPCR ahora debería hallarse en la parte superior del gradiente. El número de ribosomas asociados con un mRNA no siempre es un indicador de la eficiencia con la que en particular mRNA se está traduciendo. De hecho, hay contextos específicos en los que la traducción activa en polisomas convierte estancó 21,22 que el lector debe tener en cuenta. La determinación de si o no las transcripciones se dedican activamente con la maquinaria de traducción se puede hacer por a) tratar la muestra con puromicina, que a diferencia de EDTA, provoca &#39;run-off&#39; de los ribosomas que se translocación activamente a través de un ARNm, o b) tratar la muestra con homoharringtonina que inhibe la translocación de sólo el primer ribosoma al codón de inicio, de nuevo causando &#39;escorrentía&#39; de cualquier ribosomas de translocación aguas abajo. El uso de las transcripciones de control para el análisis de qPCR también es crítica. La selección de las transcripciones que no se ve afectada por diferentes condiciones de tratamiento tales como algunos genes de limpieza (GAPDH, actina, tubulina, nucleolina), ARNm ribosómicos (18S, Rpl13a) o en este caso la variante no IRES de la XIAP IRES, es importante en verificar si el efecto del tratamiento sobre la traducción es específica o generalizada. Estas transcripciones de control pueden utilizarse para normalizar la distribución de los mRNAs analizados como se ha hecho aquí (XIAP y Bcl-XL ARNm se normalizaron a GAPDH mRNA y se expresó como un porcentaje del contenido total de ARNm representado por la suma de contenido de mRNA en cada fracción ) o, alternativamente, objetivo y de control mRNAs pueden expresarse como valores absolutos y se muestran por separado. análisis qPCR de los lisados ​​de entrada (por lo general el 10% del volumen total) es otro paso que va a controlar la distribución de los ARNm específicos. Idealmente, el contenido de mRNA de una transcripción específica en el lisado de entrada debe ser comparable a la suma de contenido de mRNA en todas las 10 fracciones analizadas. Finalmente, Un paso opcional para controlar el fenol: cloroformo etapa de extracción es a pico cada fracción polisomas con un ARNm reportero transcrito in vitro (tal como el CAT, cloranfenicol acetil transferasa) que será posteriormente cuantificada por qPCR, e incluso se puede utilizar para normalizar la datos 14. Como con cualquier técnica, la elaboración de perfiles de polisomas presenta algunas limitaciones. El hecho de que por lo general un mínimo de 10 fracciones (cambios más sutiles en la eficiencia de la traducción puede requerir 20 o más) necesitan ser recogidos con el fin de tener distribuciones de polisomas agradables hace que este paso limitativo, en el sentido de que sólo un máximo de 4 muestras puede ser analizada en un momento en que sea capaz de manejar cómodamente la extracción de RNA y análisis qPCR de 40 muestras y controles de entrada 4 a la vez. El tamaño de la muestra se puede añadir fácilmente hasta con el número de transcripciones deben ser analizados y cuántos qPCR replica que hacer, y esto puede ser costoso. Otra de las limitaciones de un polysomal perfilado un qPCR basado ennálisis es que sólo se puede hacer en un enfoque basado en la candidato (donde las transcripciones a ser analizados son conocidos de antemano) y no se pueden aplicar para el análisis de todo el genoma de la traducción. Sin embargo, a principios del siglo 21, los investigadores comenzaron a interrogar a su ARN polysomal a nivel genómico utilizando microarrays de ADN 15 y, más recientemente, con la secuenciación de próxima generación 16,17. En este enfoque de gran alcance, se realiza perfiles polysomal como se describe en este protocolo, salvo que en lugar de realizar un análisis qPCR de fracciones individuales, monosomas fracciones (por lo general de fracciones 2-4) y polisomas fracciones (normalmente fracciones) están agrupados juntos y variaciones en la traducción mundial analizados por microarrays de ADN o secuenciación de todo el genoma de ARN. De ahí que con este enfoque, es posible evaluar todos los ARNm cuya distribución turnos de polisomas a monosomas (disminución de la traducción) o viceversa (aumento en la traducción) a un tratamiento específicoción. Validación y cuantificación de la distribución específica de ARNm