Name: La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a introducir proteínas efectoras bacterianas en células de mamífero mediante electroporación. Este método rápido permite estudiar la localización subcelular y la funcionalidad proteica con microscopía confocal.

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Este trabajo fue apoyado por NIGMS, Institutos Nacionales de Salud (GM094623). Parte importante de este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Ciencias Moleculares Ambientales, una instalación nacional de usuarios científicos del DOE/BER ubicada en el Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico (PNNL). PNNL es operado para el DOE por Battelle bajo el contrato DE-AC05-76RLO1830.

1. Prepárese por adelantado <ol><li> Cálido tampón fosfato salino (PBS) a 37 ° C. </li><li> Modificación caliente de Dulbecco de medio de Eagle (DMEM) y Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 IU / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina a 37 ° C. Nota: Estos representan Crecimiento Normal Media (NGM) para células RAW y HeLa, respectivamente. </li></ol> 2. Preparación de las células <ol><li> Se cultivan las células RAW 264.7 a 70-90% de confluencia en NGM. <ol><li> Mantener las células a 37 ° C en un 95% de aire / 5% de CO 2 atmósfera húmeda. </li></ol></li><li> Se cultivan las células HeLa a 70-90% de confluencia en NGM. <ol><li> Mantener las células a 37 ° C en un 95% de aire / 5% de CO 2 atmósfera húmeda. </li></ol></li><li> Antes de la recolección, lave monocapa de células una vez con PBS estéril. </li><li> Recoger las células pre-confluentes en un tubo cónico estéril. <ol><li> Raspar suavemente las células RAWcon un policía de caucho en PBS, con pipeteo repetido para dispersar agregaciones celulares. </li><li> Separar las células HeLa con solución de tripsina al 0,25% hasta que el examen visual muestra la disociación de la superficie de cultivo. Por ejemplo, utilizar 2 a 3 ml de un matraz T-75. Ajuste el volumen en consecuencia para garantizar solución de tripsina cubre toda la superficie de crecimiento. <ol><li> Se inactiva la reacción de disociación con NGM que contiene 10% de FBS. </li><li> Utilice al menos dos veces el volumen de NGM a la tripsina, con pipeteo repetido para dispersar agregaciones celulares. </li></ol></li></ol></li><li> Ligeramente sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min. </li><li> Resuspender en mismo volumen que la solución de tripsina / enfriamiento utilizando PBS estéril. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de partículas. </li><li> Ligeramente sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min. </li><li> Resuspender en volumen adecuado de PBS durante 5,5 x 10 6 a 6,0 x 10 6 células / ml. Nota: Por ejemplo, un matraz T-75 producirá aproximadam ente 7,5 x 10 6 células 29. </li><li> Mantenga suspensión de células en hielo hasta la electroporación. </li></ol> 3. Preparación para la electroporación <ol><li> Cubetas Pre protección contra el frío de electroporación (brecha de 0,4 cm) en el hielo. </li><li> Encienda el aparato de electroporación y ajustar la tensión de 0,3 kV. NOTA: La capacitancia y la resistencia no eran configuraciones ajustables en nuestro electroporador (fijado en 10 mF y 600 Ω por el fabricante). </li><li> Llenar placas de recuperación con NGM y equilibrar en humidificado 95% de aire / 5% de CO 2 atmósfera a 37 ° C. </li></ol> 4. La electroporación <ol><li> Coloque 400 l de suspensión celular en la cubeta previamente