Name: La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprende a identificar interacciones químico-genéticas en Saccharomyces cerevisiae mediante ensayos de hipersensibilidad. Este método permite revelar genes esenciales para la tolerancia a compuestos químicos específicos.

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La investigación en el laboratorio de CJN con el apoyo de subvenciones de funcionamiento de NSERC, el Instituto Canadiense del Cáncer Research Society (CCSRI) y la Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

NOTA: El flujo de trabajo general de este procedimiento se describe en la Figura 2. 1. Determinación de la dosis inhibidora del crecimiento <ol><li> Preparación de la levadura cultivo durante la noche NOTA: Los medios de crecimiento de la levadura-extracto-peptona-dextrosa (YEPD) utilizado en este protocolo es una receta estándar 13. <ol><li> Streak a las células en una placa de agar YEPD BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) y se incuba durante 48 horas a 30 ° C o hasta que se formen colonias visibles. </li><li> Preparar cultivos de una noche mediante la inoculación de 5 ml de medio líquido YEPD en un recipiente de cultivo estéril con una sola colonia. Incubar durante la noche a 30 ° C con rotación continua o agitación. La cultura se suele llegar a la saturación por la mañana (~ 2 × 10 8 células / ml). </li></ol></li><li> Preparación de medios de agar sólido que contiene dosis químicas diferentes <ol><li> Prepare varias poblaciones deel producto químico a ensayar en 100x concentración final deseada en un disolvente apropiado. NOTA: Las concentraciones eficaces dependerán de la química, y deben ser determinado empíricamente. Por tanto, es aconsejable probar inicialmente un amplio rango de concentración final; es decir, de baja M a alta mM. </li><li> Para cada concentración de producto químico a ensayar, alícuota de 3 ml de agar YEPD fundida a un tubo de cultivo estéril varios. Lugar en el 55 ° C baño de agua para mantener la solidificación. </li><li> Para cada concentración de producto químico a ensayar añadir 30 l de compuesto 100x a los medios fundidos, vórtice 2-3 segundos para mezclar, y pipeta de 1 ml en cada par de pocillos duplicados en una placa de 12 pocillos. Asegúrese de incluir un vehículo único control. Permitir a las placas reposar durante la noche a temperatura ambiente. Deseche cualquier medio extra. </li></ol></li><li> Células Spread chapado <ol><li> Inocular 10 ml de medio líquido YEPD con 2 l de un cultivo de levadura saturado, cultivadas durante la noche como en el paso 1.1.2. </li><li> Placa de 25 l de cultivo de levadura diluida por pocillo, distribuidos uniformemente usando perlas de vidrio estériles o varilla, y permiten que la placa se seque bajo una llama. Incubar la placa a 30 ° C durante 48 horas. </li><li> Evaluar el crecimiento de la levadura (tanto en número total y el tamaño de las colonias) en las placas. Seleccione una concentración subletal de compuesto que no inhibe el crecimiento en más de un 10% -15% para realizar la pantalla. </li></ol></li></ol> 2. Sistemática Pantalla Química Genética <ol><li> Mantenimiento de eliminación-mutante-array (DMA) y Preparación de Fuente Plate <ol><li> Para una descripción detallada de la construcción de matrices de mutantes de deleción de las existencias de glicerol consulte Baryshnikova et al. 14. Una vez mutantes de deleción han sido dispuestos a una densidad de 384 colonias por placa, la DMA se puede almacenar durante varios meses a 4 ° C. Replicar en agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418 si es necesario para prevenir el crecimiento de colonias en cadaotra. NOTA: Varias réplicas de serie se deben evitar para prevenir la pérdida de estirpes de crecimiento lento y minimizar la aparición de mutantes supresores. Esto es particularmente relevante si el mantenimiento de las colecciones como haploides. </li><li> Realice todos los pasos réplica de galvanoplastia utilizando un microbiana arraying sistema robótico. Alternativamente, manipular colonias utilizando herramientas manuales de colocación de clavos dispuestos. NOTA: La colección de deleción de levadura está disponible como haploides y diploides a partir de varias fuentes comerciales y se envía típicamente como stocks de glicerol en placas de 96 pocillos. </li></ol></li><li> Condensar el array mutante de deleción <ol><li> Preparar 250 ml de medio YEPD agar que contiene 200 mg / ml de G418. La concentración efectiva de G418 puede variar y cada lote debe ser probado empíricamente. </li><li> Preparar cinco placas de agar YEPD vertiendo 50 ml de agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418 por placa. Haga esto un día antes de condensar la matriz y permita que las placas se enfríen a temperatura ambientebibliografía durante la noche en una superficie plana. NOTA: Se requieren cuatro placas de la colección en la densidad de 1536-deformación, la quinta placa se vierte como extra. </li><li> Retire las 16 placas de Petri que contienen la colección mutante de deleción a una densidad de 384 colonias por placa y se deja llegar a temperatura ambiente (~ 1 h). </li><li> Limpiar cualquier condensación que se ha formado en la tapa de cada placa utilizando una tarea delicada toallita. El no hacerlo puede resultar en las gotas de agua que se deposita en la matriz y la contaminación cruzada de los mutantes dispuestos. </li><li> El uso de una matriz fijando robot microbiana, condensar el DMA de una densidad de 384 colonias por placa (16 platos de Petri) para 1536 colonias por placa (4 platos de Petri). Realice este modo que el 1 de colonia de la placa 1 pines a la fila 1 columna 1 de la matriz condensada, el 1 de colonia de