Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

El objetivo general del siguiente experimento es distinguir entre ARNm altamente y mal traducidos mediante la inmovilización y separación de polirribosomas. Esto se logra primero agregando cicloheide a las células para inhibir su ribosoma, translocación y traducción de ARN. Como segundo paso, los lisados de las células tratadas se cargan en un gradiente de sacarosa y se ultracentrífugan para separar los polirribosomas almacenados según sus masas.

A continuación, el gradiente se divide en fracciones iguales para separar las transcripciones muy traducidas y mal traducidas en el paso final. R-T-Q-P-C-R se utiliza para detectar la presencia de los ARNm de interés dentro de cada fracción. En última instancia, el perfil de ribosomas se puede utilizar para detectar cambios en la traducción global y específica del ARNm en respuesta a distintas tensiones fisiológicas y fisiopatológicas.

El perfil de PolyOne puede responder a preguntas clave en los campos de la biología molecular y celular, como qué ARNm se seleccionan, se traducen durante el estrés S y cómo esto permite que las células se adapten a estas condiciones. Para demostrar este procedimiento, un estudiante de posgrado en el laboratorio puede utilizar un generador de degradado automatizado para preparar un gradiente de sacarosa, comience por encender el generador de degradados y nivelar la placa que sostendrá los gradientes cuando la placa esté nivelada. Haga clic en Listo.

Luego, para seleccionar el programa de degradado, abra el menú de graduados y seleccione lista. Haga clic en SW 41 y luego desplácese por la lista hasta que el programa de 10 a 50% de pendiente de 11 pasos esté a la vista y presione. Uso. A continuación, coloque un tubo de ultracentrífuga cónico SW 41 en el bloque marcador y utilice el marcador de tubo fino suministrado para trazar una línea en el tubo a lo largo del escalón superior del bloque.

Coloque los tubos en un soporte de montaje sobre una superficie estable y luego conecte las dos cánulas provistas a dos jeringas de 10 mililitros. Pipetear agua destilada tibia que contiene ARN en solución de activación hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar las jeringas. Luego, después de eliminar todos los restos de agua, llene una de las jeringas con 10% de sacarosa más cicloheide e inserte la cánula en el fondo del tubo de ultracentrífuga.

Dispense suavemente la solución hasta que pase justo por encima de la marca hecha en el tubo. Teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, llene la otra jeringa con un 50% de sacarosa más cyclo heide, y limpie el exceso de líquido del tubo con una toallita.

Utilice la cánula para insertar suavemente la solución de sacarosa al 50% en el tubo, deteniéndose cuando la solución esté al nivel de la marca y, a continuación, retire la cánula de forma rápida y suave. La solución de sacarosa al 10% debe elevarse para formar un menisco en la parte superior del tubo. A continuación, incline ligeramente el tubo de ultracentrífuga para desplazar las burbujas de aire e inserte el tapón con una micropipeta para eliminar el exceso de líquido en el depósito del tapón.

Coloque los tubos en el generador de degradados y luego presione el botón de ejecución. Tenga en cuenta que la placa se inclinará en el ángulo especificado. Haga una pausa de cinco segundos y luego comenzarán las rotaciones para formar el degradado.

Después de unos dos minutos, la máquina emitirá un pitido que indica que la formación del gradiente se ha completado. Transfiera suavemente los tubos a una rejilla y retire rápidamente las tapas con un movimiento ascendente para evitar perturbar el gradiente. A continuación, cargue suavemente 260 unidades de lisado celular previamente preparado en cada gradiente de sacarosa, y haga girar los tubos durante una hora y media a 260, 343 veces G y cuatro grados Celsius en una ultracentrífuga.

Para configurar el instrumento del sistema de fraccionamiento de gradiente, comience por encender el espectrofotómetro. A continuación, elija el icono de la carpeta dos veces y luego la flecha de retorno dos veces para volver a la pantalla de inicio y configurar el colector de fracciones en el método PolyZone para asegurarse de que la válvula del colector de fracciones esté configurada como desperdicio. Haga clic en la flecha que apunta al icono de la papelera y luego coloque un matraz MIA de 250 mililitros que contiene agua destilada debajo del tubo de recolección de residuos.

Ahora seleccione los siguientes ajustes en el registrador de gráficos, el dial de sensibilidad para configurar la lámpara y la óptica, el filtro de ruido. Cambie a 1.5 el dial del separador de picos a la velocidad fuera de la carta, marque a 30 centímetros por hora y la línea de base y ajuste el dial en la parte superior de la unidad de espectrofotómetro a la apertura máxima. A continuación, coloque la jeringa y el cilindro en la bomba y utilice los tornillos suministrados y la llave Alan para apretarla en su lugar.

