Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

El objetivo general del siguiente experimento es observar los cambios en la carga de la membrana celular tras la adhesión a diferentes sustratos de material. Esto se logra cultivando los microorganismos en un medio rico en nutrientes para aumentar su número. A continuación, las superficies de material a las que se adherirán los microorganismos se limpian y funcionalizan para optimizar las tasas de adhesión microbiana.

Luego, los microorganismos se siembran sobre diversos sustratos de material para permitir la microscopía de fuerza con sonda Kelvin o imagenología KPFM. Los resultados muestran que el tipo de sustrato material y su carga inherente afectan la actividad celular, como se observa por cambios en la carga de la membrana celular y en la adherencia celular. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la electroforesis, la dispersión de la luz y la determinación del punto isoeléctrico es que la KPFM permite examinar la carga de células individuales y biopelículas, en lugar de cultivos o colonias completos.

Esto es beneficioso cuando se desea comparar célula a célula, así como las características eléctricas de biopelículas, con alta exactitud y precisión. Para comenzar, prepare placas de agar sangre de oveja al 5%, raye las bacterias MRSA sobre las placas preparadas e incube durante 24 horas a 37 grados Celsius para obtener colonias individuales bien aisladas. Prepare 500 mililitros de caldo de soya tripticasa, suplementado con glucosa al 1% y cloruro de sodio al 0,1%, esterilice en autoclave, junto con dos tubos de ensayo de vidrio limpios y una caja de puntas de pipeta de un mililitro.

Después de permitir que el medio y los tubos de ensayo se enfríen bajo una cabina de seguridad biológica o cerca de un mechero Bunsen, pipetee seis mililitros de TSB en cada tubo de ensayo. Utilizando una de las placas de agar sangre de oveja previamente preparadas, inocule una colonia individual de MRSA en uno de los tubos. Utilice el segundo tubo como control negativo para asegurar la esterilidad e incube los tubos en un incubador reciprocante durante 24 horas a 37 grados Celsius y 200 RPM.

El tubo de MRSA debe mostrar crecimiento o no debe haber crecido nada en el tubo de control. A continuación, cree una subcultura utilizando un mililitro de la cultura de 24 horas para inocular seis mililitros de caldo de soya tripticasa fresco e incubar a 37 grados Celsius y 200 RPM durante otras seis horas. Luego, pipetee un mililitro de la cultura en un tubo afus y centrifugue a 850 veces G durante tres minutos.

Retire el sobrenadante y use agua desionizada para lavar el precipitado dos veces con pinzas en la mano dominante. Sostenga un disco de muestra magnético de acero inoxidable de 20 milímetros y use cinco mililitros de agua desionizada para limpiar cada lado. Coloque los discos limpios en un vaso de precipitados con agua desionizada y someta a ultrasonido durante un minuto tras la sonicación.

Utilice la pinza para retirar los discos de muestra del vaso de precipitados y colóquelos en un ángulo aproximado de 60 grados contra el borde de una placa de Petri abierta sobre una toalla de papel. Para secarlos completamente, utilice la tapa de la placa para cubrir los discos mientras se secan. Una vez secos, transfiera el disco a una placa de Petri para funcionalizar la superficie del disco. Pipetee entre 200 y 400 microlitros de poliol lisina al 0,1 % sobre los discos dentro de una cabina de seguridad biológica e incube a temperatura ambiente durante una hora, utilizando la pinza para sostener los discos.

Utilice agua desionizada para lavarlos como se demostró anteriormente en este video. A continuación, plaque de 200 a 400 microlitros de células resuspendidas que han sido lavadas dos veces sobre los discos de muestra recubiertos. Después de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, lave suavemente los discos con un mililitro de agua desionizada.

Deje que los discos sequen durante la noche antes de la imagenología para realizar imágenes mediante microscopía de fuerza con sonda Kelvin. Encienda la computadora junto con el microscopio de fuerza atómica o AFM, el HEB y el controlador MAC tres. Abra un software de imagenología AFM, como Ulence P ovu overview.

Seleccione A-C-A-F-M o la designación correcta para la imagen en modo de contacto intermitente. Utilizando una pinza FM con la mano dominante y sosteniendo abierta la pinza con resorte con la otra mano, coloque cuidadosamente el cantiléver A-K-P-F-M en la pieza cabezal. Cargue cuidadosamente la pieza cabezal en el A FM y conecte los cables de la luz láser y del motor de elevación del escenario.