enfriada y añadir 20 g de proteína seleccionada para la cubeta (50 mg / ml). </li><li> Cubeta Flick suavemente ~ 10 veces para mezclar sin dañar las células. Nota: La cubeta también puede invertirse varias veces para mezclar bien, pero no pipetear hacia arriba y hacia abajo o vortex para evitar daños en las células. </li><li&gt; fuera seco de cubeta con una toalla de papel u otro limpiador para evitar la formación de arco eléctrico en el electroporador. </li><li> Muestra electroporar a 0,3 kV para 1.5 a 1.7 ms. Nota: Esto era típico para este estudio. </li><li> Inmediatamente después de la electroporación película cubeta suavemente ~ 10 veces para mezclar a fondo. </li></ol> 5. Chapado de células <ol><li> Cubeta tienda con células electroporadas en hielo hasta que esté listo para colocar en placas de recuperación. </li><li> Para la mayoría de los análisis posteriores, se lavan las células 1x con pre-calentado NGM para eliminar la proteína efectora extraña. <ol><li> Eliminar las células para su análisis y suspender en 3-5 ml de NGM. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min. </li><li> Volver a suspender en un volumen adecuado de NGM por tamaño de la placa deseada (por ejemplo, 2 ml de 35 mm plato). </li></ol></li><li> Retire cantidad adecuada de células para el análisis de aguas abajo. <ol><li> Ejemplo 1: placa en placas de fondo de cristal para el análisis de microscopía. </li><li> Ejemplo 2: Placa de into de plástico de cultivo celular para el análisis de proteínas tales como purificaciones de afinidad. </li></ol></li><li> Permitir que las células se recuperen en placas equilibrada en humidificado 95% de aire / 5% de CO 2 atmósfera a 37 ° C durante al menos 4 h. </li></ol> 6. Análisis de Microscopía 6.1) Fijación / inmunofluorescencia tinción <ol><li> Lavar las células con PBS 1x estéril después de un período de recuperación de 4 horas. </li><li> Fijar las células en 100% de metanol durante 2 min a temperatura ambiente. Use suficiente metanol para cubrir completamente las células (por ejemplo, 2 ml por placa de 35 mm). </li><li> Lavar 3 veces con PBS estéril. </li><li> Permeabilizar las células con 0,4% Triton X-100 en PBS durante 15 min. Por ejemplo, utilizar 1 ml de una placa de 35 mm de diámetro. <ol><li> Ajuste la longitud de permeabilización y la fuerza de Triton X-100 de acuerdo con epítopo y la ubicación de proteína diana. Nota: se necesitan mejores resultados debe determinarse empíricamente para cada objetivo, sin embargo las condiciones anteriores deben ser adecuados para la mayoría cobjetivos ytosolic. </li></ol></li><li> Bloque con 5% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 1 hora a RT. Por ejemplo, utilizar 1 ml de una placa de 35 mm de diámetro. </li><li> Lavar 3 veces con PBS. </li><li> Incubar anticuerpo primario en solución de unión del anticuerpo (0,1% Triton X-100 y 1% de BSA en PBS) durante la noche a 4 &#160; ° C con agitación suave. Por ejemplo, use 0.5 ml para una placa de 35 mm de diámetro. <ol><li> Siga las recomendaciones del fabricante para la dilución de anticuerpos. Nota: Por ejemplo, se utilizó el anticuerpo etiqueta de péptido de unión a estreptavidina-(SBP-tag) a 1: 1000 dilución, mientras que el anticuerpo PKN1 se utilizó a 1: 200 dilución. </li></ol></li><li> Lave 4 veces con PBS. </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario conjugado fluorescente apropiada en solución de unión del anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz. <ol><li> Por ejemplo, utilice Alexa 488 o