de los polisomas se pueden entonces ser realizadas por qPCR. Un uso aún más poderosa del principio de perfiles polysomal es perfilado ribosoma. Además extensión de alto rendimiento de esta técnica se informó recientemente de que permite la monitorización simultánea de cientos de polisomas fracciones 23. Esto proporciona una clara ventaja cuando sondeo eficiencias traduccionales de las colecciones de mutantes o en un RNAi pantallas de gran escala. Perfilado ribosoma es una técnica que se aprovecha de la secuenciación de próxima generación para mapear fragmentos de ARN protegidos por los ribosomas (huellas ribosoma) que participan en la síntesis de proteínas 24,25. En esta técnica, la translocación del ribosoma puede ser inhibida con cicloheximida (reversible) o emetina (irreversible) seguido por la lisis celular y la digestión de RNasa para producir una población de huellas ribosoma. Los ribosomas se enriquecen, el ARN total se aísla, y se elimina la contaminación ribosomal y el ARN ribosomal mitocondrial.Huellas de ARN de aproximadamente 26-28 nucleótidos son aislados, transcripción inversa, convertida en una biblioteca de cDNA y se secuenciaron 26. A diferencia de perfiles de polisomas estándar, este enfoque no sólo identifica mRNAs específicos que son regulados en traslación, sino también produce información ARNm específico a una resolución de codón tales como la ocupación exacta y la densidad de los ribosomas a lo largo de una transcripción específica. Esto es particularmente de interés para los ARNm con modos específicos de traducción, tales como ARNm IRES-albergan, ya que podría dar más información sobre el lugar en la transcripción del ribosoma-reclutamiento que está ocurriendo.

Regulación de la síntesis de proteínas (traducción) es un proceso celular clave que está íntimamente ligada a la supervivencia celular. Dado que la traducción consume más del 50% de la energía de la célula, no es sorprendente que la traducción está estrechamente regulada y que las perturbaciones en la traducción no se toleran bien. Por el contrario, muchos procesos celulares aberrantes que requieren maquinaria de traducción y la salida de la traducción (es decir proteoma) tienen que ser modificados. Esto es a menudo el caso en varios estados de respuesta al estrés y la enfermedad, y es, probablemente, el mejor ejemplo en el cáncer. Una ventaja clave de control de la traducción es la capacidad de las células para reprogramar rápidamente la salida de proteínas en respuesta a diversos disparadores externos e internos, por lo tanto mecanismo de ajuste fino que inclina la balanza entre la supervivencia celular y la muerte 1. Dos aspectos de la traducción de control son particularmente interesantes; comprensión de la naturaleza de la mec reguladorahanism (s) y elementos de control que permiten la traducción específica, y la identificación de mRNAs específicos y sus productos de proteínas que participan en la respuesta celular al gatillo particular que provocó traducción selectiva en el primer lugar. Perfiles de polisomas es una técnica que permite el estudio eficaz de ambos procesos. El objetivo general de la técnica de perfiles de polisomas es estudiar y cuantificar el estado de la traducción de ARNm específicos bajo diferentes condiciones celulares. El principio de la técnica es captar la traducción del ARNm por &#39;&#39; congelación &#39;&#39; Traducción activamente ribosomas en diferentes transcripciones y separar los polirribosomas resultantes por ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa, permitiendo así una distinción entre las transcripciones altamente traducidas (obligado por varios ribosomas) y los mal traducido (unida por uno o dos ribosomas). En este protocolo particular, el antibiótico cicloheximida que se une a la60S subunidad ribosomal y bloquea la liberación de desacetilada tRNA del sitio E ribosoma 2, se utiliza para inhibir la translocación del ribosoma y estancar los ribosomas ARNm de traducción. Sin embargo, otros agentes de bloqueo tales como emetina que también bloquea la traducción de elongación 3, puede ser utilizado. A diferencia de la transferencia de western y 35 S-metionina técnicas de etiquetado que miden la salida final del proceso de traducción, polisomas perfilado tiene la ventaja de medir los ribosomas