Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

El objetivo general del siguiente experimento es observar los cambios en la carga de la membrana celular después de la adherencia a diferentes sustratos materiales. Esto se logra mediante el cultivo de los microorganismos en un medio rico en nutrientes para aumentar su número. A continuación, las superficies del material a las que se adherirán los microorganismos se limpian y funcionalizan para obtener tasas óptimas de adhesión microbiana.

A continuación, los microorganismos se colocan en los distintos sustratos de material para permitir la microscopía de fuerza de sonda Kelvin o la obtención de imágenes KPFM. Los resultados muestran que el tipo de sustrato del material y su carga inherente tienen un efecto sobre la actividad celular, como se ve en los cambios en la carga de la membrana celular y la adherencia celular. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la electroforética, la dispersión de luz y la determinación de puntos isoeléctricos es que KPFM permite examinar la carga de células individuales y biopelículas en lugar de cultivos o colonias completas.

Esto es beneficioso cuando se desea comparar las características eléctricas de la célula a célula, así como de la biopelícula, con alta exactitud y precisión. Para comenzar, prepare placas de agar sangre de oveja al 5%, raye las bacterias MRSA en las placas preparadas e incube durante 24 horas a 37 grados centígrados para generar colonias individuales y bien aisladas. Prepare 500 mililitros de caldo de soja tríptico, suplementado con 1% de glucosa y 0,1% de cloruro de sodio en autoclave, junto con dos tubos de ensayo de vidrio limpio y una caja de sorbos de pipeta de un mililitro.

Después de dejar que el medio y los tubos de ensayo se enfríen debajo de una cabina de bioseguridad o cerca de un bollo y un quemador, pipetee seis mililitros de TSB en cada tubo de ensayo. Usando una de las placas de agar sangre de oveja previamente preparadas, inocule una sola colonia de MRSA en uno de los tubos. Utilice el segundo tubo como control negativo para garantizar la esterilidad, incube los tubos en una incubadora recíproca durante 24 horas a 37 grados centígrados y 200 RPM.

El tubo de SARM debe mostrar crecimiento o no debería haber crecido nada en el tubo de ensayo de control. A continuación, cree un subcultivo utilizando un mililitro del cultivo de 24 horas para inocular seis mililitros de caldo de soja tríptico fresco e incube a 37 grados centígrados y 200 RPM durante otras seis horas. A continuación, pipetear un mililitro del cultivo en un tubo de afus y centrifugar a 850 veces G durante tres minutos.

Retire el supinato y use agua desionizada para lavar el pellet dos veces con pinzas en la mano dominante. Sostenga un disco de muestra FM de acero inoxidable de 20 milímetros y use cinco mililitros de agua desionizada para limpiar cada lado. Coloque los discos limpios en un vaso de precipitados con agua desionizada y sonique durante un minuto después de la sonicación.

Utilice las pinzas para extraer los discos de muestra del vaso de precipitados y apóyelos en un ángulo aproximado de 60 grados contra el borde de una placa de Petri abierta sobre una toalla de papel Para secar completamente, utilice la tapa del plato para cubrir los discos de secado. Una vez seco, transfiera el disco a una placa de Petri para funcionalizar la superficie del disco. Pipetear de 200 a 400 microlitros de lisina de poliol al 0,1% en los discos en una cabina de bioseguridad y temperatura ambiente incubada durante una hora utilizando pinzas para sujetar los discos.

Use agua desionizada para lavarlos como se demostró anteriormente en este video. Siguiente placa, de 200 a 400 microlitros de células resuspendidas que se han lavado dos veces en los discos de muestra recubiertos. Después de incubar la temperatura ambiente durante 30 minutos, use suavemente un mililitro de agua desionizada para lavar los discos.

Deje que los discos se sequen durante la noche antes de obtener imágenes para realizar la obtención de imágenes de microscopía Kelvin Probe Force. Encienda la computadora junto con el microscopio de fuerza atómica o AFM, HEB y MAC tres controladores. Abra un software de imagen A FM como Ulence P ovu overview.

Seleccione A-C-A-F-M o la designación correcta para la obtención de imágenes en el modo de contacto intermitente. Usando una pinza FM en la mano dominante y sosteniendo el soporte de clip con resorte abierto en la otra mano, coloque con cuidado el voladizo A-K-P-F-M en el auricular. Cargue con cuidado el auricular en el A FM y conecte la luz láser y los cables del motor del elevador de escenario.

