Name: Preparación y caracterización de SDF-1α-quitosano-sulfato de dextrano Nanopartículas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprende a preparar y caracterizar nanopartículas de SDF-1α con quitosano y sulfato de dextrano para terapia celular. Este método permite evaluar tamaño, potencial zeta y actividad biológica del factor de homing.

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Este trabajo fue apoyado por becas del NIH: HL671795, HL048743 y HL108630.

1. Preparación de SDF-1α Glycan Nanopartículas Debido a los efectos de la administración in vivo, esterilizar todos los recipientes, pipetas y puntas utilizadas en la preparación. <ol><li> Preparar las siguientes soluciones madre en agua ultrapura: sulfato de dextrano al 1%; 1 M NaOH (esterilizada por filtración con una membrana de PES); 0,1% de quitosano en 0,2% de ácido acético glacial (filtro a través del 0,8 y 0,22 micras filtros consecutivos y ajustar el pH a 5,5 con NaOH después); 0,1 M ZnSO 4; 15% de manitol; y 0,92 mg / ml SDF-1α (almacenado en alícuotas a 80 ° C, y se mantiene a 4 ° C una vez descongelados). </li><li> Esterilizar soluciones madre a través de 0,22 micras membranas de filtro. Evaluar los niveles de endotoxina en la solución preparada con el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) coágulo de gel. Asegúrese de que los niveles son &lt;0,06 UE / ml. </li><li> Añadir 0,18 ml de agua ultrapura a un vial de vidrio de 1,5 ml que contenía una barra de agitación magnética. Ajuste la velocidad de agitación a 800 rpm. Añadir 0,1 ml 1%sulfato de dextrano y se agita durante 2 min. Añadir 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml de 0,92 mg / ml SDF-1α solución) y se agita durante 20 min. </li><li> Añadir 0,33 ml 0,1% gota a gota quitosano y se agita durante 5 min. Cambiar la velocidad de agitación al máximo y añadir 0,1 ml 0,1 M ZnSO4 lentamente con una jeringa 0,1 ml (más de 1 min). </li><li> Volver velocidad de agitación a 800 rpm y agitar durante 30 min. Añadir 0,4 ml 15% de manitol y se agita durante 5 min. Transferir la mezcla de reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 16.000 xg a 4 ° C durante 10 min. Nota: La presencia de manitol facilita la resuspensión de las partículas después de la centrifugación. Dependiendo de la compacidad de la pastilla, la concentración de manitol puede variar de 0% a 5%. La resuspensión completa de las partículas después de cada centrifugación es crítico para evitar los agregados en la suspensión final. </li><li> Aspirar el sobrenadante y utilizar una pipeta para extraer la última gota de líquido lentamente. Añadir 0,2 ml 5% de manitol. Suspender el pellet con 0,5 ml, 29 G neejeringa dle. Añadir 1 ml de manitol al 5%. Centrifugar a 16000 xg durante 15 min. </li><li> Repita el paso 1.6. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 0,2 ml 5% de manitol. Guarde la suspensión de partículas a 4 ° C. Nota: La suspensión de partículas también puede ser almacenado congelado a -80 ° C o liofilizado. Incluyendo manitol 5% en la suspensión es esencial para evitar la agregación de las partículas después de la congelación y descongelación o después de la liofilización y la rehidratación. El manitol se puede eliminar por centrifugación de la suspensión después de que el almacenamiento. </li></ol> 2. Medición de tamaño de partícula y Potencial Zeta El tamaño de partícula y el potencial zeta se analizan mediante dispersión de luz dinámica y dispersión de luz electroforética, respectivamente, con un analizador de partículas se indica en la Lista de Materiales. <ol><li> Ajuste los siguientes parámetros para la medición del tamaño de partícula: tiempos de acumulación: 70; Repetir las veces: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluyente: agua; Ajuste de intensidad: auto. </li><li> Diluir la muestra SDF-1α-DS-CS con agua (dilución de 10 veces). Carga de 100 l de la muestra a una cubeta UV desechable tal como una cubeta de Eppendorf. Inserte la cubeta en el soporte de la celda. Espere a que el ajuste de la intensidad de alcanzar &quot;óptimo&quot; (~ 10.000 cps). Iniciar la adquisición de datos. </li><li> Después de que se ha completado la medición, registrar los resultados de cumulantes diámetro (nm) y el índice de polidispersidad. Media de los resultados obtenidos a partir de cada uno de los 4 lecturas repetidas y calcular la desviación estándar. </li><li> Carga de 500 l de la muestra de partículas diluida 10 veces a una celda de flujo para la medición de potencial zeta. Ajuste los siguientes parámetros para la medición: los tiempos de acumulación: 10; Repetir las