la placa 2 a la fila 1 columna 2, el 1 de colonia de la placa 3 de fila 2 y la columna 1, y la colonia 1 de placa de 4 a la fila 2columna 2. </li><li> Incubar la matriz consolidada a 30 ° C durante la noche. </li><li> Examine la matriz para asegurar la transferencia uniforme de colonias de las placas de origen. Habrá varias posiciones en blanco, a propósito incorporados en la matriz, que sirven como una guía para asegurar la DMA se ha condensado correctamente (Figura 4A). NOTA: Estos serán los platos de origen de réplica en placa en medios que contienen el compuesto de ensayo. Una placa de una sola fuente puede ser utilizado para múltiples apuntalamientos. También muchos robots tendrán una función de compensación, lo que garantizará un número similar de levadura se están transfiriendo cada vez. </li></ol></li><li> Replica placa matriz mutante de deleción <ol><li> Preparar 700 ml de control (vehículo solo) y 700 ml de medio experimental (que contienen productos químicos). Esto es suficiente para realizar el ensayo por triplicado (12 placas por condición, además de dos extras). </li><li> Verter 50 ml de agar YEPD contengan la sustancia problema o control por placa. Permitir los platos to enfriar a temperatura ambiente durante la noche en una superficie plana. </li><li> Utilizando el robot para réplica de la placa, inocular el DMA en tres conjuntos de placas que contienen los productos químicos en la concentración determinado experimentalmente, así como tres conjuntos de placas que contienen el control del vehículo. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 24-48 horas. </li></ol></li></ol> 3. Las placas de imagen y análisis de datos <ol><li> Retire las placas de la incubadora y permitir que alcancen la temperatura ambiente (~ 1 hora) antes de la imagen. Esto evitará que se forme condensación mientras que las imágenes de las placas. </li><li> Las placas radiográficas a las 24 y 48 horas por retirar la tapa y colocar boca abajo en un escáner de cama plana. Captura imágenes a una resolución de al menos 300 dpi. También puede utilizar una cámara digital para capturar imágenes. Si al hacerlo, placas lugar boca arriba sobre un fondo oscuro y quitar las tapas de imagen. NOTA: El formato de archivo y la colocación de placas dependerán del programa de cuantificación utilizado. </li&gt; <li> Realizar la cuantificación y la comparación de tamaños de colonia de matriz utilizando uno de varios programas de código abierto, incluyendo Balony 15, SGAtools 16 y ScreenMill 17. </li></ol> 4. Validación de Pantalla NOTA: En esta etapa varias supresiones levaduras mutantes puntuarán como hipersensibilidad a la sustancia química de interés. Estas interacciones químicas genética próximo deben ser validados en dos maneras. En primer lugar la identidad de las cepas sensibles debe ser confirmada por PCR. En segundo lugar, la sensibilidad química debe ser puntuado de forma independiente. A continuación ofrecemos una breve protocolo para la realización de ensayos de manchado para validar hipersensibilidad cepa, una técnica común en la biología de la levadura. <ol><li> Streak cabo deseada (hipersensible) mutantes de la colección de levadura supresión en agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418. Se incuba a 30 ° C hasta que se formen colonias. Verificar el genotipo de la cepa por PCR con cebadores de diagnóstico segúnel protocolo del fabricante. </li><li> Inocular 5 ml del líquido YEPD para cada cepa e incubar durante la noche a 30 ° C con rotación o agitación. </li><li> Mide 600 OD y diluir cada cepa a OD 600 = 1 en DH estéril 2 O. Estos son ahora los cultivos de levaduras normalizados. </li><li> Prescindir de 100 l de normalizado levadura de tipo salvaje (BY4741) cultura para así A1 de una placa de 96 pocillos. Prescindir de 100 l de hasta siete cepas adicionales de pozos B1-H1. </li><li> Utilice una pipeta multicanal para dispensar 90 l de dH 2 O estéril para pozos A2-H2 a través A6-H6. Finalmente, preparar una serie de diluciones 1:10 de cultivos de levadura normalizados. Iniciar pipeteando en serie 10 l de la columna 1 a la columna 2 con una pipeta multicanal, y continuar a través de la placa de 96 pocillos hasta que se hagan seis diluciones (es decir, 10 0 a 10 -5). </li><li> Transferencia de 2-5 l de cultivos de levadura diluidas en una cuadrícula utilizando un multicanalpipeta sobre YEPD medios sólidos que contienen sustancias químicas y el control del vehículo. Incubar las placas a la temperatura adecuada durante 24-48 h. </li><li> Inspeccionar placas y comparar la sensibilidad de seleccionar mutantes para química (en relación con BY4741 control). Las placas radiográficas a las 24 y 48 horas como en el paso 3.2. NOTA: Si bien la identificación de varias cepas hipersensibles con ontologías de genes relacionados o funciones presta confianza para la validez de la pantalla, se requiere la transformación de una cepa de deleción hipersensibles con un plásmido que contiene una copia de tipo salvaje del gen para establecer formalmente que un gen eliminación de interés (y las mutaciones no ocultos segundo sitio) provoca sensibilidad a los fármacos. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Esbozado aquí es un enfoque para la generación de perfiles de interacción química y genética. El método es simple: mediante la comparación de tamaños de colonia de cada cepa en colecciones integrales de supresión de genes en presencia y ausencia de un producto químico, todos los genes necesarios para tolerar un insulto química se identifican. Análisis de enriquecimiento de anotación de la lista resultante de cepas sensibles a continuación, se puede utilizar para proporcionar información sobre un modo de productos químic...

