Disección y montaje de Drosophila Pupal discos Eye

Bienvenidos a una disección del disco del ojo pupilar y montaje de Drosophila melanogaster. Se debe seleccionar una pupa HD adecuada. La disección comienza perforando la caja de la pupila y retirando la pupa de la caja.

Se hace un corte en diagonal en la mitad del tórax en la pupa. Después de cortar la pupa, el cerebro y el iis se aislarán y procesarán antes de montar el iis. Para que la microscopía comience el proceso de disección y se seleccione la pupa de edad adecuada.

Coloque la pupa en una gota grande de PBS en el plato de disección. La mejor práctica es orientar la pupa con los ganchos bucales hacia abajo. Estos son los ganchos bucales que miran hacia abajo.

Agarra la pupa suavemente con un par de pinzas. Tenga cuidado de no apretar demasiado fuerte la pupa en desarrollo dentro de la carcasa de la pupila con un par de pinzas afiladas. Perfora la caja de la pupila y deja que los cuatro escalones se extiendan para arrancar el extremo.

Mete la mano adentro y agarra la pupa en desarrollo del agujero que se acaba de crear. A continuación, toma un par de tijeras y corta la pupa a la mitad del tórax. Haz el corte en diagonal.

Entonces es mejor eliminar los residuos o transferir la PU a una nueva gota de PBS. La limpieza se puede realizar con el tubo del soplador de pipeta y se debe agregar PBS adicional según sea necesario, asegurándose de evitar la deshidratación. A continuación, sujete firmemente la parte superior de la cutícula de la cabeza de la pupila con un par de pinzas.

Asegúrese de evitar agarrar cualquier tejido dentro de la cutícula con la punta del tubo del soplador. Empuje suavemente el estuche de la pupila para extruir el cerebro y sacar el disco del ojo del estuche de la pupila. Para ayudar en este proceso, use PBS en el tubo del soplador para soplar suavemente los escombros como se ve aquí fuera de la carcasa de la cabeza para permitir la separación clara y la identificación de los discos de cerebro e I, continúe en este proceso de empujar y soplar según sea necesario hasta que los discos de cerebro y I se separen del tejido circundante y se identifiquen fácilmente. ya comenzado y los I diss tienen un ligero color.

Los ojos se delinean en rojo y el cerebro se resalta en el medio. Con un aumento mayor, cada uno de los discos I se puede identificar fácilmente. Una vez más, los discos I se han delineado en rojo con el cerebro en medio.

El cerebro y los discos deben continuar limpiándose y separándose del tejido restante mediante el uso de fórceps y el tubo de soplado de manera óptima, el disco ocular y el cerebro deben permanecer unidos a la cutícula de la cabeza para que pueda actuar como un mango para la manipulación futura. Aunque a través del proceso de soplado y empuje, es común desalojar el cerebro y el disco ocular de la cutícula de la cabeza. Después de un cuidadoso aislamiento de la I dis y el cerebro, coloque suavemente el tejido en la solución fija.

Inicialmente, deje que el disco I flote sobre la solución para que no se colapsen sobre sí mismos y se fijen En una orientación cerrada, la mejor práctica es diseccionar las I dis y dejarlas flotar en la solución. Permanecen flotando mientras se disecciona el siguiente conjunto de discos I, y luego se sumergen en la fijación después de la fijación del disco I. Se procesan según sea necesario, como la inmunotinción, y luego se montan en un portaobjetos para su visualización.

Aquí hay discos de pupila fija I con el cerebro todavía unido en una gran gota de PBS. El montaje y el glicerol es muy difícil de hacer, aunque hemos montado con éxito iis y 50%glycerol y PBS. Si monta en PBS, asegúrese de evitar la deshidratación.

Observe que se ha eliminado la cutícula de la cabeza. Delineado en rojo está cada disco I. El cerebro se resalta en el medio.

Tome pinzas afiladas y corte la conexión entre el disco ocular y el cerebro. Esto se logra sosteniendo el cerebro y colocando las pinzas afiladas en la conexión aquí. Esto puede ser muy difícil.

Es importante utilizar pinzas afiladas porque facilitan mucho este proceso. También es posible hacer esta separación utilizando una aguja de disección fina, así como se puede ver. A veces es más fácil arrancar el cerebro mientras se estabiliza el disco ocular en la conexión.

Queda bastante tejido extraño en este disco ocular que no debería afectar la imagen del disco ocular, siempre y cuando el disco I esté montado en el portaobjetos del microscopio con este lado hacia arriba. Esto permite que la superficie apical del disco I sea plana en el portaobjetos del microscopio. Hemos encontrado que la extirpación adicional de este tejido generalmente conduce a un daño tisular del disco I.

Por lo tanto, es preferible dejar este tejido y evitarlo en la etapa de imagen. Otra técnica para extirpar el cerebro consiste en sujetar el disco ocular en la conexión con una aguja de disección o un par de pinzas afiladas, como se ve aquí, y luego extraer el cerebro. Este desprendimiento era mucho más limpio, con menos tejido restante en el disco I.

Cuando haya terminado de preparar todos sus discos I, alinéelos en una fila con la pista óptica orientada hacia arriba. Retire el PBS y reemplácelo con un protector VTA u otro medio de montaje y cúbralos con un cubreobjetos. Los discos I ya están listos para ser fotografiados a través de las técnicas descritas aquí junto con el protocolo detallado de inmunotinción.

En el manuscrito se puede visualizar el disco I con microscopía confocal para las características morfológicas como se ve aquí con la tinción de fosfotirosina, revelando la morfología apical de las células omel en el disco I. Se pueden emplear otros anticuerpos y técnicas genéticas para identificar los tubos celulares y los patrones de expresión, como se ve aquí para la expresión del factor de transcripción cortado en las células cónicas del disco I. Este video representa una remasterización de videos de capacitación que se produjeron para instruir a los estudiantes de pregrado en esta técnica.

Muchos de nuestros estudiantes se entrenaron con éxito en esta técnica utilizando este video y esperamos que también te ayude. Le deseamos la mejor de las suertes en sus experimentos y esperamos que esta técnica sea beneficiosa para usted.