Alexa 647 durante 1 hora a temperatura ambiente. <ol><li> Siga las recomendaciones del fabricante para la hormigadilución ibody. (Por ejemplo aproximadamente 1: 1000 para este estudio). </li></ol></li><li> Añadir otras manchas según sea necesario, por ejemplo, 5 mM de germen de trigo agglutinnin (WGA) conjugado con Alexa 647 o DAPI según la recomendación del fabricante, durante 1 hora a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lave 5x con PBS y se almacena a 4 ° C, protegido de la luz hasta el momento de la imagen. </li></ol> 6.2) Microscopía Confocal y Análisis de Imágenes <ol><li> Muestras de imagen en un microscopio confocal invertido utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63x. <ol><li> Imagen canal verde utilizando la línea de 488 nm de un láser de argón, con emisión de ancho de banda entre 492 a 542 nm. </li><li> Imagen canal rojo usando un láser de diodo de 633 nm, con emisión de ancho de banda entre 640 a 718 nm. </li><li> Imagen azul canal utilizando un láser de diodo de 405 nm, con emisión de ancho de banda entre 407 a 453 nm. </li><li> Asegúrese de que el canal múltiple z-pilas cubren la totalidad del volumen celular. </li></ol></li><li> Procesar imágenes con software de procesamiento de imagen correspondiente. </li></ol> Purificación 7. Affinity <ol><li> Lavar las células electroporadas dos veces con PBS 4 ° C después de un período de recuperación de 4 hr. </li><li> Lisan con ~ 1,0 ml de tampón de lisis (1% Triton X-100 con cóctel inhibidor de la proteasa e inhibidor de la fosfatasa en PBS) en hielo. Utilice inhibidores de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: Por ejemplo, tanto los inhibidores de la fosfatasa y de la proteasa utilizados en este estudio fueron suministrados a 100X, pero otras formulaciones deben funcionar igualmente bien. </li><li> Inmediatamente raspar las células con goma de policía y recoger en tubos cónicos. </li><li> Lisan mediante agitación vigorosa y sonicación. Nota: Otros métodos de lisis pueden funcionar igual de bien, pero necesitarán la eficiencia por determinar empíricamente acerca de la adecuación de los requisitos de ensayo. <ol><li> Sonicar 3 x 30 segundos con agitación con vórtex intermitente. </li></ol></li><li> Centrifugar a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C para recogerrestos celulares y agregados insolubles; guardar el sobrenadante. </li><li> Combinar volúmenes iguales (~ 1,0 ml) de lisado de células a electroporación con 50 l de estreptavidina suspensión de resina de agarosa a 4 ° C durante la noche con rotación de extremo a extremo. Nota: Esta resina captura la proteína de electroporación (y complejos asociados) a través de su péptido etiqueta de afinidad de unión a estreptavidina. </li><li> Centrifugar a 2500 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante. </li><li> Lavar dos veces con 40 volúmenes de lecho (~ 1 ml) PBS. </li><li> Añadir 30 l de 4x LDS tampón de carga (141 mM de base Tris, 2% LDS, 10% de glicerol, EDTA 0,51 mM, 0,22 mM SERVA azul G, fenol 0,175 mM rojo, pH 8,5), 20 l DIH 2 O y 1 l de 0,5 M de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), lo que permite algo de volumen permanezca en perlas. </li><li> Se calienta a 95 ° C durante 10 min y enfriar en hielo. </li><li> Girar&gt; 10.000 xg a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Recoger el sobrenadante. </li><li> Realizar una transferencia Western utilizando anticuerpos apropiados Nota: Élre, se utiliza anti-PKN1 anticuerpo primario. </li></ol>