Las herramientas genéticas y los recursos disponibles en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae han permitido a gran escala estudios de genómica funcional que proporcionan colectivamente una nueva visión de cómo los genes funcionan como redes para cumplir con los requisitos de los sistemas biológicos. La piedra angular de estas herramientas fue la creación en colaboración de un conjunto completo de no esenciales supresiones de genes de todos los marcos de lectura abierta en la levadura 1,2. Una observación sorprendente fue que sólo ~ 20% de los genes de levadura se requiere para la viabilidad cuando se cultiva como haploides en condiciones estándar de laboratorio. Esto pone de relieve la capacidad de una célula para amortiguar contra perturbaciones genómico a través de la utilización de las vías biológicas alternativas. Mutantes genéticos que sean viables individualmente, pero letal en combinación, señalan caminos biológicos paralelos conectados o convergentes y forman redes de interacción genéticos que describen la función biológica. Con el desarrollo de te condicionalalelos mperatura sensibles y hypomorphic de genes esenciales de la tecnología no se ha limitado al estudio de los genes no esenciales 3,4. Este concepto ha sido aplicado en una escala genómica producir un imparcial mapa interacción genética que ilustra cómo los genes implicados en los procesos celulares similares se agrupan 5. Perturbaciones químicas de redes genéticas imitan supresiones de genes (Figura 1) 6. Consulta de compuestos inhibidores del crecimiento contra un array de alta densidad de cepas de deleción para la hipersensibilidad identifica un perfil de interacción química y genética, es decir, una lista de genes que se requiere para tolerar el estrés químico. Al igual que las interacciones genéticas, pantallas de gran escala de las bibliotecas químicas han demostrado que los compuestos con un modo similar de racimo acción juntos 7. Por lo tanto, mediante el establecimiento del perfil de interacción química y genética de un compuesto el modo de acción se puede deducir mediante la comparación con LARinteracción genética genética y química sintética ge-escala datasets 8,9. Pantallas de química y genética a gran escala, donde son interrogados decenas de compuestos, se han realizado ensayos de competición por código de barras. En este enfoque, la colección agrupada de las cepas de deleción se cultiva en masa durante varias generaciones en un pequeño volumen de medio que contiene una sustancia química. Dado que cada mutante de deleción alberga un código de barras genético único, la viabilidad / crecimiento de mutantes individuales dentro de la piscina de supresión cepas se realiza un seguimiento de microarrays o de alto rendimiento de secuenciación 10. Inferir la aptitud mediante el control de tamaño de las colonias de mutantes físicamente dispuestos cultivadas en agar sólido que contiene un compuesto bioactivo es también un método eficaz para identificar las interacciones química y genética 11,12. Este enfoque proporciona una alternativa rentable a la selección basada en la competencia y es muy adecuado para el ensayo de las pequeñas bibliotecas de productos químicos.Esbozado aquí es una metodología sencilla para producir una lista de interacciones químicas genética en S. cerevisiae que no se basa en la manipulación molecular o la infraestructura de biología. Se requiere sólo una colección deleción de levadura, un aparato de colocación de clavos robótico o manual, y el software de análisis de imagen disponible libremente.

