La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en

El objetivo general de este procedimiento es utilizar células de levadura para encontrar los procesos biológicos a los que se dirige una sustancia química de interés. Esto se logra determinando primero el perfil de dosis-respuesta de un producto químico para la levadura. El segundo paso es cultivar una colección completa de cepas knockout de genes de levadura en una dosis subletal de producto químico y en una placa de control.

A continuación, se identifican los mutantes de levadura que son hipersensibles al producto químico. Esta lista se analiza bioinformáticamente para revelar todos los genes necesarios para tolerar el producto químico. El paso final es realizar una réplica biológica del experimento con bajo rendimiento.

Esto valida cualquier interacción química genética encontrada. En última instancia, este método de cribado genético químico de alto rendimiento se utiliza para mostrar qué productos génicos y vías biológicas se utilizan para tolerar el producto químico de interés. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el crecimiento competitivo de mutantes con códigos de barras en cultivo líquido, es que no se requieren técnicas de biología molecular.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología química, como por ejemplo cómo una nueva molécula pequeña puede inhibir el crecimiento de las células eucariotas. Para comenzar, prepare un cultivo de levadura durante la noche con un rayado de 4 7 4 1 células en la placa A-Y-E-P-D e incube durante 48 horas a 30 grados centígrados o hasta que se formen colonias visibles. Cuando las colonias estén listas.

Prepare cultivos líquidos durante la noche eligiendo una sola colonia e inoculando cinco mililitros de medio líquido YEPD en un recipiente estéril. Luego incubar durante la noche a 30 grados centígrados con rotación o agitación continua. A continuación, prepare medios sólidos de agar que contengan varias dosis del producto químico que se va a probar.

Para ello. En primer lugar, prepare varias soluciones madre del producto químico de interés a 100 veces la concentración final en un disolvente adecuado. A continuación, para cada concentración que se va a probar, se colocan alícuotas tres mililitros de agar YEPD fundido en varios tubos de cultivo estériles.

Base los tubos que contienen el agar en un baño de agua a 55 grados centígrados para evitar la solidificación del agar. Ahora, por cada concentración de producto químico que se va a probar a 13, la liberación blanca del compuesto 100 x a una alícuota de agar fundido tex, el tubo durante dos o tres segundos para mezclar y luego pipetear un mililitro de cada tubo en pocillos duplicados en una placa de 12 mundos, permitir que la placa se asiente durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, inocule 10 mililitros de medio líquido YEPD con dos microlitros del cultivo de levadura saturada durante la noche.

A continuación, pipetee 25 microlitros de este cultivo sobre el agar que contiene el producto químico en los pocillos de la placa de 12 ballenas y extiéndalo uniformemente utilizando perlas de vidrio estériles o una varilla estéril. Deje que la placa se seque bajo una llama y luego incube la placa a 30 grados centígrados durante 48 horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, evalúe el número total y el tamaño de las colonias en los pozos.

Identifique una concentración subletal de compuesto que no inhiba el crecimiento en más del 10 al 15% para usar en la pantalla. Mantener la tasa de mutantes de deleción a una densidad de 384 colonias por placa replicando en 16 placas de agar YEPD, que contienen 200 microlitros por mililitro de G 4 18. Utilizando un sistema robótico de matrices microbianas o herramientas de fijación manual cada tres meses.

Guarde los platos a cuatro grados centígrados hasta que se necesiten. A continuación, prepare 250 mililitros de medios de agar YEPD con la misma concentración de G 4 18 o cinco placas de agar, y déjelos enfriar durante la noche a temperatura ambiente sobre una superficie plana y uniforme. Retire las placas que contienen la colección de mutantes de deleción del almacenamiento a cuatro grados centígrados y permita que las placas alcancen la temperatura ambiente.

Use una toallita delicada para eliminar cualquier condensación que se haya formado en la tapa de cada placa para evitar que las gotas de agua se depositen en la matriz y la contaminación cruzada de los mutantes de la matriz. Haga que el robot de fijación de matrices microbianas condense la matriz de mutantes de deleción de una densidad de 384 colonias por placa en 16 placas de Petri a 1.536 colonias por placa en cuatro placas de Petri. Después de incubar la matriz a 30 grados Celsius durante la noche, examínela para garantizar una transferencia uniforme de las colonias desde las placas fuente.

Habrá varias posiciones en blanco incorporadas en la matriz, que sirven como guía de que la matriz mutante de deleción se ha condensado correctamente. Estas serán las placas de origen utilizadas para replicar en los medios que contienen su compuesto de interés. Se puede utilizar una sola placa de origen para varias fijaciones.

Además, muchos robots tienen características de compensación que permitirán, lo que garantizará un número similar de levaduras transferidas cada vez. Para configurar la reparación de la matriz mutante de eliminación de placa réplica, 700 mililitros de vehículo de control solo y agar YEPD experimental que contiene el producto químico de interés. Esto es suficiente para realizar el ensayo por triplicado.