Luego alinee el láser con la punta del cantiléver. Para alinear el láser con la punta del cantiléver, gire el botón de adelante hacia atrás en sentido horario varias veces para mover el láser hacia la parte superior del chip del cantiléver.

Cuando el láser alcance el chip, será bloqueado y ya no será visible. Luego, gire el botón de adelante hacia atrás en sentido antihorario hasta que reaparezca el punto del láser. Ahora el láser está en el borde del chip.

Gire el mando de izquierda a derecha para posicionar el láser sobre el cantiléver. A medida que el láser pasa sobre el cantiléver, desaparecerá y reaparecerá en rápida sucesión. El punto del láser debe ser visible en la tapa de vidrio esmerilado donde posteriormente se colocará la unidad del fotodiodo.

Gire el botón de delante a atrás en sentido antihorario para mover el punto hacia abajo en el cantiléver, en dirección a la punta, hasta que el punto en el vidrio esmerilado desaparezca. Ahora gire ligeramente el botón de delante a atrás en sentido horario para posicionar el láser justo sobre la punta del cantiléver; el punto del láser reaparecerá en el vidrio esmerilado. Una vez alineado el láser, mantenga el motor del elevador de la platina en posición abierta durante 10 segundos para asegurar un espacio suficiente entre el cantiléver y la muestra.

Al colocar la muestra en el MF A, ahora coloque la muestra en la plataforma de MFKP. Utilice un cable de cobre para conectar la muestra a tierra y conecte los cables adecuados del MF A a la plataforma de la muestra. A continuación, conecte la plataforma al MF A mediante el software del MF A.

Asegúrese de que el tiempo de estabilización no supere los 10 milisegundos y de que las velocidades de aproximación no excedan dos micrómetros por segundo. Con el fin de evitar daños en la punta, sintonice el cantiléver e inicie el movimiento de la punta del cantiléver hacia la muestra. Una vez que la punta del cantiléver alcance la superficie de la muestra, seleccione un tamaño de ventana de imagen y un área de imagen ideal, y optimice las ganancias del ojo y de P, junto con el punto de referencia del cantiléver, para optimizar la imagen topográfica.

Cuando la imagen topográfica esté optimizada, active el módulo KPFM en modo FM. Establezca la ventana de imagen en cinco micrómetros por cinco micrómetros con una resolución de cinco 12 por cinco 12 o velocidades de escaneo lentas. Para los ajustes de KPFM en FM, fije la excitación entre el 5 y el 10 %. Establezca la frecuencia de excitación entre uno y cinco kilohercios con un ancho de banda de dos kilohercios.

Establezca las ganancias de las NP de hierro para F-M-K-P-F-M en 0,3 %. Después de adquirir las imágenes de KPFM, utilice un software de procesamiento posterior a la obtención de imágenes para analizarlas y recopilar datos de SP usando la configuración descrita en esta demostración en video. Se obtuvieron imágenes de KPFM de 15 células de SARM sobre superficies de acero inoxidable y de oro. A continuación se muestran los tipos de imágenes recopiladas.

Dado que la KPFM opera utilizando frecuencias duales, se recopilaron simultáneamente imágenes topográficas y datos eléctricos de la superficie celular. Se aplicaron filtros térmicos a los mapas de potencial de superficie para discernir más fácilmente los pequeños cambios en el potencial de superficie. En esta gráfica, las imágenes se analizaron para determinar el potencial de superficie de la membrana microbiana y luego se utilizaron para comparar el crecimiento en diferentes sustratos.

Los escaneos del potencial superficial de los sustratos de acero inoxidable desnudo y oro desnudo mostraron potenciales superficiales negativos en general. Tanto los discos de acero inoxidable como los de oro recubiertos con lisina poliol exhibieron un desplazamiento hacia potenciales superficiales positivos. Los potenciales de la membrana celular de MRSA variaron entre las superficies de acero inoxidable y oro.

Con el acero inoxidable que exhibe un potencial de superficie de membrana positivo significativamente mayor para las células en comparación con las células de MRSA sobre el sustrato de oro, que mostraron potenciales superficiales negativos. Para demostrar las capacidades completas de la microscopía de fuerza de Kelvin (KPFM), aquí se muestra un ejemplo de una gráfica de altura de escalón de MRSA sobre acero inoxidable. Esto muestra la diferencia en potencial de superficie entre la superficie del sustrato y la membrana microbiana.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la microscopía de fuerza con sonda Kelvin para examinar los efectos de la carga eléctrica sobre la adhesión y la actividad de las células microbianas en diferentes superficies de materiales.