<table><tbody><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Para medios líquidos/sólidos YEPD añadir hasta una concentración final del 1% (p/v)</td></tr><tr><td>Tyrptone Powder</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>Para medios líquidos/sólidos YEPD añadir hasta una concentración final del 2% (p/v)</td></tr><tr><td>Anachemia</td> de <td>dextrosa</td><td>31096-380</td><td>Para medios líquidos/sólidos YEPD, agregue una concentración final del 2% (p/v) &#8212; No lo haga en autoclave. Prepare la solución madre al 20%, filtre, esterilice y agregue a los medios después de esterilizar en autoclave.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>Para medios sólidos YEPD agregar al 2% de concentración final (w/v)</td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>Prepare 1,000x stock a 200&nbsp; mg/ml en dH2O y filtro esterilizante.</td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de 5 ml</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>robot de fijación de matriz microbiana de alto rendimiento</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&copy; Placa de Petri</td><td>Singer Instrumentos&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Caja de 200 platos</td></tr><tr><td>384 RePad de Pin Corto</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>Caja de 1,000 pads</td></tr><tr><td>1536 RePad de Pin Corto</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Caja de 1,000 almohadillas</td></tr><td colspan="4">Herramientas de fijación alternativas<tr>:</td></tr><tr><td>Sistemas Robtic Totalmente Automatizados</td><td>S& P robotics</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Varios sistemas automatizados de robótica e imaginación de manejo de colonias disponibles.</td></tr><tr><td>Herramientas de fijación manual</td><td>V& P Scientific http://www.vp-scientific.com</td><td></td><td>Herramientas y accesorios de replicación portátiles.</td></tr></tbody></table>

la rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determinar el modo de acción de los productos químicos bioactivos es de interés para una amplia gama de académico, farmacéutico, y los científicos industriales. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura en ciernes, es un modelo eucariota para la que una colección completa de ~ 6000 mutantes de deleción de gen y gen esencial hypomorphic mutantes están disponibles comercialmente. Estas colecciones de mutantes se pueden utilizar para detectar sistemáticamente la interacción química de genes, es decir, genes necesarios para tolerar una sustancia química. Esta información, a su vez, informa sobre el modo probable de acción del compuesto. Aquí se describe un protocolo para la identificación rápida de las interacciones químicas genética de la levadura en ciernes. Demostramos el método que utiliza el agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU), que tiene un mecanismo bien definido de acción. Nuestros resultados muestran que la TRAMP nuclear RNA se necesitan enzimas de exosoma y de reparación del ADN para la proliferación en presencia de 5-FU, que es coherente con m anterioricroarray enfoques basados ​​de códigos de barras químicos genéticos y de los conocimientos que el 5-FU afecta negativamente tanto el metabolismo de ARN y ADN. También se describen los protocolos de validación solicitada de estas pantallas de alto rendimiento.

Como una validación de este enfoque se realizó una pantalla genética química representante interacción del agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU) siguiendo el protocolo descrito anteriormente. 5-FU es conocido para interrumpir la timidilato sintasa, así como ADN y ARN metabolismo 18. Las interacciones genéticas químicas de 5-FU son bien estudiado y se han investigado mediante técnicas de microarrays de código de barras de la levadura utilizando ambas colecciones supresión heterocigotos y homocigotos ...

