Una Perspectiva Técnica en Modern Árbol-anillo de Investigación - Cómo superar dendroecológica y madera anatómicas Desafíos

El objetivo general del siguiente experimento es generar madera bien replicada y altamente resuelta. Un conjunto de datos anatómicos para estudiar los efectos del tiempo y los factores ambientales en el crecimiento de árboles y arbustos. Esto se logra mediante el uso de un fluido no newtoniano para estabilizar las células vegetales durante el corte de micrótomos, lo que permite un análisis microscópico detallado de las muestras como segundo paso.

Las microsecciones se tiñen dos veces para facilitar la diferenciación de las células lignificadas y no lignificadas, y luego se toman imágenes digitales de las muestras. En última instancia, se pueden realizar análisis automatizados basados en células del crecimiento de la planta y análisis de series temporales relacionados para permitir la evaluación de los parámetros anatómicos de la madera de interés. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el envío de la muestra, es que con nuestras técnicas, las células no se llenan de aserrín, lo que da como resultado muestras de mucha calidad clara para el análisis de imágenes.

Además, la adición de un fluido no Newton a las células durante el corte permite evitar la técnica de incluir la muestra en parafina, que requiere mucho tiempo. Los nuevos micrótomos que veremos en el vídeo fueron desarrollados en nuestro laboratorio incorporando el centro de Lu Netti de los Shang Dubs y Zurich. Destacan por una alta estabilidad de la guía, que permite el corte de ejemplares grandes y densos.

Para el muestreo de núcleos de tallos de árboles. Comience colocando un núcleo de incremento afilado perpendicular al eje de crecimiento del tallo del árbol. A continuación, gire el núcleo y use un extractor para eliminar la muestra de núcleo resultante del árbol.

Etiquete el núcleo con una identificación específica marcada con lápiz suave en la superficie del núcleo y repita el procedimiento en el lado opuesto del tallo cuando se hayan recolectado todas las muestras. Guarde los núcleos etiquetados en un recipiente adecuado para protegerlos de daños durante el transporte. Luego, una vez de vuelta en el laboratorio, monte las muestras de núcleo en la dirección de la fibra, en posición vertical sobre vigas de soporte de madera con pegamento para madera resistente al agua, y déjelas secar para el muestreo de micronúcleos.

Primero, use un cincel para quitar una parte de la corteza según sea necesario. Luego coloque un dispositivo de perforación especial perpendicular al eje de crecimiento en el tallo que acaba de demostrar, y use un martillo para penetrar el xilema del tallo hasta unos dos centímetros de profundidad. Gire el dispositivo de perforación para romper el micronúcleo resultante dentro de la herramienta.

A continuación, retire el núcleo del tallo y guárdelo en un tubo de microcentrífuga etiquetado. Para cortar una superficie plana en una muestra de núcleo, comience fijando el núcleo de incremento de interés en el soporte de núcleo de un micrótomo de núcleo recientemente desarrollado para cortar superficies planas en núcleos en toda su extensión. A continuación, levante el núcleo hasta que toque ligeramente la hoja, que está fijada en una guía de rodamiento de bolas sobre la extensión del núcleo, y tire de la hoja para cortar la primera parte de la parte superior del núcleo.

A continuación, empuje el cuchillo detrás del núcleo. Levante el portamuestras unas 10 micras y repita el procedimiento de corte hasta aproximadamente un tercio del núcleo. El diámetro se reduce, lo que da como resultado una superficie plana continua.

Para un análisis detallado de la estructura anatómica de las muestras, se deben preparar microsecciones con otro tipo de micrótomo. Primero, fije la muestra central de interés en el soporte del micrótomo del micrótomo. A continuación, coloque la cuchilla del micrótomo guiada por la guía del rodamiento de bolas y tire de la cuchilla sobre el núcleo.

Empuje la cuchilla hacia atrás para levantar la muestra de 20 a 30 micras. A continuación, tire de la cuchilla sobre la muestra. Nuevamente, repita este proceso hasta que se cree una superficie continua en la parte superior de la muestra.

Ahora, con un pincel, cubra la superficie resultante con una solución de almidón de maíz. A continuación, levante la muestra 15 micras y coloque el cepillo sobre la superficie de la muestra. Tire de las cuchillas lentamente hacia la muestra, comenzando un corte delgado debajo del pincel y usando el cepillo para guiar la sección en la superficie de la cuchilla cuando se haya cortado toda la sección.