asociación con mRNAs activamente traducidas, permitiendo así un estudio más detallado de los mecanismos de traducción en condiciones diferentes. Por lo tanto, la técnica se puede adaptar fácilmente para estudiar específicamente los diferentes modos de traducción 4-6, proteínas factores involucrados en la regulación de la traducción 7-9, condiciones de estrés que afectan a la síntesis de proteínas 1,10,11 o los efectos de las estructuras de ARNm tales como IRES o aguas arriba marcos de lectura abiertos en sintetizador de proteínasESIS 12-14. Hoy en día, polisoma aplicaciones de perfiles son aún más amplia con el uso de microarrays de DNA 15 o secuenciación de próxima generación 16,17 analizar polisomas asociados-ARNm.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 máquina de gradiente automatizada</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow máquina de gradiente de dos cámaras</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrífuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modelo # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Fraccionador de gradiente de densidad</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Compuesto por: sistema de perforación de tubos, bomba peristáltica, detector UA-6 con filtros de 254 y 280 nm y colector de fracciones Foxy R1</td></tr><tr><td>Software de adquisición de datos WINDAQ</td><td>INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmTubos de ultracentrífuga Pollyallomer (para SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 2 ml sin nucleasas (nariz de delfín)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 2 ml sin nucleasas (fondo plano)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa (sin nucleasas)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342,3 g/mol</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281,4 g/mol. Vuelva a suspender en DMSO y manténgalo a -80 °C durante el almacenamiento a largo plazo. Precaución: ¡TÓXICO! Puede causar tracto respiratorio e irritación de la piel. Use mascarilla al pesarse.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (sin nucleasas)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58,44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2,6H2O (sin nucleasas)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203,3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (sin nucleasas)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Atención: ¡TÓXICO! Puede causar tracto respiratorio e irritación de la piel</td></tr><tr><td>Inhibidor recombinante de RNasina ribonucleasa</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>Solución de inactivación de RNaseZap Rnasa</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitante (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Ácido-fenol:Cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Precaución: ¡TÓXICO! Puede causar irritación de las vías respiratorias, así como irritación de la piel y corrosión</td></tr></tbody></table>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulación de la síntesis de proteínas representa un punto de control clave en la respuesta celular al estrés. En particular, los elementos reguladores de ARN discreto se muestran para permitir a la traducción selectiva de mRNAs específicos, que típicamente codifican para las proteínas requeridas para una respuesta de estrés particular. La identificación de estos mRNAs, así como la caracterización de los mecanismos reguladores responsables de la traducción selectiva ha estado en la vanguardia de la biología molecular durante algún tiempo. Perfiles de polisomas es un método piedra angular en estos estudios. El objetivo de los perfiles de polisomas es capturar la traducción del ARNm mediante la inmovilización de los ribosomas traducen activamente en diferentes transcripciones y separar los polirribosomas resultantes por ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa, lo que permite una distinción entre las transcripciones altamente traducidos y mal traducido queridos. Estos pueden ser caracterizados adicionalmente por métodos tradicionales bioquímicos y de biología molecular. Es importante destacar que la combinación de polysome perfiles con enfoques genómicos de alto rendimiento permite un análisis a gran escala de la regulación de traducción.