Aquí presentamos un método rentable para definir las interacciones químico-genéticas en levaduras en ciernes. El enfoque se basa en técnicas fundamentales en biología molecular de levaduras y es muy adecuado para la interrogación mecanicista de colecciones pequeñas y medianas de productos químicos y otros entornos de medios.

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar células de levadura para encontrar los procesos biológicos a los que se dirige una sustancia química de interés. Esto se logra determinando primero el perfil de dosis-respuesta de un producto químico para la levadura. El segundo paso es cultivar una colección completa de cepas knockout de genes de levadura en una dosis subletal de producto químico y en una placa de control.A continuación, se identifican los mutantes de levadura que son hipersensibles al producto químico. Esta lista se analiza bioinformáticamente para revelar todos los genes necesarios para tolerar el producto químico. El paso final es realizar una réplica biológica del experimento con bajo rendimiento.Esto valida cualquier interacción química genética encontrada. En última instancia, este método de cribado genético químico de alto rendimiento se utiliza para mostrar qué productos génicos y vías biológicas se utilizan para tolerar el producto químico de interés. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el crecimiento competitivo de mutantes con códigos de barras en cultivo líquido, es que no se requieren técnicas de biología molecular.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología química, como por ejemplo cómo una nueva molécula pequeña puede inhibir el crecimiento de las células eucariotas. Para comenzar, prepare un cultivo de levadura durante la noche con un rayado de 4 7 4 1 células en la placa A-Y-E-P-D e incube durante 48 horas a 30 grados centígrados o hasta que se formen colonias visibles. Cuando las colonias estén listas.Prepare cultivos líquidos durante la noche eligiendo una sola colonia e inoculando cinco mililitros de medio líquido YEPD en un recipiente estéril. Luego incubar durante la noche a 30 grados centígrados con rotación o agitación continua. A continuación, prepare medios sólidos de agar que contengan varias dosis del producto químico que se va a probar.Para ello. En primer lugar, prepare varias soluciones madre del producto químico de interés a 100 veces la concentración final en un disolvente adecuado. A continuación, para cada concentración que se va a probar, se colocan alícuotas tres mililitros de agar YEPD fundido en varios tubos de cultivo estériles.Base los tubos que contienen el agar en un baño de agua a 55 grados centígrados para evitar la solidificación del agar. Ahora, por cada concentración de producto químico que se va a probar a 13, la liberación blanca del compuesto 100 x a una alícuota de agar fundido tex, el tubo durante dos o tres segundos para mezclar y luego pipetear un mililitro de cada tubo en pocillos duplicados en una placa de 12 mundos, permitir que la placa se asiente durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, inocule 10 mililitros de medio líquido YEPD con dos microlitros del cultivo de levadura saturada durante la noche.A continuación, pipetee 25 microlitros de este cultivo sobre el agar que contiene el producto químico en los pocillos de la placa de 12 ballenas y extiéndalo uniformemente utilizando perlas de vidrio estériles o una varilla estéril. Deje que la placa se seque bajo una llama y luego incube la placa a 30 grados centígrados durante 48 horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, evalúe el número total y el tamaño de las colonias en los pozos.Identifique una concentración subletal de compuesto que no inhiba el crecimiento en más del 10 al 15% para usar en la pantalla. Mantener la tasa de mutantes de deleción a una densidad de 384 colonias por placa replicando en 16 placas de agar YEPD, que contienen 200 microlitros por mililitro de G 4 18. Utilizando un sistema robótico de matrices microbianas o herramientas de fijación manual cada tres meses.Guarde los platos a cuatro grados centígrados hasta que se necesiten. A continuación, prepare 250 mililitros de medios de agar YEPD con la misma concentración de G 4 18 o cinco placas de agar, y déjelos enfriar durante la noche a temperatura ambiente sobre una superficie plana y uniforme. Retire las placas que contienen la colección de mutantes de deleción del almacenamiento a cuatro grados centígrados y permita que las placas alcancen la temperatura ambiente.Use una toallita delicada para eliminar cualquier condensación que se haya formado en la tapa de cada placa para evitar que las gotas de agua se depositen en la matriz y la contaminación cruzada de los mutantes de la matriz. Haga que el robot de fijación de matrices microbianas condense la matriz de mutantes de deleción de una densidad de 384 colonias por placa en 16 placas de Petri a 1.536 colonias por placa en cuatro placas de Petri. Después de incubar la matriz a 30 grados Celsius durante la noche, examínela para garantizar una transferencia uniforme de las colonias desde las placas fuente.Habrá varias posiciones en blanco incorporadas en la matriz, que sirven como guía de que la matriz mutante de deleción se ha condensado correctamente. Estas serán las placas de origen utilizadas para replicar en los medios que contienen su compuesto de interés. Se puede utilizar una sola placa de origen para varias fijaciones.Además, muchos robots tienen características de compensación que permitirán, lo que garantizará un número similar de levaduras transferidas cada vez. Para configurar la reparación de la matriz mutante de eliminación de placa réplica, 700 mililitros de vehículo de control solo y agar YEPD