Use otro cepillo y agua para quitar el tejido de la cuchilla y colóquelo en un portaobjetos de vidrio para permitir la distinción entre las estructuras lignificadas y no lignificadas. Lave el glicerol con agua con una pipeta. A continuación, cubre la sección húmeda con unas gotas de una mezcla de azafrán y azul astro.

Pasados cinco minutos, lavar los tintes con agua y deshidratar inmediatamente la sección con sucesivos tratamientos con etanol. Después del tratamiento con etanol deshidratado, enjuague la sección repetidamente con 100%xol. Tan pronto como el xol permanezca despejado.

Cubra el pañuelo con una gota de bálsamo 100% Canadá y un cubreobjetos teniendo cuidado de evitar burbujas de aire. A continuación, coloque el micro portaobjetos resultante entre dos tiras de plástico resistente al calor y colóquelo sobre una placa metálica. Coloque un peso encima del portaobjetos para mantener la sección plana y luego coloque el portaobjetos en un horno a 60 grados centígrados.

Después de 12 horas, deje que el portaobjetos se enfríe a temperatura ambiente y luego retire el peso y la tira de plástico. Finalmente, limpie el portaobjetos con cuchillas de afeitar para eliminar cualquier exceso de bálsamo siguiendo los procedimientos de corte y tinción presentados antes de que se puedan preparar todo tipo de muestras de diferentes tamaños y formas, también mediante el uso de soportes especiales para crear imágenes digitales de las superficies del núcleo para el análisis de recipientes. Primero, corte el plano de la superficie del núcleo con el micrótomo del núcleo como se acaba de demostrar, y use un marcador de fieltro para teñir la superficie resultante de negro.

Tan pronto como el tinte se seque, frote la superficie del núcleo con tiza blanca y luego presione la tiza en las celdas con un dedo. Retire cualquier exceso de tiza y luego coloque el núcleo en la plataforma de un microscopio binocular equipado con una cámara digital comenzando en un lado del núcleo. Ahora adquiera una secuencia de imágenes ligeramente superpuestas hasta que se capture toda la superficie.

A continuación, une las imágenes individuales para crear una imagen completa de la superficie del núcleo y crear imágenes digitales a partir de las microdiapositivas. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y elija el aumento adecuado para las estructuras a analizar. Finalmente, adquiera imágenes superpuestas de las secciones montadas en los microportaobjetos limpios, como se acaba de demostrar para la muestra de la superficie del núcleo, y una las imágenes para crear una imagen completa de la sección.

La capacidad de tener células abiertas es un primer paso importante hacia la adaptación de las estructuras dendroecológicas anatómicas a un análisis de series temporales. Para un análisis más detallado de las traqueosas de madera temprana o tardía en coníferas, se necesitan microsecciones de alta calidad. Deben evitarse los posibles artefactos, como las paredes celulares rotas.

La aplicación de un fluido no newtoniano a la muestra, como la solución de almidón de maíz, como se acaba de demostrar, apoya la estabilidad de la estructura celular. Las microsecciones permiten una determinación más segura de los rangos anuales. Esto es especialmente cierto para las coníferas que crecen en sus límites naturales.

Como se ve aquí, los anillos extremadamente estrechos son frecuentes pero difíciles de detectar macroscópicamente. En casos extremos, los anillos constan de una o dos filas de celdas, que solo pueden ser visibles cuando se usan microsecciones. Al analizar imágenes con grandes aumentos, se ven células individuales.

El software de análisis semiautomático permite determinar los cambios en parámetros individuales, como el grosor de la pared celular, para todos los anillos visibles dentro de la imagen, lo que indica la necesidad de un análisis de series temporales ampliado. La doble tinción de las micro secciones permite la visualización de las diferentes etapas de la lignificación. Esta información se puede relacionar con los datos ambientales del período de vegetación respectivo para determinar una relación de crecimiento climático más detallada después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ecología DRO exploraran los diversos parámetros anatómicos de árboles y arbustos. El uso de este método reduce drásticamente el tiempo necesario para producir secciones grandes y de alta calidad. Siempre se deben tomar precauciones como trabajar debajo de una campana extractora y usar guantes mientras se realiza este procedimiento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar conjuntos de datos anatómicos bien replicados y altamente resueltos para respaldar el análisis de series temporales.