<ol><li>Mota, L. J., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+injection+kit%3A+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The bacterial injection kit: type III secretion systems.</a> Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).</li>
<li>Galan, J. E., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+secretion+machines%3A+bacterial+devices+for+protein+delivery+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells.</a> Science. 284, 1322-1328 (1999).</li>
<li>Hueck, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+systems+in+bacterial+pathogens+of+animals+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).</li>
<li>Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+type+III+secretory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of type III secretory systems.</a> Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).</li>
<li>He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+systems+in+plant+and+animal+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).</li>
<li>Dean, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domains+and+motifs+of+bacterial+type+III+effector+proteins+and+their+roles+in+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).</li>
<li>Espinosa, A., Alfano, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disabling+surveillance%3A+bacterial+type+III+secretion+system+effectors+that+suppress+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).</li>
<li>Orchard, R. C., Alto, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+GEFs%3A+a+common+theme+for+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens.</a> Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).</li>
<li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+effector+protein%2C+VopQ%2C+forms+a+lysosomal+gated+channel+that+disrupts+host+ion+homeostasis+and+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Lafon, M., Lafage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+monoclonal+antibodies+specific+for+the+internal+proteins+N+and+NS+of+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus.</a> The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).</li>
<li>Kriegler, M. P., Livingston, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+facilitated+microinjection+of+proteins+into+intact+monolayers+of+tissue+culture+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells).</a> Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).</li>
<li>Nossa, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+abundant+nuclear+factor+poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1+by+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+Optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Electroporation+Is+a+Highly+Efficient+Method+for+Introducing+Restriction+Endonucleases+into+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells.</a> Mutation Research. 225, 49-53 (1989).</li>
<li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+damage+induced+by+restriction+endonucleases+recognizing+thymine-rich+DNA+sequences+in+electroporated+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).</li>
<li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chromosomal+aberrations+in+the+CHO+mutant+EM9+and+its+parental+line+AA8+by+EcoRI+restriction+endonuclease%3A+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments.</a> Mutation Research. 246, 221-226 (1991).</li>
<li>Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+antibodies%2C+DNA%2C+and+other+macromolecules+into+cells%3A+a+highly+efficient+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method.</a> Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).</li>
<li>Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+edges+toward+clinic+for+both+gene+therapy+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+and+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery.</a> Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).</li>
<li>Kotzamanis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+from+a+BAC+carrying+the+complete+human+gene+and+associated+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).</li>
<li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+unlabeled+proteins+into+living+cells+by+electroporation+and+isolation+of+viable+protein-loaded+cells+using+dextran-fluorescein+isothiocyanate+as+a+marker+for+protein+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake.</a> Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).</li>
<li>Prasanna, G. L., Panda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+Basic+principles%2C+practical+considerations+and+applications+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology.</a> Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).</li>
<li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+electroporation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory.+Concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory. Concepts and mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).</li>
<li>McAteer, J. A., Douglas, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture techniques.</a> Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).</li>
<li>Ho, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GtgE%2C+a+novel+virulence+factor+encoded+on+the+Gifsy-2+bacteriophage+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).</li>
<li>Niemann, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+secreted+virulence+factors+from+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+by+proteomic+analysis+of+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants.</a> Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).</li>
<li>Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+targeting+of+Rab29+by+an+effector+protein+distinguishes+the+intracellular+compartments+of+human-adapted+and+broad-host+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).</li>
<li>Haraga, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+type+III+secretion+effector+interacts+with+the+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+PKN1%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1.</a> Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+confocal+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology+%2F+Editorial+Board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.</a> Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).</li>
<li>Kimple, M. E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science+%2F+Editorial+Board%2C+John+E.+Coligan+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Efectores secreta a partir de bacterias patógenas han evolucionado para funcionar en el entorno de la célula huésped y por lo tanto es útil para estudiar in situ dentro del huésped. Introducción de efectores específicos de interés en las células huésped permite las interacciones patógeno-hospedador relevantes para ser estudiados en forma aislada, sin interferencia de otras proteínas bacterianas. El objetivo era explorar la electroporación como un medio para introducir proteínas efectoras bacterianas en células ...