veces: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluyente: agua; Ajuste de intensidad: auto. Registre los resultados del potencial zeta (mV). La media de los resultados obtenidos a partir de cada una de las 5 lecturas repetidas, y calcular el deviatio estándarn. </li></ol> 3. Cuantificación de SDF-1α en las Partículas <ol><li> Diluir de forma libre SDF-1α a concentraciones de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, y 0,05 mg / ml en tampón de muestra Laemmli 1,3x. Diluir 6 mu l muestras SDF-1α-DS-CS con 40 l 1.3x tampón de muestra Laemmli. (4x Preparar tampón de Laemmli madre que contiene 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% de SDS, 40% de glicerol, 0,05 mg / ml de azul de bromofenol, y 8% de 2-mercaptoetanol. Dividir la solución madre en pequeñas alícuotas y mantenerla en -20 ° C para uso individual.) </li><li> Calentar las muestras a 100 ° C durante 10 min. Vortex las muestras dos veces (cada uno durante 10 segundos a velocidad máxima) durante el tiempo de calentamiento 10 min con el fin de disociar las partículas completamente. Enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 2 min. Se centrifuga a 10.000 xg durante 0,5-1 min para reducir el agua de condensación. Vortex de nuevo para mezclar bien. Nota: En este punto, la solución de la muestra debe ser clara sin visible precipitado presente. </li><li> Carga 10 y# 181; l muestra / pocillo de un gel SDS 4-20%. Ejecutar la electroforesis a 200 V durante 20 min. Teñir el gel con Coomassie proteína mancha azul. </li><li> Examine la densidad de banda de proteína de SDF-1α usando un generador de imágenes y análisis de densitometría software molecular. Calcular la cantidad de SDF-1α en las partículas frente a una curva patrón construida con las normas SDF-1α libres. </li></ol> 4. In Vitro Ensayo de liberación <ol><li> Mezclar partículas de glicano SDF-1α con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (D-PBS) a una proporción de 1: 1 (v / v). </li><li> Divida la suspensión de partículas en 0,05 ml alícuotas en tubos de 1,5 ml. Cargar las muestras a la parte inferior de los tubos. Evitar la introducción de burbujas de aire o alterar la superficie del líquido. Selle la parte superior de los tubos con Parafilm. NOTA: Al hacer esto, el líquido se mantendrá en la parte inferior durante la rotación de arriba a abajo posterior en el mezclador tubo. </li><li> Gire los tubos a 37 y# 176; C en un mezclador giratorio de Micro-Tube. Retire las alícuotas de a las horas designadas y centrifugar inmediatamente las muestras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Separar los sobrenadantes y pellets, y reconstituir el pellet con 0,05 ml D-PBS. Almacenar las muestras a -20 ° C. Después se recogen todas las muestras, examinar los sobrenadantes y pellets en un gel de SDS como se describió anteriormente. </li></ol> 5. Ensayo de Migración Este ensayo mide la actividad quimiotáctica de SDF-1α. Interacción de SDF-1α con su receptor (CXCR4) en la superficie celular provoca la migración de la célula hacia el gradiente de SDF-1α. En este ensayo, las células se cargan en un pozo superior (separados por una membrana semipermeable desde un pocillo inferior) solución y SDF-1α en un pocillo inferior. <ol><li> Diluir SDF-1α (libre o unido a partículas formulario) con tampón de migración (medio RPMI-1640 que contiene 0,5% de albúmina de suero bovino) en un 3-fodilución en serie ld a concentraciones finales de 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, y 0,05 ng / ml. </li><li> Añadir 0,6 ml de la solución de SDF-1α diluido o tampón de migración sólo (control negativo) a un pocillo de la placa de 24 pocillos. Añadir 0,57 ml de tampón de migración a un pozo (control celda de entrada). Incubar a 37 ° C durante 30 min. Coloque un inserto de cultivo celular permeable tales como Transwell (tamaño de poro 5 m, diámetro 6,5 mm) en la parte superior de la inferior también. Cargar 0,1 ml células Jurkat (5 × 10 5) en la Transwell insertan. Cargar 0,03 ml células directamente al control de celda de entrada también. Incubar la placa a 37 ° C durante 2 horas en una incubadora de CO2 al 5%. </li><li> Quite los insertos Transwell. Transferencia de las células que han migrado a los pocillos inferiores a un tubo de poliestireno de 4 ml. Contar las células migraron con un citómetro de flujo. </li><li> Calcular la migración como un porcentaje del número de células de entrada (el número de células en el control de células de entrada bien x 100/30) después de la sustracción de los números en negative controles (células migradas a los pocillos que contienen sólo tampón de migración). </li></ol>