Recientemente hemos descrito un nuevo papel para el supresor de tumor PDCD4 como un inhibidor de la traducción selectiva de mRNAs que codifican inhibidores apoptóticos XIAP y Bcl-xL IRES-12 que alberga. Perfiles de polisomas era una técnica clave para demostrar la participación específica de PDCD4 en la traducción mediada por IRES-. Células HEK293 se transfectaron transitoriamente para agotar los niveles endógenos de PDCD4 (Figura 1A) y después se sometieron a análisis del perfil de polisomas. Hemos observado que la reducción de los niveles de PDCD4 no afectó la traducción celular global, a juzgar por la falta de cambios en el perfil de polisomas cuando se comparan siCTRL y siPDCD4 células tratadas (Figura 1B). Del mismo modo, polisomas distribución de variante no IRES de XIAP 19 se mantuvo sin cambios entre las células tratadas y no tratadas (Figura 1C). En contraste, polisoma distribución de los ARNm dos IRES-albergan, XIAP y Bcl-XL, se modificó significativamente. En ausencia de PDCD4 la distribución de estas dos mRNAs se desplaza en ribopolysomes pesados ​​(Figura 1D, E). Como esto no se acompaña de cambios en los niveles de estado estacionario de XIAP y Bcl-XL de mRNA (Figura 1F) Estos resultados demuestran una mayor traducción de XIAP y Bcl-XL en células con niveles reducidos PDCD4, que fue confirmado por Western Blot (Figura 1G). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Perfiles de polisomas PDCD4 identifica como inhibidor selectivo de la traducción XIAP y Bcl-xL (A) HEK293 células fueron tratadas con PDCD4 siRNA o control (CTRL), no la orientación siRNA, se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia de Western con anti-PDCD4 y anticuerpos antinucleolina para verificar el grado de PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 fue derribado como en (A) ylisados ​​celulares se sometieron a polisomas perfilado. Polisomas perfil representativo se muestra en el panel superior; distribución de la XIAP no IRES (C), Bcl-XL (D), y XIAP IRES (E) mRNAs relativos a la de GAPDH se muestra como el porcentaje de mRNA total (% ARNm) en cada fracción. (F) Steady los niveles de mRNA -Estado se midieron por RT-qPCR en PDCD4 siRNA o control (CTRL) siRNA células tratadas. (G) Los lisados ​​de (A) también se sometieron a análisis de Western blot con anti-XIAP, anti-Bcl-xL, y anticuerpos anti-nucleolina. (NB. Los datos presentados en la Figura 1 se publicaron originalmente en 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en distinguir entre ARNm altamente traducidos y poco traducidos mediante la inmovilización y separación de polirribosomas. Esto se logra primero añadiendo cicloheximida a las células para inhibir la translocación del ribosoma y la traducción del ARN. Como segundo paso, se cargan lisados de las células tratadas sobre un gradiente de sacarosa y se ultracentrifugan para separar los polirribosomas almacenados según sus masas. A continuación, el gradiente se divide en fracciones iguales para separar los transcritos altamente y pobremente traducidos en la etapa final. Se utiliza R-T-Q-P-C-R para detectar la presencia de los ARNm de interés dentro de cada fracción. En última instancia, el perfilado de ribosomas puede utilizarse para detectar cambios en la traducción global así como en la traducción específica de ARNm en respuesta a distintos tipos de estrés fisiológicos y patofisiológicos.El perfilado PolyOne puede responder preguntas clave en los campos de biología molecular y celular, como qué ARNm se seleccionan y traducen durante el estrés por S, y cómo esto permite a las células adaptarse a estas condiciones. Para demostrar este procedimiento, la madre de un estudiante de posgrado en el laboratorio utiliza un generador automático de gradientes para preparar un gradiente de sacarosa; comience encendiendo el generador de gradientes y nivelando la placa que sostendrá los gradientes. Una vez nivelada la placa, haga clic en finalizar.Luego, para seleccionar el programa de gradiente, abra el menú grad y seleccione lista. Haga clic en SW 41 y desplácese por la lista hasta que aparezca el programa de gradiente del 10 al 50 % en 11 pasos y presione Usar. A continuación, coloque un tubo cónico de ultracentrífuga SW 41 en el bloque marcador