Vierta las placas utilizando el agar control y experimental. Añadiendo 50 mililitros a cada plato. Deje que las placas se enfríen a temperatura ambiente durante la noche sobre una superficie plana y uniforme, utilizando el robot para relicar una placa.

Inocular la matriz de doble mutante en tres conjuntos de placas que contienen productos químicos a la concentración determinada experimentalmente, así como reinicios de placas que contienen el control del vehículo. Incube las placas en la mesa de trabajo a temperatura ambiente durante un total de 24 a 48 horas de imagen. Las placas son de 24 y 48 horas de incubación quitando la tapa y colocándolas boca abajo en un escáner plano.

Capture imágenes con una resolución de al menos 300 ppp. Alternativamente, use una cámara digital para capturar imágenes. Si lo hace, coloque los platos boca arriba sobre un fondo oscuro y retire las tapas a la imagen.

A continuación, realice la cuantificación y comparación de los tamaños de las colonias de matrices utilizando uno de varios programas de código abierto, incluidas las herramientas SGA de bolas y el molino de cribas. En esta etapa, varios mutantes de deleción de levadura puntuarán como hipersensibles al químico de interés y eliminarán los mutantes hipersensibles deseados de la colección de deleción de levadura en YEPD. Los Ager que contienen 200 microgramos por microlitro de G 4 18 incuban a 30 grados centígrados hasta que se forman las colonias.

Después de verificar el genotipo de la cepa mediante PCR diagnóstica y electroforesis de Gel, inocule cinco mililitros del líquido YPD con cada cepa e incube durante la noche a 30 grados centígrados con rotación o agitación. Mida el DO 600 de cada cultivo y diluya cada cepa hasta un DE 600 de una en agua destilada estéril. Estos son ahora los cultivos de levadura normalizados.

A continuación, dispense 100 microlitros de tipo silvestre normalizado mediante 4 7 4 1 cultivo de levadura al pocillo A uno de una placa de 96 pocillos, dispense 100 microlitros de hasta siete cepas adicionales a los pocillos, B uno a H uno. A continuación, dispense 90 microlitros de agua estéril a los pozos, A dos a H dos a través de un seis a H seis. Por último, prepare una serie de una a 10 diluciones de esculturas G normalizadas.

Comience pipeteando en serie 10 microlitros de la columna uno a la columna dos con una pipeta multicanal y continúe a través de la placa de 96 pocillos hasta que se realicen seis diluciones. A continuación, utilice la pipeta multicanal para dos a cinco microlitros de los cultivos de levadura diluidos en una rejilla en YEP D, medios sólidos que contienen productos químicos y control de vehículos. Incubar las placas a la temperatura adecuada durante 24 a 48 horas después de la incubación.

Inspeccione las placas y compare la sensibilidad de los mutantes seleccionados a la sustancia química en relación con las placas de imagen de control BY 47 41 a las 24 y 48 horas. Al igual que antes, las siguientes imágenes muestran los resultados del procedimiento para determinar la concentración inhibidora de la subina del producto químico. La primera imagen muestra el crecimiento de un cultivo saturado BY 4 7 4 1 diluido de uno a 5, 000 y sembrado en concentraciones crecientes de cinco fluorouracilo.

La concentración de 10 micromolares se selecciona como dosis inhibidora de sub-in. Esta imagen muestra la curva de crecimiento de las células BY 4, 7, 41 en medios líquidos que contienen cinco fluro uracilo. Aproximadamente cuatro veces 10 a las cuatro células se depositaron por triplicado y se midieron concentraciones crecientes de cinco fluorurouracilo y densidades ópticas cada 10 minutos durante 22 horas.

De nuevo, se puede ver que la dosis de 10 micromolares es la dosis inhibidora de la subina. Las siguientes imágenes muestran los resultados de un verde de genética química de cinco fluorouracilo. Aquí, se muestra una matriz de mutantes de deleción de Sachar visier replicada en agar YPD que contiene 10 micromolares cinco uracilo fluorado a la derecha y control DMSO a la izquierda.

Este gráfico muestra los resultados de la genética química verde, el crecimiento relativo de los mutantes en 10 micromolares. Cinco uracilos fluorados en comparación con el control DMSO se ordenan por la posición de un rayo aquí. El crecimiento relativo de los mutantes en 10 micromolares, cinco uracilos de flora en comparación con el control de DMSO se ordena según la proporción de tamaño de la colonia.

En ambos gráficos se indica un umbral de relación inferior a 0,8. Esta imagen final muestra los resultados de tres ensayos de validación. Se cultivaron diluciones seriadas de varias cepas mutantes aisladas en el control de DMSO a la izquierda, 10 micromolares, cinco UIL fluorados en el centro y sulfonato de metil metano al 0,015% a la derecha.

Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que está trabajando con una copia confiable de la matriz de mutantes de deleción para validar los resultados mediante una metodología independiente, como ensayos de detección de levadura o disección de tétrada de levadura. Esta técnica proporciona un medio eficiente para que los científicos en el campo de la investigación de moléculas pequeñas exploren el modo de acción de un compuesto utilizando enfoques a nivel de sistemas en levadura en ciernes.