Muchas bacterias Gram-negativas emplean sistemas de secreción especializados para inyectar proteínas relacionados con la virulencia (referidos como efectores) directamente en células huésped 1-5. Estos efectores tienen una amplia gama de funciones biológicas que incluyen: la supresión de la inmunidad del huésped, cambios en el citoesqueleto, la modificación de tráfico y la señalización intracelular, los cambios transcripcionales, y las alteraciones del proteasoma anfitrión 6-9. Las funciones de algunos efectores son conocidos, sin embargo, los objetivos de acogida y acción bioquímica (s) de muchos otros queda por determinar. Si bien la comparación de tipo salvaje y las infecciones bacterianas recombinantes es un enfoque válido para estudiar los mecanismos de virulencia efector intracelular, a menudo es ventajoso introducir un efector individuo en la célula huésped. Así, los métodos simples para la introducción y la caracterización de proteínas efectoras bacterianas en el contexto de las células huésped es altamente deseable. Simplificando el análisis wi experimentalº un solo efector es crítica como en otros efectores pueden tener funciones opuestas o redundantes. Para llevar a cabo esta simplificación, los investigadores han introducido previamente macromoléculas en las células mediante muchos métodos diferentes, incluyendo la transducción viral 10, la microinyección 11, carga por raspado 12,13, fusión celular con microinyección químicamente inducido 14, proteína patentada reactivos &quot;transfección&quot; 15, precipitaciones de fosfato de calcio 16, y la electroporación 17-20. Las moléculas introducidas se extienden a partir de ácidos nucleicos que incluyen las especies de ADN, ARN, y RNAi a las proteínas, tintes impermeables a las células, y los anticuerpos para dianas intracelulares 21,22. Algunos métodos tienen limitaciones incluyendo el tipo de macromolécula que se puede introducir, y en particular análisis aguas abajo pueden ser limitadas debido a la alta toxicidad celular, los mecanismos dañinos de la acción, baja eficacia o eficiencia de introducción. La transfección, un oftemétodo n-utilizado para expresar genes bacterianos en células de mamíferos, también sufre la limitación de que algunos tipos de células de acogida pertinentes, como los macrófagos y las células primarias, son particularmente resistentes a la transfección. Más allá de esto, es difícil de controlar los niveles de proteína bacteriana producida tras la introducción de ADN extraño. Mucho trabajo se ha establecido la electroporación de ácidos nucleicos en ambas células bacterianas y de mamíferos como una técnica de laboratorio común; Sin embargo, hay investigaciones en curso en los mejores métodos para la entrega de proteínas en las células en condiciones fisiológicas. Informes sobre la transfección de proteínas son prometedores, pero requieren reactivos y optimización caros. El deseo de introducir efectores bacterianos potencialmente tóxicos en una amplia variedad de objetivos celulares con un coste mínimo nos llevó a considerar la electroporación como un método para el estudio de estas proteínas in vivo. Proteína electroporación 23-25 ​​es un conocióhod para introducir las proteínas en las células vivas a través de electropermeabilización, también conocido como electro-transfección o electro-inyección 26. Esta técnica utiliza pulsos eléctricos de alta intensidad para crear poros en las membranas celulares. Estos poros reversibles permiten macromoléculas que normalmente están excluidos desde el espacio intracelular para entrar en la célula. Tras la eliminación del campo eléctrico externo, la membrana puede volver a cerrar, permitiendo que la célula para retener moléculas que pasan a través de los poros 27,28. A electroporador estándar se utilizó en este estudio para introducir constantemente efectores bacterianos en ambos ratón células similares a macrófagos y células epiteliales humanas. El método es rápido, eficiente y de bajo costo, sin disminución apreciable en la viabilidad celular. Las proteínas introducidas se pueden visualizar a través de microscopía de inmunofluorescencia o se utilizan para ensayos funcionales. Esto ha sido demostrado utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) como un estándar no tóxico, así comodos proteínas efectoras Salmonella, SspH1 y GtgE. Proponemos electroporación proteína como una herramienta adicional en el repertorio para el estudio de las proteínas de virulencia bacteriana y sus funciones en células huésped eucariotas.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA Solución</td><td>Cellgro</td><td>25-050-CL</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Cubetas de electroporación desechables por huecos</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>100% Metanol</td><td>Cualquier</td><td>N/A Inflamable</td><td>, Tóxico</td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de recuento de células - Hemocitómetro o contador de rejas Beckman</td><td>Coulter</td><td>Modelo Z1</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivos celulares</td><td>Cualquier</td><td>N/A</td><td>Humidificado 95% aire/5% CO2 atmósfera a 37 °C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Plástico para cultivos celulares</td><td>Cualquiera</td><td>N/A</td><td>Matraces/placas para cultivos celulares, pipetas, tubos, policías</td></tr><tr><td>de caucho Modificación del águila de Dulbecco s Medio (DMEM)</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td>Cálido hasta 37 &° C&nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Bio-Rad</td><td>E. coli Pulsador</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal fluorescente&nbsp;</td>Modelo <td>Ziess</td><td>&nbsp; LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas con fondo de vidrio para microscopía</td><td>Wilco Wells</td><td>HBSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>HALT Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Pierce</td><td>78430</td><td>Línea celular HeLa corrosiva y tóxica</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>LDS 4X Tampón de carga</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>10-010</td><td>Cálido hasta 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Otras tinciones fluorescentes (WGA, DAPI) junto con el reactivo antidecoloración</td><td>Cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 Línea celular</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario contra el objetivo de interés</td><td>Cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo</td><td>Cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Cualquier</td><td>N/A</td><td>enfriar a 4 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato estéril</td><td>cualquier</td><td>N/A</td><td>caliente a 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Suspensión de resina de estreptavidina y agarosa&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa capaz de aceptar tubos cónicos (preferiblemente cucharón oscilante)</td><td>Cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td>Corrosivo, Tóxico</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8585</td><td>Irritante, Tóxico</td></tr></tbody></table>

la electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

El estudio de las interacciones proteína en el contexto de las células vivas puede generar información crítica acerca de la localización, la dinámica y socios que interactúan. Esta información es particularmente valioso en el contexto de la interacción huésped-patógeno. Muchas proteínas de patógenos funcionan dentro de células huésped en una variedad de manera tal, que permite la evasión del sistema inmune del huésped y la supervivencia en el entorno intracelular. Para estudiar estas interacciones proteína-patógeno de la célula huésped, varios enfoques se utilizan comúnmente, incluyendo: la infección in vivo con una cepa que expresa una proteína etiquetada o mutante, o la introducción de genes de patógenos a través de la transfección o transducción. Cada uno de estos enfoques tiene ventajas y desventajas. Se buscó un medio para introducir directamente las proteínas exógenas en células. La electroporación se utiliza comúnmente para introducir ácidos nucleicos en células, pero ha sido más raramente aplicado a las proteínas, aunque la base biofísica es exactamente el mismo.A electroporador estándar fue utilizado para introducir efectores bacterianos-etiquetados por afinidad en células de mamífero. Macrófagos epiteliales y ratón Humanos fueron cultivadas por métodos tradicionales, extraído, y se colocaron en 0,4 cm cubetas de electroporación brecha con una proteína exógena bacteriano patógeno de interés (por ejemplo, Salmonella Typhimurium GtgE). Después de la electroporación (0,3 kV) y un corto (4 h) período de recuperación, la proteína intracelular se verificó mediante el etiquetado con fluorescencia la proteína a través de su etiqueta de afinidad y el examen de la distribución espacial y temporal por microscopía confocal. La proteína electroporación también ha demostrado ser funcional dentro de la célula y capaz de tráfico subcelular correcta y la interacción proteína-proteína. Mientras que las proteínas exógenas tendían a acumularse en la superficie de las células, las muestras electroporadas tenían grandes aumentos en la concentración intracelular de efector con respecto a la incubación solo. El protocolo es simple y lo suficientemente rápido para ser hecho en apmoda an paralelo, lo que permite la caracterización de alto rendimiento de las proteínas de patógenos en células huésped incluyendo focalización y la función de las proteínas de virulencia subcelular.

Como prueba inicial de concepto, proteína fluorescente verde purificado se introdujo con éxito en células de mamífero utilizando electroporación. GFP, un aproximado de 27 kD una proteína de peso molecular se introduce comúnmente en células de mamífero (normalmente expresadas a partir de ADN del plásmido) como una herramienta de biología molecular sin toxicidad celular significativa. Las células HeLa se incubaron (Figura 1A) o electroporación (Figura 1B) con 25 g GFP / ml, seguido por mi...