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<li>Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+complexes+stabilize+and+controllably+release+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).</li>
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<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
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<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Como se mencionó anteriormente, las nanopartículas DS-CS se forman a través de neutralización de la carga entre el polianión (DS) y policatión (CS) moléculas. Dado que la interacción de carga se produce fácilmente durante la colisión molecular, la concentración de las soluciones de polímero y la velocidad de agitación durante la mezcla es crítica para el tamaño de las partículas resultantes. Una tendencia general es que las soluciones de DS y CS 15 y mayor resultado velocidad de agitación en partículas más pe...

El sulfato de dextrano (DS) y quitosano (CS) son polisacáridos con múltiples grupos sulfato cargados negativamente sustituidos (en DS), o grupos amino cargados positivamente (desacetilado CS). Cuando se mezcla en una solución acuosa, los dos polisacáridos forman complejos de polielectrolitos a través de interacciones electrostáticas. Los complejos resultantes pueden formar grandes agregados que se separación de fases de la solución acuosa (precipitados), o pequeñas partículas que son dispersables en agua (coloides). Las condiciones específicas que contribuyen a estos resultados han sido ampliamente estudiados, y se han resumido y se ilustra en detalle en una reciente revisión 1. Entre estas condiciones, dos requisitos básicos para la producción de partículas dispersables en agua son los polímeros de carga opuesta deben 1) tienen significativamente diferente masa molar; y 2) ser mezclado en una relación no estequiométrica. Estas condiciones permitirán que los segmentos poliméricos acomplejados carga neutra generados por la carganeutralización para segregar y forman el núcleo de la partícula, y el exceso de polímero para formar la cubierta exterior 1. Las partículas de glicanos descritos en este protocolo se pretende para la administración pulmonar, y están diseñados para ser neta de carga negativa, y de dimensiones nanométricas. La carga superficial negativa reduce la probabilidad de la captación celular de las partículas de 2,3. Las partículas de dimensión nanométrica facilitan el paso a través de las vías respiratorias distales. Para lograr este objetivo, la cantidad de DS utilizado en esta preparación es en exceso de CS (relación en peso 3: 1); y de alto peso molecular-DS (promedio en peso MW 500.000) y de bajo peso molecular CS (rango MW 50-190 kDa, 75-85% desacetilado) se utilizan. SDF-1α es un factor homing de células madre, que ejerce la función de toma de referencia a través de su actividad quimiotáctica. SDF-1α juega un papel importante en homing y mantenimiento de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, y en el reclutamiento de progecélulas NITOR a los tejidos periféricos a 4,5 reparación de lesiones. SDF-1α tiene un sitio de unión a heparina en su secuencia de la proteína, que permite que la proteína se une a la heparina / heparán sulfato, formar dímeros, ser protegido de la proteasa (CD26 / DPPIV) inactivación, e interactuar con las células diana a través de los receptores de la superficie celular 6-8. DS tiene propiedades estructurales similares a la heparina / heparán sulfato; Por lo tanto, la unión de SDF-1α a DS sería similar a la de sus ligandos poliméricos naturales. En el siguiente protocolo, se describe la preparación de nanopartículas SDF-1α-DS-CS. Los procedimientos representan una de las formulaciones que se han estudiado previamente 9. El protocolo está adaptado originalmente de una investigación de nanopartículas de VEGF-DS-CS 10. Una preparación a pequeña escala se describe, que se puede escalar fácilmente con las mismas soluciones madre y condiciones de preparación. Después de la preparación, las partículas se caracterizan by el examen de su tamaño, el potencial zeta, grado de incorporación SDF-1α, in vitro tiempo de liberación, y la actividad de la SDF-1α incorporado.