Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

El objetivo general del siguiente experimento consiste en distinguir entre ARNm altamente traducidos y poco traducidos mediante la inmovilización y separación de polirribosomas. Esto se logra primero añadiendo cicloheximida a las células para inhibir la translocación del ribosoma y la traducción del ARN. Como segundo paso, se cargan lisados de las células tratadas sobre un gradiente de sacarosa y se ultracentrifugan para separar los polirribosomas almacenados según sus masas.

A continuación, el gradiente se divide en fracciones iguales para separar los transcritos altamente y pobremente traducidos en la etapa final. Se utiliza R-T-Q-P-C-R para detectar la presencia de los ARNm de interés dentro de cada fracción. En última instancia, el perfilado de ribosomas puede utilizarse para detectar cambios en la traducción global así como en la traducción específica de ARNm en respuesta a distintos tipos de estrés fisiológicos y patofisiológicos.

El perfilado PolyOne puede responder preguntas clave en los campos de biología molecular y celular, como qué ARNm se seleccionan y traducen durante el estrés por S, y cómo esto permite a las células adaptarse a estas condiciones. Para demostrar este procedimiento, la madre de un estudiante de posgrado en el laboratorio utiliza un generador automático de gradientes para preparar un gradiente de sacarosa; comience encendiendo el generador de gradientes y nivelando la placa que sostendrá los gradientes. Una vez nivelada la placa, haga clic en finalizar.

Luego, para seleccionar el programa de gradiente, abra el menú grad y seleccione lista. Haga clic en SW 41 y desplácese por la lista hasta que aparezca el programa de gradiente del 10 al 50 % en 11 pasos y presione Usar. A continuación, coloque un tubo cónico de ultracentrífuga SW 41 en el bloque marcador y utilice el marcador de tubo fino proporcionado para trazar una línea en el tubo siguiendo el escalón superior del bloque.

Coloque los tubos en un soporte adecuado sobre una superficie estable y luego fije las dos cánulas suministradas a dos jeringas de 10 mililitros. Aspire y expulse varias veces agua destilada tibia que contenga ARN en solución de activación para lavar las jeringas. Luego, tras eliminar todos los rastros de agua, llene una de las jeringas con sacarosa al 10% más cicloheida y inserte la cánula en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga.

Dispense suavemente la solución hasta que sobrepase ligeramente la marca hecha en el tubo. Tenga cuidado de evitar burbujas. Luego, llene la otra jeringa con sacarosa al 50% más cyclo heide, y limpie cualquier líquido adicional del tubo con una toallita.

Utilice la cánula para insertar suavemente la solución de sacarosa al 50 % en el tubo, deteniéndose cuando la solución alcance el nivel de la marca, y luego retire rápidamente y con suavidad la cánula. La solución de sacarosa al 10 % debe ascender formando un menisco en la parte superior del tubo. A continuación, incline ligeramente el tubo del ultracentrífugo para desplazar cualquier burbuja de aire e inserte la tapa utilizando una micropipeta para eliminar cualquier líquido excesivo en el depósito de la tapa.

Coloque los tubos en el mezclador de gradiente y luego presione el botón de ejecución. Tenga en cuenta que la placa se inclinará al ángulo especificado. Pausa durante cinco segundos, y luego comenzarán las rotaciones para formar el gradiente.

Después de aproximadamente dos minutos, la máquina emitirá un sonido que indica que la formación del gradiente ha finalizado. Transfiera suavemente los tubos a un portatubos y retire rápidamente las tapas en un solo movimiento ascendente para evitar perturbar el gradiente. Luego, cargue cuidadosamente una unidad de absorbancia a 260 nm de lisado celular previamente preparado, en cada gradiente de sacarosa, y centrifugue los tubos durante una hora y media a 260.343 ×g y 4 grados Celsius en una ultracentrífuga.

Para configurar el instrumento del sistema de fraccionamiento en gradiente, comience por encender el espectrofotómetro. A continuación, haga clic dos veces en el icono de carpeta y luego dos veces en la flecha de retorno para regresar a la pantalla de inicio y configurar el colector de fracciones en el método PolyZone, asegurándose de que la válvula del colector de fracciones esté dirigida al desecho. Haga clic en la flecha que apunta al icono del bote de basura y luego coloque un matraz MIA de 250 mililitros que contenga agua destilada debajo del tubo de recolección de desechos.