A continuación, alinee el láser con la punta del voladizo. Para alinear el láser en la punta del voladizo. Gire la perilla de adelante hacia atrás en el sentido de las agujas del reloj varias veces para mover el láser en la parte superior del chip en voladizo.

Cuando el láser llegue al chip, se bloqueará y ya no será visible. Luego gire la perilla de adelante hacia atrás en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que vuelva a aparecer el punto láser. El láser está ahora en el borde del chip.

Gire la perilla de izquierda a derecha para colocar el láser en el voladizo. A medida que el láser pasa por encima del voladizo, desaparecerá y reaparecerá en rápida sucesión. El punto láser debe ser visible en la cubierta de vidrio esmerilado donde se asentará más tarde la unidad de fotodiodo.

Gire la perilla de adelante hacia atrás en sentido contrario a las agujas del reloj para mover el punto por el voladizo hacia la punta hasta que desaparezca el punto en el vidrio esmerilado. Ahora gire la perilla de adelante hacia atrás en el sentido de las agujas del reloj solo ligeramente para colocar el láser de modo que se asiente justo en la punta del voladizo, el punto láser volverá a aparecer en el vidrio esmerilado. Una vez que el láser esté alineado, sostenga el motor de elevación de la etapa en la posición abierta durante 10 segundos para garantizar suficiente espacio entre el voladizo y la muestra.

Al conectar la muestra al A FM, ahora coloque la muestra en la platina KPFM. Utilice un cable de cobre para conectar a tierra la muestra y conecte los cables apropiados desde el A FM hasta la etapa de muestreo. A continuación, conecte el escenario a la A FM en el software A FM.

Asegúrese de que el tiempo de ajuste no supere los 10 milisegundos y que las velocidades de aproximación no superen las dos micras por segundo. Para evitar daños en la punta, ajuste el voladizo y comience a mover la punta del voladizo hacia la muestra. Una vez que la punta en voladizo alcanza una superficie de muestra, seleccione un tamaño de ventana de imagen y un área de imagen ideal, optimice las ganancias de ojo y P junto con el punto de ajuste del voladizo para que se optimicen las imágenes topográficas.

Cuando se optimizan las imágenes topográficas, encienda el módulo KPFM en modo FM. Ajuste la ventana de imagen a cinco micras por cinco micras con cinco velocidades de escaneo de resolución de 12 por cinco 12 o lentas. Para la configuración de FM KPFM, configure la unidad entre cinco y 10%Establezca la frecuencia de la unidad entre uno y cinco kilohercios con un ancho de banda de dos kilohercios.

Establezca las ganancias de NP de hierro para el F-M-K-P-F-M en 0.3%Después de adquirir imágenes KPFM, use el software de procesamiento posterior a la imagen para analizar las imágenes y recopilar datos SP utilizando la configuración descrita en esta demostración de video. Las imágenes de KPFM se tomaron en 15 celdas de MRSA en superficies de acero inoxidable y oro. A continuación se muestran los tipos de imágenes recopiladas.

Debido a que KPFM opera con frecuencias duales, se recopilaron simultáneamente imágenes topográficas y datos eléctricos de la superficie de la celda. Se aplicaron filtros térmicos a los mapas de potencial superficial para discernir más fácilmente pequeños cambios en el potencial superficial. En este gráfico, se analizaron las imágenes para determinar el potencial de superficie de la membrana microbiana y luego se utilizaron para comparar el crecimiento en diferentes sustratos.

Los escaneos de potencial superficial de los sustratos de acero inoxidable desnudo y oro desnudo mostraron potenciales superficiales negativos en general. Los discos de acero inoxidable y oro recubiertos de poliol lisina mostraron un cambio a potenciales superficiales positivos. Los potenciales de membrana celular de MRSA variaron entre las superficies de acero inoxidable y oro.

El acero inoxidable exhibe un potencial de superficie de membrana positivo significativamente mayor para las células en comparación con las células de SARM en el sustrato de oro que mostraron potenciales de superficie negativos. Para demostrar todas las capacidades de KPFM, aquí se ve un ejemplo de un gráfico de altura de escalón de MRSA en acero inoxidable. Esto muestra la diferencia en el potencial superficial entre la superficie del sustrato y la membrana microbiana.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la microscopía de fuerza de sonda Kelvin para examinar los efectos de la carga eléctrica en la unión y actividad de las células microbianas en diferentes superficies de sustrato de materiales.