experimental que contiene el producto químico de interés. Esto es suficiente para realizar el ensayo por triplicado.Vierta las placas utilizando el agar control y experimental. Añadiendo 50 mililitros a cada plato. Deje que las placas se enfríen a temperatura ambiente durante la noche sobre una superficie plana y uniforme, utilizando el robot para relicar una placa.Inocular la matriz de doble mutante en tres conjuntos de placas que contienen productos químicos a la concentración determinada experimentalmente, así como reinicios de placas que contienen el control del vehículo. Incube las placas en la mesa de trabajo a temperatura ambiente durante un total de 24 a 48 horas de imagen. Las placas son de 24 y 48 horas de incubación quitando la tapa y colocándolas boca abajo en un escáner plano.Capture imágenes con una resolución de al menos 300 ppp. Alternativamente, use una cámara digital para capturar imágenes. Si lo hace, coloque los platos boca arriba sobre un fondo oscuro y retire las tapas a la imagen.A continuación, realice la cuantificación y comparación de los tamaños de las colonias de matrices utilizando uno de varios programas de código abierto, incluidas las herramientas SGA de bolas y el molino de cribas. En esta etapa, varios mutantes de deleción de levadura puntuarán como hipersensibles al químico de interés y eliminarán los mutantes hipersensibles deseados de la colección de deleción de levadura en YEPD. Los Ager que contienen 200 microgramos por microlitro de G 4 18 incuban a 30 grados centígrados hasta que se forman las colonias.Después de verificar el genotipo de la cepa mediante PCR diagnóstica y electroforesis de Gel, inocule cinco mililitros del líquido YPD con cada cepa e incube durante la noche a 30 grados centígrados con rotación o agitación. Mida el DO 600 de cada cultivo y diluya cada cepa hasta un DE 600 de una en agua destilada estéril. Estos son ahora los cultivos de levadura normalizados.A continuación, dispense 100 microlitros de tipo silvestre normalizado mediante 4 7 4 1 cultivo de levadura al pocillo A uno de una placa de 96 pocillos, dispense 100 microlitros de hasta siete cepas adicionales a los pocillos, B uno a H uno. A continuación, dispense 90 microlitros de agua estéril a los pozos, A dos a H dos a través de un seis a H seis. Por último, prepare una serie de una a 10 diluciones de esculturas G normalizadas.Comience pipeteando en serie 10 microlitros de la columna uno a la columna dos con una pipeta multicanal y continúe a través de la placa de 96 pocillos hasta que se realicen seis diluciones. A continuación, utilice la pipeta multicanal para dos a cinco microlitros de los cultivos de levadura diluidos en una rejilla en YEP D, medios sólidos que contienen productos químicos y control de vehículos. Incubar las placas a la temperatura adecuada durante 24 a 48 horas después de la incubación.Inspeccione las placas y compare la sensibilidad de los mutantes seleccionados a la sustancia química en relación con las placas de imagen de control BY 47 41 a las 24 y 48 horas. Al igual que antes, las siguientes imágenes muestran los resultados del procedimiento para determinar la concentración inhibidora de la subina del producto químico. La primera imagen muestra el crecimiento de un cultivo saturado BY 4 7 4 1 diluido de uno a 5, 000 y sembrado en concentraciones crecientes de cinco fluorouracilo.La concentración de 10 micromolares se selecciona como dosis inhibidora de sub-in. Esta imagen muestra la curva de crecimiento de las células BY 4, 7, 41 en medios líquidos que contienen cinco fluro uracilo. Aproximadamente cuatro veces 10 a las cuatro células se depositaron por triplicado y se midieron concentraciones crecientes de cinco fluorurouracilo y densidades ópticas cada 10 minutos durante 22 horas.De nuevo, se puede ver que la dosis de 10 micromolares es la dosis inhibidora de la subina. Las siguientes imágenes muestran los resultados de un verde de genética química de cinco fluorouracilo. Aquí, se muestra una matriz de mutantes de deleción de Sachar visier replicada en agar YPD que contiene 10 micromolares cinco uracilo fluorado a la derecha y control DMSO a la izquierda.Este gráfico muestra los resultados de la genética química verde, el crecimiento relativo de los mutantes en 10 micromolares. Cinco uracilos fluorados en comparación con el control DMSO se ordenan por la posición de un rayo aquí. El crecimiento relativo de los mutantes en 10 micromolares, cinco uracilos de flora en comparación con el control de DMSO se ordena según la proporción de tamaño de la colonia.En ambos gráficos se indica un umbral de relación inferior a 0,8. Esta imagen final muestra los resultados de tres ensayos de validación. Se cultivaron diluciones seriadas de varias cepas mutantes aisladas en el control de DMSO a la izquierda, 10 micromolares, cinco UIL fluorados en el centro y sulfonato de metil metano al 0,015% a la derecha.Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que está trabajando con una copia confiable de la matriz de mutantes de deleción para validar los resultados mediante una metodología independiente, como ensayos de detección de levadura o disección de tétrada de levadura. Esta técnica proporciona un medio eficiente para que los científicos en el campo de la investigación de moléculas pequeñas exploren el modo de acción de un compuesto utilizando enfoques a nivel de sistemas en levadura en ciernes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hemos desarrollado completa e imparcial en todo el genoma para comprender las pantallas de genes de drogas y las interacciones genético-ambientales. Métodos para la detección de estas colecciones mutantes se presentan.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes...