Ahora seleccione la siguiente configuración en el registrador de gráficos: el dial de sensibilidad para ajustar la lámpara y la óptica, el filtro de ruido. Cambie a 1,5 el dial separador de picos a apagado, la velocidad del gráfico, el dial a 30 centímetros por hora y la línea base, y ajuste el dial en la parte superior de la unidad de espectrofotómetro a apertura máxima. Luego coloque la jeringa y el cilindro en la bomba y utilice los tornillos y la llave Allen proporcionados para asegurarla en su lugar.

Utilice el comando rev a alta velocidad para llenar la jeringa con la solución de lavado. Luego, coloque la bomba en posición vertical y use el comando forward para expulsar el aire a través del tubo. A continuación, instale un tubo de ultracentrífuga lleno con agua libre de ARN en el soporte y luego atraviese el tubo con la cánula hasta que sean visibles las dos marcas negras.

El orificio de dispensación se encuentra entre las dos marcas. Inicie la bomba de jeringa en modo manual hacia adelante a 6,0 mililitros por minuto. Cuando la solución de lavado llene un tercio del tubo, cambie a la velocidad variable con un caudal de 1,0 mililitro por minuto.

Ahora gire el dial de ajuste de la línea base en el espectrofotómetro hasta que el voltaje en la gráfica sea cero. El agua comenzará a salir por el tubo de desecho hacia el matraz el Mya. Luego, establezca la sensibilidad deseada en 1,0 au.

Una vez ajustada la sensibilidad, presione también el botón de línea base y gire el mando de desplazamiento del registrador para ajustar la configuración de la línea base al 10 % en el registrador de gráficos. Luego, cuando se alcance una línea base estable, gire el interruptor de la bomba y el mando de velocidad del gráfico a la posición de apagado. Una vez que la bomba esté apagada, colóquela en la posición de reversa para recuperar la solución de seguimiento hasta que alcance la primera marca en la cánula de perforación.

Luego, retire el tubo de centrífuga, disperse las burbujas en la cánula con un poco de solución de lavado y limpie cualquier residuo de agua que pueda haberse filtrado desde la celda de flujo para fraccionar el gradiente. A continuación, instale el tubo de centrífuga que contiene el gradiente de sacarosa en el soporte y perfore el tubo con la cánula. Después, coloque diez tubos microcentrífuga de dos mililitros en las posiciones dos a once de la bandeja del colector de fracciones y un tubo de desecho en la posición uno, de modo que las tapas no sobresalgan hacia arriba.

Coloque el dial de control de la bomba en manual y ajuste el caudal en la bomba de jeringa a 6,0 mililitros por minuto. Luego, presione reproducir en el colector de fracciones tan pronto como el brazo alcance el primer tubo. Presione el botón de pausa para posicionar el brazo y abrir la válvula de dispensación de fracciones.

Luego, use el comando de avance para iniciar la bomba y monitorear la pluma del registrador gráfico. Cuando la pluma comience a desviarse hacia arriba, indicando que la muestra está pasando a través de la celda de flujo, reemplace rápidamente el tubo de desecho con el tubo número uno. A continuación, cuando se recoja la primera gota, cambie rápidamente los comandos a inicio remoto, detención y flujo variable de 1,0 mililitros por minuto, y presione reproducir para permitir que la interfaz del colector de fracciones recoja fracciones de un mililitro cada minuto.

Finalmente, después de que la solución azul entre en el último tubo, presione detener. El perfilado PolyZone es una técnica clave para demostrar la participación específica de PD CD4 en la traducción mediada por IRAs. Por ejemplo, en este experimento, las células HEC 2 93 se transfectaron transitoriamente para agotar los niveles endógenos de PDC D cuatro y luego se sometieron a análisis de perfilado PolyZone.

La reducción de los niveles de PDC D cuatro no afectó la traducción global del gen, según lo indicado por la ausencia de cambios en el perfil de PolyZone. Al comparar las células control SI y las células tratadas con IPD CD cuatro, la distribución de polisomas de una variante no IRAs de XIAP no cambió entre las células tratadas y no tratadas. En contraste, la distribución de polisomas de los dos ARNm que albergan IS, XIAP y BCL XL, se alteró significativamente.

En ausencia de PD CD4, la distribución de estos dos ARNm se desplazó hacia los ribosomas pesados. Dado que esto no va acompañado de cambios en los niveles en estado estacionario de los ARNm de XIAP y BCL XL, estos resultados demuestran la traducción potenciada de XIAP y BCL XL en células con niveles reducidos de PDC D cuatro, tal como se confirmó adicionalmente mediante Western blossoming. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo medir la traducción del ARNm mediante la preparación de la región de sacarosa y la separación de los polisomas por ultracentrifugación.