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitosan, bajo peso molecular&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinc heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1 y alfa;</td><td>Elaborado según referencia 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa, membrana PES 0.22&nbsp; &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Barras Magnéticas Micro Agitadoras (2&nbsp; x&nbsp; 7&nbsp; mm)</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viales de vidrio; SUN-SRi</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de partículas Delsa Nano C&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue Safe Protein Stain</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes moleculares VersaDoc MP 4000 Sistema</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Permeable Soportes</td><td>Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato S &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus kit</td><td>Fisher NC9753738</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación y caracterización de sdf-1α-quitosano-sulfato de dextrano nanopartículas

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

El quitosano (CS) y el sulfato de dextrano (DS) son polisacáridos (glicanos) cargados, que forman nanopartículas basadas en complejos polielectrolíticos cuando se mezclan en condiciones adecuadas. Las nanopartículas de glicanos son portadores útiles de factores proteicos, que facilitan la entrega in vivo de las proteínas y mantienen su retención en el tejido objetivo. Los complejos de polielectrolitos glicanos también son ideales para la entrega de proteínas, ya que la incorporación se realiza en solución acuosa, lo que reduce la probabilidad de inactivación de las proteínas. Las proteínas con un sitio de unión a la heparina se adhieren fácilmente al sulfato de dextrano y, a su vez, se estabilizan mediante la unión. Estas partículas también son menos inflamatorias y tóxicas cuando se administran in vivo. En el protocolo que se describe a continuación, el SDF-1α (factor derivado de células estromales-1α), un factor de localización de células madre, se mezcla primero y se incuba con sulfato de dextrano. El quitosano se agrega a la mezcla para formar complejos de polielectrolitos, seguido de sulfato de zinc para estabilizar los complejos con puentes de zinc. Las partículas SDF-1α-DS-CS resultantes se miden en cuanto a tamaño (diámetro) y carga superficial (potencial zeta). Se determina la cantidad de SDF-1α incorporado, seguido de mediciones de su tasa de liberación in vitro y su actividad quimiotáctica en forma de partículas.

El tamaño y el potencial zeta de las partículas de SDF-1α-DS-CS preparados se determinó con un analizador de partículas. La figura 1 muestra el análisis de la medida del tamaño. De los resultados obtenidos a partir de cumulantes cuatro mediciones repetidas, el diámetro hidrodinámico medio de las partículas SDF-1α-DS-CS es 661 ± 8,2 (nm) y la polidispersidad es de 0,23 ± 0,02. El resultado de la medición del potencial zeta se muestra en la Figura 2. De los cinco mediciones repetidas, el ...

