La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

El objetivo general del siguiente experimento es introducir proteínas exógenas potencialmente citotóxicas, como efectores bacterianos, en las células de mamíferos para estudiar sus efectos y función. Esto se logra cultivando primero células de mamíferos a través de condiciones de cultivo estándar para obtener células similares a un huésped adecuadas en las que introducir la proteína purificada de interés. Como segundo paso, se lleva a cabo la electroporación de las células huésped cultivadas en presencia de un efector bacteriano purificado, lo que permite que la proteína ingrese e interactúe con las células huésped.

A continuación, se realiza la visualización o algún otro ensayo funcional con el fin de evaluar la localización subcelular y la funcionalidad de la proteína efectora. Los resultados basados en microscopía confocal, métodos inmunoquímicos u otras técnicas de análisis muestran la localización de los efectores bacterianos funcionales a sus ubicaciones subcelulares esperadas y la unión a sus socios de interacción conocidos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transección o la transducción, es que este protocolo es un enfoque rápido, sencillo y económico para superar la citotoxicidad potencial.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de patógenos, como el descubrimiento o la validación de las funciones de las proteínas efectoras bacterianas. Aunque este método se utilizó para proporcionar información sobre las proteínas efectoras bacterianas, también se puede aplicar a otras proteínas o moléculas pequeñas. Visualizar el resultado es fundamental.

Dado que la colocalización con características celulares conocidas, verifique la asociación subcelular esperada de la proteína electroporada para comenzar este procedimiento. Transfiera 400 microlitros de suspensión celular a un veta preenfriada. A continuación, añade 20 microgramos de proteína seleccionada para alcanzar una concentración final de 50 microgramos por mililitro.

Agite el veta suavemente unas 10 veces para mezclar y evitar dañar las células. Después de eso, seque el exterior del Q Vet con una toalla de papel para evitar arcos eléctricos en el electro. Coloque la muestra en el electro y ajústela a 0,3 kilovoltios durante 1,5 a 1,7 milisegundos inmediatamente después de la electroporación.

Agite el qve suavemente unas 10 veces para mezclar bien la muestra antes de proceder a la fijación y tinción inmunofluorescente o a la purificación por afinidad. Después de cuatro horas de recuperación de la electroporación, lave las células con PBS estéril. A continuación, fije las células en metanol al 100% durante dos minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente, lavar las células con PB S3 estéril más veces. Perme las células con 0.4%tritton X 100 en PBS durante 15 minutos. Ajuste la longitud de permeable y la resistencia de Triton X 100 de acuerdo con el epítopo y la ubicación de la proteína objetivo.

A continuación, bloquee las celdas con 5%BSA en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después. Lávelos tres veces con PBS. A continuación, incubarlos con el anticuerpo primario en la solución de unión al anticuerpo durante la noche a cuatro grados centígrados con un suave balanceo al día siguiente.

Lave las celdas cuatro veces más con PBS. A continuación, incubarlos con el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado en la solución de unión al anticuerpo. Agregue otras tinciones según sea necesario, como aglutinina de germen de trigo de cinco micromolares o WGA conjugado con Alexa 6 47 o DPI durante una hora a temperatura ambiente y protegido de la luz.

A continuación, lave las células con PBS cinco veces y guárdelas a cuatro grados centígrados, protegidas de la luz, hasta que estén listas para ser fotografiadas en este paso. Lave las celdas electroporadas dos veces con cuatro grados centígrados PBS. Después de cuatro horas de recuperación, pique las células con un mililitro de tampón de lisis en hielo.

Raspe rápidamente las celdas con un policía de goma y recójalas en los tubos cónicos. A continuación, pique las células mediante sonicación y vórtice vigoroso. A continuación, centrifuga la muestra 10.000 veces.

Gravedad durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para recoger los restos celulares y los agregados insolubles y salvar el sobrenadante. Combine un mililitro del lisado de células electroporadas clarificadas con 50 microlitros de strept en suspensión de resina aros. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche con rotación de extremo a extremo para capturar la proteína electroporada y los complejos asociados a través de la etiqueta de afinidad del péptido de unión strp havein.

Después de eso, centrifugar la muestra a 2.500 veces la gravedad durante dos minutos y desechar el sobrenadante. A continuación, lave la muestra dos veces con un mililitro de PBS. A continuación, agregue 30 microlitros de cuatro tampones de carga XLDS, 20 microlitros de H2O destilado y un microlitro de TCEP de 0,5 molar a la muestra, y deje un poco de sobrenadante.

Calentar la muestra a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Luego enfríelo sobre hielo durante aproximadamente un minuto. Posteriormente, centrifugar la muestra a 10.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Al final, recoja el sobrenadante para Western blot con los anticuerpos adecuados. Las células Hela se incubaron o se electroporaron con 50 microgramos por mililitro de un efector de salmonela marcado por afinidad, GTGE y se tiñeron con una etiqueta antiefectora anticuerpo dpi, una máscara nuclear y WGA Para delinear el límite citosólico, las células Hela incubadas muestran una ausencia de fluorescencia verde, lo que indica una falta de internalización de GTGE. Esta es una fotomicrografía representativa del GTG Electroporado, que muestra la proteína efectora electroporada intracelular mostrada.

Aquí está la transferencia occidental para detectar el compañero eucariota que interactúa seno de la proteína quinasa N uno. Tenga en cuenta que el carril del extremo derecho incluye dos cubetas agrupadas. La señal de un qve se mezcló con el fondo, sin embargo, pkn uno aún estaba enriquecida por encima de la falta de unión observada en el control sin cebo por microscopía confocal después de la electroporación con 50 microgramos por mililitro.

Las células S sph one hela muestran la colocalización entre pkn one y S SPH one. Esta superposición óptica indica que el efector y la proteína huésped están lo suficientemente cerca como para interactuar físicamente. El hecho de que la interacción se mostrara en el núcleo por primera vez ofrece un apoyo adicional de que la proteína fue traficada correctamente por el huésped.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar de una manera de alto rendimiento. Para estudiar múltiples proteínas individuales Al intentar este procedimiento, es importante recordar determinar empíricamente las mejores condiciones de electroporación para cada tipo de célula y proteína objetivo. Este procedimiento puede permitirle multiplexar con varias proteínas, moléculas pequeñas o una combinación de ambas para comprender mejor los procesos celulares en una variedad de sistemas modelo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se puede usar la electroporación para introducir macromoléculas como proteínas en células de mamíferos.