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en introducir proteínas exógenas, potencialmente citotóxicas, como efectores bacterianos, en células de mamífero para estudiar sus efectos y funciones. Esto se logra primero cultivando células de mamífero mediante condiciones estándar de cultivo para obtener células hospedadoras adecuadas en las cuales introducir la proteína purificada de interés. Como segundo paso, se realiza la electroforesis de las células hospedadoras cultivadas en presencia de un efector bacteriano purificado, lo que permite que la proteína ingrese e interactúe con las células hospedadoras.A continuación, se realiza la visualización o algún otro ensayo funcional con el fin de evaluar la localización subcelular y la funcionalidad de la proteína efectora. Los resultados basados en microscopía confocal, métodos inmunoquímicos u otras técnicas de análisis muestran la localización de los efectores bacterianos funcionales en sus ubicaciones subcelulares esperadas, así como su unión a sus socios de interacción conocidos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección o la transducción es que este protocolo representa un enfoque rápido, sencillo y económico para superar la citotoxicidad potencial.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de patógenos, como el descubrimiento o la validación de las funciones de proteínas efectoras bacterianas. Aunque este método se utilizó para obtener información sobre proteínas efectoras bacterianas, también puede aplicarse a otras proteínas o moléculas pequeñas. La visualización del resultado es fundamental.Dado que la colocalización con características celulares conocidas permite verificar la asociación subcelular esperada de la proteína electroporada al comenzar este procedimiento, transfiera 400 microlitros de la suspensión celular a un vial previamente enfriado. A continuación, añada 20 microgramos de la proteína seleccionada para alcanzar una concentración final de 50 microgramos por mililitro.Agite suavemente el vial unas 10 veces para mezclar y evitar dañar las células. A continuación, seque el exterior del vial con una toalla de papel para evitar arcos eléctricos en el electro. Coloque la muestra en el electro y ajústelo a 0,3 kilovoltios durante 1,5 a 1,7 milisegundos inmediatamente después de la electrotransferencia.Agite suavemente el qve aproximadamente 10 veces para mezclar bien la muestra antes de proceder a la fijación y tinción inmunofluorescente o a la purificación por afinidad. Después de cuatro horas de recuperación tras la electroforesis, lave las células con PBS estéril. Luego fije las células en metanol al 100 % durante dos minutos a temperatura ambiente.Posteriormente, lave las células con PBS estéril varias veces. Permeabilice las células con Triton X-100 al 0,4 % en PBS durante 15 minutos. Ajuste la duración de la permeabilización y la concentración de Triton X-100 según el epítopo y la localización de la proteína diana.A continuación, bloquee las células con BSA al 5 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después, lávelas tres veces con PBS. A continuación, incúbelas con el anticuerpo primario en la solución de unión de anticuerpos durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación suave al día siguiente.Lave las células cuatro veces más con PBS. A continuación, incúbalas con el anticuerpo secundario adecuado conjugado con un fluoróforo en la solución de unión de anticuerpos. Añada otros colorantes según sea necesario, como cinco micromoles de aglutinina de germen de trigo o WGA conjugada con Alexa 647 o DPI durante una hora a temperatura ambiente y protegidos de la luz.Luego, lave las células con PBS cinco veces y almacénelas a cuatro grados Celsius protegidas de la luz hasta que estén listas para ser observadas en este paso. Lave las células electro poradas dos veces con PBS a cuatro grados Celsius. Después de cuatro horas de recuperación, lice las células con un mililitro de tampón de lisis en hielo.Raspe inmediatamente las células con una espátula de goma y recójalas en tubos cónicos. Luego, lice las células mediante sonicación y vortexado vigoroso. A continuación, centrifugue la muestra a 10.000 ×g.Centrifugar durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para recoger los restos celulares y los agregados insolubles, y conservar el sobrenadante. Combinar un mililitro del lisado celular electro porado clarificado con 50 microlitros de resina de estreptavidina en suspensión. Incubar la mezcla a cuatro grados Celsius durante la noche con rotación de extremo a extremo para capturar la proteína electro porada y los complejos asociados mediante la etiqueta de afinidad por unión a estreptavidina.Después, centrifugue la muestra a 2.500 × g durante dos minutos y deseche el sobrenadante. Luego, lave la muestra dos veces con un mililitro de PBS. A continuación, agregue 30 microlitros de tampón de carga 4× XLDS, 20 microlitros de H2O destilada y un microlitro de TCEP 0,5 molar a la muestra, y deje algo de sobrenadante.Caliente la muestra a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, enfríela en hielo durante aproximadamente un minuto. Posteriormente, centrifugue la muestra a 10.000 ×g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Al final, recopile el sobrenadante para la transferencia Western con los anticuerpos apropiados. Las células HeLa fueron incubadas o electro poradas con 50 microgramos por mililitro de un efector de Salmonella con marca de afinidad, GTGE, y teñidas con un anticuerpo contra la marca del efector dpi, una máscara nuclear y WGA para delimitar el límite citosólico. Las células HeLa incubadas muestran ausencia de fluorescencia verde, lo que indica una falta de internalización del GTGE. Esta es una microfotografía representativa del GTGE electro porado, que muestra la proteína efectora intracelular electro porada.Aquí se muestra el inmunotransferencia tipo oeste para detectar la proteína quinasa N uno, el socio de interacción eucariota sine thine. Tenga en cuenta que la pista más a la derecha incluye dos cubetas agrupadas. La señal de un qve se mezcló con el fondo, sin embargo, pkn uno aún se enriqueció por encima de la ausencia de unión observada en el control sin cebo mediante microscopía confocal tras la electrotransferencia con 50 microgramos por mililitro.Las células HeLa S sph una muestran la colocalización entre pkn uno y S SPH uno. Esta superposición óptica indica que el efector y la proteína del huésped están lo suficientemente cercanos como para interactuar físicamente. El hecho de que la interacción se haya observado por primera vez en el núcleo ofrece apoyo adicional de que la proteína fue transportada correctamente por el huésped.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse de manera de alto rendimiento. Para estudiar múltiples proteínas individuales mientras se intenta este procedimiento, es importante recordar determinar empíricamente las mejores condiciones de electroforesis para cada tipo celular y cada proteína diana. Este procedimiento podría permitirle multiplexar con varias proteínas, moléculas pequeñas o una combinación de ambas para comprender mejor los procesos celulares en una variedad de sistemas modelo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la electroporación puede utilizarse para introducir macromoléculas, como proteínas, en células de mamíferos.

