Preparación y caracterización de SDF-1α-quitosano-sulfato de dextrano Nanopartículas

El objetivo general del siguiente experimento es preparar y caracterizar nanopartículas de SD F1 Alfa Chias y sulfato de dextrano. La preparación de las nanopartículas se logra mezclando primero el factor de referencia de la célula madre, el factor derivado de la célula estromial un alfa o S df un alfa con sulfato de dextrano para permitir la unión al glicano cargado negativamente. Como segundo paso, se añade un glicano cargado positivamente a la mezcla formando un complejo de polielectrolitos con sulfato de dextrano.

A continuación, se añade sulfato de zinc para estabilizar los complejos con puentes de zinc. La partícula resultante tiene un núcleo denso rodeado por una capa cargada negativamente. Posteriormente, se mide el tamaño y el potencial zeta de las partículas, así como el contenido y la actividad de S df one alfa en las nanopartículas. La principal ventaja de las nanopartículas de glicano SDF one alpha es que el SDF one alpha incorporado es completamente activo sin ser liberado de las partículas.

Por lo tanto, las partículas podrían ser útiles para servir como una señal de hermina estacionaria en la terapia con células madre. Para comenzar, prepare las soluciones madre como se describe en el protocolo de texto y esterilícelas a través de membranas de filtro de 0,22 micras. Evalúe los niveles de endotoxinas en la solución preparada con el ensayo de coágulo de gágulo de lisado de citos de ameba ulu.

Asegúrese de que los niveles sean inferiores a 0,06 unidades de endotoxinas por mililitro. A continuación, a 0,18 mililitros de agua ultrapura, a un vial de vidrio de 1,5 mililitros que contiene una barra agitadora magnética. Establezca la velocidad de agitación en 800 RPM, luego agregue 0,1 mililitros de sulfato de dextrano al 1% y revuelva después de dos minutos.

Agregue 0,08 miligramos de SD F1 alpha y revuelva durante 20 minutos. Agregue gota a gota agregue 0,33 mililitros de 0,1% de tizen y revuelva durante cinco minutos. Cambie la velocidad de agitación al máximo y agregue lentamente 0,1 mililitros de sulfato de zinc con una jeringa hermética al gas.

Regrese la velocidad de agitación a 800 RPM y revuelva durante 30 minutos. A continuación, añada 0,4 mililitros de manitol al 15% y remueva después de cinco minutos. Transfiera la mezcla de reacción a un tubo de fuga de 1,5 mililitros y centrifugue a 16.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y use una pipeta para eliminar la última gota de líquido. Agregue lentamente 0,2 mililitros de manitol al 5% y suspenda el pellet con una jeringa de aguja de calibre 29 de 0,5 mililitros. A continuación, añada un mililitro adicional de manitol al 5% antes de centrifugar.

Una segunda vez a 16.000 GS durante 15 minutos. Después de repetir el proceso de centrifugación en suspensión Resus, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 0,2 mililitros de manitol al 5%. El tamaño de partícula y el potencial zeta se analizan mediante dispersión dinámica de luz y dispersión electroforética de luz, respectivamente.

Para comenzar, seleccione un procedimiento de operación de la lista SOP, que contiene parámetros para la medición del tamaño de partícula a través de la dispersión dinámica de la luz. Como se indica en el protocolo de texto, diluya la muestra de partícula alfa SD F1 con agua. A continuación, cargue 100 microlitros de la muestra en un UV Q Vet desechable, como un Einor Q Vet.

Inserte el Q vet en el soporte de celdas y espere a que el ajuste de intensidad alcance el óptimo antes de comenzar la adquisición de datos. Una vez completada la medición, registre los resultados acumulados del diámetro y el índice de dispersión de polietileno. Promedie los resultados obtenidos de cada una de las cuatro lecturas repetidas y calcule la desviación estándar para la medición del potencial zeta a través de la dispersión electroforética de la luz.

Cargue 500 microlitros de la muestra de partículas diluidas diez veces en la celda de flujo. Seleccione un procedimiento de operación de la lista de SOP de potencial Zeta, que contiene parámetros para la medición tal como se enumeran en el protocolo de texto. Registre los resultados del potencial zeta.

A continuación, promedie los resultados obtenidos de cada una de las cinco lecturas repetidas y calcule la desviación estándar. Calentar las muestras diluidas de SD F1 alfa libre y unido a partículas en tampón de muestra laly a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Agite las muestras dos veces durante el calentamiento de 10 minutos para disociar las partículas por completo después de enfriar las muestras a temperatura ambiente durante dos minutos, la centrífuga tenía 10, 000 Gs durante 0.5 a un minuto para bajar el vórtice de condensado de agua nuevamente para mezclar bien.