y utilice el marcador de tubo fino proporcionado para trazar una línea en el tubo siguiendo el escalón superior del bloque.Coloque los tubos en un soporte adecuado sobre una superficie estable y luego fije las dos cánulas suministradas a dos jeringas de 10 mililitros. Aspire y expulse varias veces agua destilada tibia que contenga ARN en solución de activación para lavar las jeringas. Luego, tras eliminar todos los rastros de agua, llene una de las jeringas con sacarosa al 10% más cicloheida y inserte la cánula en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga.Dispense suavemente la solución hasta que sobrepase ligeramente la marca hecha en el tubo. Tenga cuidado de evitar burbujas. Luego, llene la otra jeringa con sacarosa al 50% más cyclo heide, y limpie cualquier líquido adicional del tubo con una toallita.Utilice la cánula para insertar suavemente la solución de sacarosa al 50 % en el tubo, deteniéndose cuando la solución alcance el nivel de la marca, y luego retire rápidamente y con suavidad la cánula. La solución de sacarosa al 10 % debe ascender formando un menisco en la parte superior del tubo. A continuación, incline ligeramente el tubo del ultracentrífugo para desplazar cualquier burbuja de aire e inserte la tapa utilizando una micropipeta para eliminar cualquier líquido excesivo en el depósito de la tapa.Coloque los tubos en el mezclador de gradiente y luego presione el botón de ejecución. Tenga en cuenta que la placa se inclinará al ángulo especificado. Pausa durante cinco segundos, y luego comenzarán las rotaciones para formar el gradiente.Después de aproximadamente dos minutos, la máquina emitirá un sonido que indica que la formación del gradiente ha finalizado. Transfiera suavemente los tubos a un portatubos y retire rápidamente las tapas en un solo movimiento ascendente para evitar perturbar el gradiente. Luego, cargue cuidadosamente una unidad de absorbancia a 260 nm de lisado celular previamente preparado, en cada gradiente de sacarosa, y centrifugue los tubos durante una hora y media a 260.343 ×g y 4 grados Celsius en una ultracentrífuga.Para configurar el instrumento del sistema de fraccionamiento en gradiente, comience por encender el espectrofotómetro. A continuación, haga clic dos veces en el icono de carpeta y luego dos veces en la flecha de retorno para regresar a la pantalla de inicio y configurar el colector de fracciones en el método PolyZone, asegurándose de que la válvula del colector de fracciones esté dirigida al desecho. Haga clic en la flecha que apunta al icono del bote de basura y luego coloque un matraz MIA de 250 mililitros que contenga agua destilada debajo del tubo de recolección de desechos.Ahora seleccione la siguiente configuración en el registrador de gráficos: el dial de sensibilidad para ajustar la lámpara y la óptica, el filtro de ruido. Cambie a 1,5 el dial separador de picos a apagado, la velocidad del gráfico, el dial a 30 centímetros por hora y la línea base, y ajuste el dial en la parte superior de la unidad de espectrofotómetro a apertura máxima. Luego coloque la jeringa y el cilindro en la bomba y utilice los tornillos y la llave Allen proporcionados para asegurarla en su lugar.Utilice el comando rev a alta velocidad para llenar la jeringa con la solución de lavado. Luego, coloque la bomba en posición vertical y use el comando forward para expulsar el aire a través del tubo. A continuación, instale un tubo de ultracentrífuga lleno con agua libre de ARN en el soporte y luego atraviese el tubo con la cánula hasta que sean visibles las dos marcas negras.El orificio de dispensación se encuentra entre las dos marcas. Inicie la bomba de jeringa en modo manual hacia adelante a 6,0 mililitros por minuto. Cuando la solución de lavado llene un tercio del tubo, cambie a la velocidad variable con un caudal de 1,0 mililitro por minuto.Ahora gire el dial de ajuste de la línea base en el espectrofotómetro hasta que el voltaje en la gráfica sea cero. El agua comenzará a salir por el tubo de desecho hacia el matraz el Mya. Luego, establezca la sensibilidad deseada en 1,0 au.Una vez ajustada la sensibilidad, presione también el botón de línea base y gire el mando de desplazamiento del registrador para ajustar la