El objetivo de este protocolo es incorporar SDF-1α, un factor de localización de células madre, en nanopartículas de sulfato-quitosano de dextrano. Las partículas resultantes se miden por su tamaño y potencial zeta, así como por el contenido, la actividad y la tasa de liberación in vitro de SDF-1α de las nanopartículas.

Preparación y caracterización de SDF-1α-quitosano-sulfato de dextrano Nanopartículas

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en preparar y caracterizar chimeras de SDF-1α y nanopartículas de sulfato de dextrano. La preparación de las nanopartículas se lleva a cabo primero mezclando el factor de reclutamiento de células madre, el factor estromal derivado de células uno alfa o SDF-1α, con sulfato de dextrano para permitir la unión al glucano cargado negativamente. En una segunda etapa, se añade ozano, un glucano cargado positivamente, a la mezcla, formando un complejo polielectrolítico con el sulfato de dextrano.A continuación, se añade sulfato de zinc para estabilizar los complejos mediante puentes de zinc. La partícula resultante tiene un núcleo denso rodeado por una capa negativamente cargada. Las partículas se miden posteriormente en cuanto a su tamaño y potencial zeta, así como en cuanto al contenido y actividad de S df one alpha en las nanopartículas. La ventaja principal de las nanopartículas de glicano SDF one alpha es que la SDF one alpha incorporada está completamente activa sin necesidad de ser liberada de las partículas.Por lo tanto, las partículas podrían ser útiles como una señal estacionaria de hermina en la terapia con células madre. Pa

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Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis del péptido de Unión placentaria condroitin sulfato A (plCSA-BP)-conjugados polímero lipídico nanopartículas via solo paso sonicación y bioconjugate técnicas. Estas partículas constituyen una novedosa herramienta para la entrega específica de la terapéutica para tumores más humanos y trofoblastos placentarios para tratar cánceres y trastornos placentarios.

Síntesis y caracterización de placenta condroitina sulfato (plCSA) - Targeting lípido - nanopartículas de polímero

Este artículo describe la encapsulación de falcarindiol en revestimiento lípido 74 nm nanopartículas. La absorción celular de las nanopartículas por las células de vástago humanas en gotitas del lípido es supervisada por la proyección de imagen confocal y fluorescente. Nanopartículas se fabrican por el método de la inyección rápida de cambio de disolvente, y su tamaño se mide con la técnica de dispersión de luz dinámica.

Absorción de nuevas nanopartículas recubiertas de lípidos que contienen Falcarindiol por células madre mesenquimales humanas

El método de congelación y descongelación se utiliza para producir hidrogeles de quitosano-polisino (alcohol de vinilo) sin agentes reticulantes. Para este método, es importante tener en cuenta las condiciones de congelación (temperatura, número de ciclos) y la relación polímero, que pueden afectar a las propiedades y aplicaciones de los hidrogeles obtenidos.

Un método de congelación y descongelación para preparar hidrogeles de chitosan-poly (alcohol de vinilo) sin agentes reticulantes y estudios de liberación difluídor

Este estudio describe un método para expandir la quitina en una espuma mediante técnicas químicas que no requieren equipo especializado.

Preparación de espumas de quitina expandidas y su uso en la eliminación de cobre acuoso

El presente protocolo describe un método no basado en emulsiones para la fabricación de microgeles de quitosano-genipina. El tamaño de estos microgeles se puede controlar con precisión, y pueden mostrar hinchazón dependiente del pH, degradarse in vivo y cargarse con moléculas terapéuticas que se liberan con el tiempo de manera sostenida, lo que las hace altamente relevantes para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Fabricación de microgeles de quitosano-genipina de tamaño controlado y sin emulsión para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Aprende a preparar y caracterizar nanopartículas de SDF-1α con quitosano y sulfato de dextrano para terapia celular. Este método permite evaluar tamaño, potencial zeta y actividad biológica del factor de homing.

Preparación y caracterización de SDF-1α-quitosano-sulfato de dextrano Nanopartículas

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