Use el comando de revoluciones a velocidad rápida para llenar la jeringa con solución de persecución. Luego coloque la bomba en posición vertical y use el comando de avance para perseguir el aire a través del tubo. A continuación, instale un tubo de ultracentrífuga lleno de agua libre de ARN en el soporte y, a continuación, perfore el tubo con la cánula hasta que las dos marcas negras sean visibles.

El orificio dispensador está entre las dos marcas. Ponga en marcha la bomba de jeringa en manual avanzado a 6,0 mililitros por minuto. Cuando la solución de persecución llene un tercio del tubo, cambie a la velocidad a variable con un caudal de 1,0 mililitros por minuto.

Ahora gire el dial de ajuste de línea de base en el espectrofotómetro hasta que el voltaje en el gráfico esté en cero. El agua comenzará a salir del tubo de desagüe hacia el matraz el Mya. A continuación, ajuste la sensibilidad deseada a 1,0 au.

Cuando se haya ajustado la sensibilidad, presione el botón también de línea de base y gire el dial de desplazamiento de la grabadora para ajustar la configuración de línea de base a la marca del 10% en la grabadora de gráficos. Luego, una vez que se logre la línea de base estable, gire el interruptor de la bomba y el dial de velocidad de la tabla a la posición de apagado. Una vez que la bomba esté apagada, cámbiela a la posición de revoluciones para recuperar la solución de persecución hasta que alcance la primera marca en la cánula perforante.

A continuación, retire el tubo de centrífuga, disperse las burbujas de la cánula con un poco de solución de persecución y limpie el agua residual que pueda haberse filtrado de la celda de flujo para fraccionar el gradiente. A continuación, instale el tubo de centrífuga que contiene el gradiente de sacarosa en el soporte y perfore el tubo con la cánula. A continuación, coloque diez tubos de microcentrífuga de dos mililitros en las posiciones dos a 11 de la bandeja colectora de fracciones y un tubo de cintura en la posición uno, de modo que las tapas no sobresalgan hacia arriba.

Ajuste el dial de control de la bomba a manual y el caudal de la bomba de jeringa a 6,0 mililitros por minuto. A continuación, pulse el botón de reproducción en el colector de fracciones tan pronto como el brazo llegue al primer tubo. Presione el botón de pausa para colocar el brazo y abrir la válvula dosificadora de fracción.

A continuación, utilice el comando de avance para poner en marcha la bomba y controlar el lápiz registrador de gráficos. Cuando la pluma comience a desviarse hacia arriba, lo que indica que la muestra está pasando a través de la celda de flujo, reemplace rápidamente el tubo de desagüe con el tubo número uno. Luego, cuando se recoja la primera gota, cambie rápidamente los comandos a inicio remoto, parada y 1.0 mililitros por minuto variables y presione reproducir para permitir que la interfaz del colector de fracciones recoja fracciones de un mililitro cada minuto.

Finalmente, después de que la solución de persecución azul ingrese al último tubo, presione detener. El perfilado de PolyZone es una técnica clave para demostrar la participación específica de PD CD4 en la traducción mediada por IRAs. Por ejemplo, en este experimento, las células HEC 2 93 se transfectaron transitoriamente para agotar los niveles endógenos de PDC D 4, y luego se sometieron a un análisis de perfil PolyZone.

La reducción de los niveles de PDC D 4 no perjudicó la traducción global del gen, a juzgar por la falta de cambios en el perfil de PolyZone. Al comparar el control SI y el CD de IPD, cuatro células tratadas, la distribución de polisomas de una variante no IRAs de XIAP no cambió entre las células tratadas y las no tratadas. Por el contrario, la distribución de los polisomas de los dos ARNm que albergan XIAP y BCL XL se alteró significativamente.

En ausencia de PD CD4, la distribución de estos dos ARNm se desplazó a ribosomas pesados. Dado que esto no va acompañado de cambios en los niveles de estado estacionario del ARNm de XIAP y BCL XL, estos resultados demuestran la traducción mejorada de XIAP y BCL XL en células con niveles reducidos de PDC D cuatro veces, como lo confirma aún más el florecimiento occidental. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la traducción del ARNm mediante la preparación de la región de sacarosa y la separación de polisomas por ultracentrifugación.