configuración de la línea base al 10 % en el registrador de gráficos. Luego, cuando se alcance una línea base estable, gire el interruptor de la bomba y el mando de velocidad del gráfico a la posición de apagado. Una vez que la bomba esté apagada, colóquela en la posición de reversa para recuperar la solución de seguimiento hasta que alcance la primera marca en la cánula de perforación.Luego, retire el tubo de centrífuga, disperse las burbujas en la cánula con un poco de solución de lavado y limpie cualquier residuo de agua que pueda haberse filtrado desde la celda de flujo para fraccionar el gradiente. A continuación, instale el tubo de centrífuga que contiene el gradiente de sacarosa en el soporte y perfore el tubo con la cánula. Después, coloque diez tubos microcentrífuga de dos mililitros en las posiciones dos a once de la bandeja del colector de fracciones y un tubo de desecho en la posición uno, de modo que las tapas no sobresalgan hacia arriba.Coloque el dial de control de la bomba en manual y ajuste el caudal en la bomba de jeringa a 6,0 mililitros por minuto. Luego, presione reproducir en el colector de fracciones tan pronto como el brazo alcance el primer tubo. Presione el botón de pausa para posicionar el brazo y abrir la válvula de dispensación de fracciones.Luego, use el comando de avance para iniciar la bomba y monitorear la pluma del registrador gráfico. Cuando la pluma comience a desviarse hacia arriba, indicando que la muestra está pasando a través de la celda de flujo, reemplace rápidamente el tubo de desecho con el tubo número uno. A continuación, cuando se recoja la primera gota, cambie rápidamente los comandos a inicio remoto, detención y flujo variable de 1,0 mililitros por minuto, y presione reproducir para permitir que la interfaz del colector de fracciones recoja fracciones de un mililitro cada minuto.Finalmente, después de que la solución azul entre en el último tubo, presione detener. El perfilado PolyZone es una técnica clave para demostrar la participación específica de PD CD4 en la traducción mediada por IRAs. Por ejemplo, en este experimento, las células HEC 2 93 se transfectaron transitoriamente para agotar los niveles endógenos de PDC D cuatro y luego se sometieron a análisis de perfilado PolyZone.La reducción de los niveles de PDC D cuatro no afectó la traducción global del gen, según lo indicado por la ausencia de cambios en el perfil de PolyZone. Al comparar las células control SI y las células tratadas con IPD CD cuatro, la distribución de polisomas de una variante no IRAs de XIAP no cambió entre las células tratadas y no tratadas. En contraste, la distribución de polisomas de los dos ARNm que albergan IS, XIAP y BCL XL, se alteró significativamente.En ausencia de PD CD4, la distribución de estos dos ARNm se desplazó hacia los ribosomas pesados. Dado que esto no va acompañado de cambios en los niveles en estado estacionario de los ARNm de XIAP y BCL XL, estos resultados demuestran la traducción potenciada de XIAP y BCL XL en células con niveles reducidos de PDC D cuatro, tal como se confirmó adicionalmente mediante Western blossoming. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo medir la traducción del ARNm mediante la preparación de la región de sacarosa y la separación de los polisomas por ultracentrifugación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

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La Purificación de Afinidad de Ribosoma Traductora (TRAP) es capaz de capturar la traducción específica del tipo de célula del ARNm. Aquí informamos sobre el primer protocolo TRAP dedicado al aislamiento de ARNm en poblaciones celulares raras de embriones de Drosophila.

TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

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El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

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Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Aprende a evaluar la traducción selectiva de ARNm en células de mamífero mediante perfiles de polisomas. Este protocolo utiliza ultracentrifugación en gradiente de sacarosa para identificar ARNm altamente traducidos bajo estrés.

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