Microdisección de captura por láser - Una demostración del aislamiento individual de dopamina neuronas y el Área ventral tegmental completo

El objetivo general de este procedimiento es aislar las neuronas de dopamina de secciones de tejido en portaobjetos. Esto se logra seccionando primero el tejido del mesencéfalo ventral congelado en portaobjetos estilizados o portaobjetos de membrana de pluma. A continuación, las neuronas dopaminérgicas se marcan con una inmunohistoquímica fluorescente rápida.

A continuación, el tejido se deshidrata y se carga en el microscopio de captura láser. A continuación, las neuronas dopaminérgicas marcadas se unen a la tapa LCM mediante el láser infrarrojo y se aísla el ARN o molécula de interés. Los resultados demuestran que se puede obtener ARN en cantidad y calidad suficientes para mediciones cuantitativas de PCR utilizando microscopía de captura láser.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la disección macroscópica o los micropunzones, es que las poblaciones celulares individuales pueden ser regiones cerebrales aisladas o muy discretas. Para prepararse para el aislamiento de ARN, sumerja los portaobjetos de preparación de selina o de metilato de polietileno o portaobjetos de vidrio de membrana de pluma en la solución de descontaminación y use agua libre de ARN para lavarlos tres veces usando una serie graduada de ARN etanol libre, deshidrate los portaobjetos y séquelos al vacío durante 30 minutos con un criostato, corte secciones de tejido de 10 micras de espesor y móntelas en ARN preparados. Los portaobjetos libres mantienen las muestras congeladas durante el corte para preservar la calidad del ARN.

A continuación, realizar la inmunohistoquímica. Use un bolígrafo hidrofóbico para delinear el tejido y déjelo secar en una solución de acetona y metanol uno a uno. Fije el pañuelo a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos Después de sacar el pañuelo del congelador, cubra las secciones con 100 a 200 microlitros de anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa NPBS y 1% tritton durante 10 minutos.

A continuación, utilice PBS con 1%tritton para enjuagar los portaobjetos antes de cubrir las secciones con 100 a 200 microlitros de IgG anti conejo de cabra, etiquetados con Alexa Fluor 4 88 incubar durante cinco minutos y luego utilizar PBS para enjuagar los portaobjetos dos veces. A continuación, deshidrate las muestras integradas en series de ARN libres de etanol durante 30 segundos cada una, como se demostró anteriormente en este vídeo. Incubar en xileno durante un minuto y segundo, lavar durante cinco minutos.

Retire los portaobjetos inmediatamente antes de usarlos para LCM y déjelos secar al aire. Después de cargar las tapas LCM y las correderas y configurar el sistema LCM de acuerdo con el protocolo de texto, ajuste y apunte la captura láser IR para obtener fuerza. Coloque la tapa en una región del portaobjetos alejada del tejido en la barra de herramientas del láser de captura.

Seleccione habilitar, ajuste el pulso de potencia y el número de impactos del láser. Dispare el láser IR cuando la tapa esté sobre una parte del portaobjetos sin tejido y verifique si el láser derrite lo suficiente la membrana de la tapa LCM. Después de ajustar la intensidad del láser IR, haga clic con el botón derecho y seleccione el láser de captura para apuntar el láser y realizar LCM en neuronas dopaminérgicas individuales fuera de los portaobjetos de preparación de la clina.

Comience por desplazarse a la región de interés para capturar las células para capturar células individuales de un lado de preparación de clinicia. En la barra de herramientas de microdisección, seleccione la pestaña LCM y, a continuación, el icono de punto único. A continuación, en la barra de herramientas del microscopio, use la pestaña del obturador para cambiar entre fluorescencia y campo claro con pestañas de filtros fluorescentes para elegir los filtros apropiados y use las pestañas de objetivos para cambiar la ampliación.

Una vez que las celdas de interés estén visibles en la ventana de video en vivo, ajuste el tamaño de la tinta plana utilizada para marcar las celdas de interés al tamaño aproximado de las celdas. Marque las celdas de interés seleccionando el icono de un solo punto y luego haciendo clic en las celdas. Una vez que las células estén marcadas en la barra de herramientas de microdisección, seleccione la pestaña de corte y captura y el láser IR disparará automáticamente a todas las células marcadas seleccionadas.

Mueva la tapa lejos de la sección y colóquela en una región abierta del portaobjetos para comprobar si las células se capturan en la tapa LCM. Cuando termine de recolectar tejido, mueva la tapa haciendo clic con el botón derecho en la tapa y seleccionando mover a y luego descargar como se describe en el protocolo de texto, use el portaobjetos procesado para inmunohistoquímica como guía para seleccionar la región de interés del tejido en la membrana de la pluma. En la barra de herramientas de microdisección, seleccione la pestaña de corte y captura, luego seleccione la pestaña de línea de corte y, utilizando el portaobjetos etiquetado con inmunohistoquímica como guía, delinee la región de interés bajo el objetivo 10 x.

Pruebe, dispare y apunte los láseres IR y UV como se demostró anteriormente. En este vídeo, en la barra de herramientas de microdisección, seleccione la pestaña Ir a capturar y cortar. A continuación, retire el capuchón LCM del tejido para determinar si el tejido se ha extraído de la sección y se ha unido al capuchón.

Cuando termine de recolectar tejido para quitar la tapa, haga clic derecho en la tapa y seleccione mover para luego descargar las micrografías en estas figuras demuestran que LCM es capaz de aislar neuronas dopaminérgicas inmunorreactivas de tirosina hidroxilasa individuales usando el láser IR o los láseres IR y UV porque el uso más común de las células en los tejidos aislados usando LCM es el análisis de ARN. Los procedimientos presentados se optimizaron para preservar la integridad del ARN, como se observa en una reducción relativa de la altura del pico RRNA 28 S en comparación con el pico 18 S, la calidad del ARN se redujo en las muestras de LCM con menor integridad después de la inmunohistoquímica, seguida de la fijación de acetona en comparación con el ARN cerebral completo. Para medir la cantidad de ARN obtenido de las neuronas adquiridas a través de L-C-M-R-N-A de las neuronas dopaminérgicas de la zona ventral verde azulado fuera de la preparación salina se aislaron portaobjetos en base a la curva estándar generada un total de 17,3, 24,8 y 50,9 picogramos por microlitro de 5, 100 y 200 neuronas dopaminérgicas respectivamente.

E utilizando QPCR para medir la calidad del ARN, se invirtió un rango de concentraciones de ARN y ARN del cerebro entero de las neuronas dopaminérgicas y se midió el gen beta actina a partir de estas mediciones, se calcularon concentraciones de tres punto 55, 6, 0,82 y 20 punto 58 picogramos por microlitro de 5, 100 y 200 neuronas dopaminérgicas respectivamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el microscopio de captura láser para aislar neuronas dopaminérgicas individuales o para aislar regiones de neuronas dopaminérgicas.