En este punto, la solución de muestra debe ser clara sin la presencia de precipitado visible. A continuación, cargue 10 microlitros de muestra por pocillo en un gel de sulfato ESAL o SDS de cuatro a 20% de sodio. Ejecute la electroforesis a 200 voltios durante 20 minutos antes de teñir el gel con tinción de proteína azul de kumasi.

Examine la densidad de bandas proteicas de SD F1 alfa utilizando un generador de imágenes moleculares y un software de análisis de densitometría. Calcule la cantidad de S DF un alfa en las partículas contra una curva estándar construida con patrones libres de SDF un alfa para realizar el ensayo de liberación in vitro mezcle partículas de glicanos alfa SD F1 con tampón de fosfato docos, solución salina sin calcio y magnesio o DPBS en una proporción de uno a uno. Divida la suspensión de partículas en alícuotas de 0,05 mililitros en tubos de 1,5 mililitros.

Cargue las muestras en el fondo de los tubos. Evite introducir burbujas de aire o perturbar la superficie del líquido. Selle la parte superior de los tubos con paraform.

A continuación, gire los tubos a 37 grados centígrados en un mezclador de microtubos giratorio. Retire las alícuotas de los tubos en los momentos designados e inmediatamente centrifugue las muestras a 16.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados después de la centrifugación. Separe los sobrenadantes y los pellets.

A continuación, reconstituya el pellet con 0,05 mililitros de DPBS. Después de recolectar todas las muestras, examine los sobrenadantes y los gránulos en un gel SDS. Al igual que antes, este ensayo mide la actividad quimiotáctica de S df.

Una interacción alfa de S df un alfa con su receptor provoca la migración de la célula hacia el gradiente alfa SD F1. Para empezar, diluir libre o unido a partículas en forma SD F1 alfa con tampón de migración en una dilución en serie triple hasta las concentraciones finales enumeradas en el protocolo de texto. Agregue 0,6 mililitros de la solución alfa diluida SD F1 a un pocillo en la placa de 24 pocillos para el control negativo.

Haga lo mismo solo para el búfer de migración y, a continuación, agregue 0,57 mililitros de búfer de migración a un pozo para el control de la celda de entrada. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, coloque un inserto de cultivo celular permeable como transwell en la parte superior de la carga de pocillo inferior, 0,1 mililitros de células jerk hat en el inserto transwell.

A continuación, cargue 0,03 mililitros de celdas directamente en el control de celdas de entrada. Incubar bien la placa a 37 grados centígrados durante dos horas en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Después de la incubación, retire los insertos de cultivo celular.

Transfiera las células que han migrado a los pozos inferiores a un tubo de poliestireno de cuatro mililitros. Cuente las células migradas con un citómetro de flujo. Por último, calcule la migración como un porcentaje del número de celda de entrada después de restar los números de los controles negativos.

Aquí se muestra el análisis de la medición del tamaño de partícula de ozono SD F1 de sulfato de alfa dextrano. El resultado de CUMUL muestra que el diámetro hidrodinámico de la partícula es de 671 nanómetros y la dispersión poli es de 0,24. Esta captura de pantalla muestra una de las cinco mediciones repetidas del potencial zeta de las partículas de ozono de sulfato de hebra SD F1 alfa DExT.

El potencial zeta es de menos 24,7 milivoltios. La cantidad de S df un alfa en las partículas de ozono de sulfato de dexrán S df one alpha se estima mediante electroforesis en gel SDS. Aquí se muestra un gel SDS teñido con kumasi con muestras de nanopartículas de control de kaizan de sulfato de dextrano de patrones alfa SD F1 y nanopartículas de kaizan de sulfato de dextrano alfa SD F1 cargadas.

Se construye una curva estándar a partir del análisis de densidad de la SD F1 Alfa El cálculo de las bandas estándar de la curva estándar indica que la concentración de S DF un alfa en la muestra de nanopartículas alfa SDF es de 0,03 miligramos por mililitro. Para determinar la tasa de liberación in vitro de S DF un alfa de las nanopartículas, la cantidad de S DF un alfa liberado en el supernat y la cantidad de partículas unidas a sdf un alfa en los gránulos se determinó mediante tinción de kumasi de un gel SDS seguido de un análisis de citometría. La actividad de la partícula S DF un alfa se mide mediante un ensayo de migración y, en comparación con eso, un SDF libre un alfa como se muestra aquí.

El SDF unido a partículas un alfa indujo el mismo grado de migración que un FD libre un alfa en todas las concentraciones medidas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la formulación de las partículas de proteína glicano puede alterarse. Dependiendo de la aplicación específica, se pueden incorporar otras proteínas y se pueden utilizar diferentes formulaciones para variar el tamaño de partícula.

Esperamos que en este video se demuestren las técnicas básicas en la preparación de la recolección de nanopartículas y luego el análisis funcional del SDF uno alfa incorporado.