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En este video, demostramos la introducción de proteínas efectoras bacterianas en células de mamíferos por electroporación. La localización intracelular de las proteínas efectoras bacterianas se detecta mediante microscopía confocal tras la tinción con anticuerpos específicos conjugados con fluoróforos.

Introducción de proteínas efectoras bacterianas en células de mamíferos por electroporación

La electroporación es un método comúnmente empleado para introducir el ADN en las bacterias en un proceso conocido como transformación. Los protocolos tradicionales para la preparación de células electrocompetentes son mucho tiempo y mano de obra intensiva. Este artículo describe un suplente, rápida, y eficiente método para la preparación de células electrocompetentes actualmente empleados por algunos laboratorios.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

La electroporación es un enfoque efectivo para entregar genes de interés en las células. Al aplicar este enfoque en vivo en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal de ratón adulto (DRG), se describe un modelo para el estudio de la regeneración del axón en vivo.

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Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

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Hemos desarrollado un protocolo para transfectar células epiteliales pigmentarias humanas primarias por electroporación con el gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). La transfección exitosa se demostró mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR), inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

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La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

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Aprende a introducir proteínas efectoras bacterianas en células de mamífero mediante electroporación. Este método rápido permite estudiar la localización subcelular y la funcionalidad proteica con microscopía confocal.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

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