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

En este video, demostramos el ensayo de un híbrido de levadura modificada, que detecta múltiples proteínas que interactúan con el ADN objetivo. Las células de levadura transformadas contienen la secuencia de ADN diana aguas arriba del gen reportero. Además, expresan proteínas factores de transcripción. Cuando las proteínas forman complejos y se unen al ADN diana, el gen reportero se expresa y puede detectarse enzimáticamente.

Ensayo híbrido de levadura y uno modificado para detectar interacciones heteroméricas entre el complejo de proteínas y el ADN

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Presentamos un protocolo de pantalla simple supresor en fisión levaduras. Este método es eficiente, libre de mutágeno y selectivo para las mutaciones que ocurren a menudo en un locus genómico.  El protocolo es conveniente para aislar los supresores que paliar defectos de crecimiento en cultivo líquido que son causados por una mutación o una droga.

Una pantalla de supresor asistida por secuenciación profunda, espontánea en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe

La hemizigosidad recíproca a través de la secuenciación (RH-seq) es un nuevo y poderoso método para mapear la base genética de una diferencia de rasgos entre especies. Los grupos de hemizygotes son generados por la mutagénesis de la transposon y su estado físico es rastreado a través del crecimiento competitivo usando la secuenciación alta a lo largo de la secuenciación. El análisis de los datos resultantes identifica los genes subyacentes al rasgo.

Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma

Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.

Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras

Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), una centrifugación de gradiente de glicerol en presencia de un ticulador, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas.

Utilización de Grafix para la detección de interactores transitorios de subcomplejos de Saccharomyces cerevisiae Spliceosome

Este trabajo describe un protocolo para un cribado genético supresor multicopia en Schizosaccharomyces pombe. Esta pantalla utiliza una biblioteca de plásmidos de todo el genoma para identificar clones supresores de un fenotipo de pérdida de función asociado con una cepa mutante de consulta. Los nuevos supresores genéticos del mutante nulo ell1 se identificaron utilizando esta pantalla.

Cribado genético para la identificación de supresores multicopia en Schizosaccharomyces pombe

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a identificar interacciones químico-genéticas en Saccharomyces cerevisiae mediante ensayos de hipersensibilidad. Este método permite revelar genes esenciales para la tolerancia a compuestos químicos específicos.

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en

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