Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

Hola, mi nombre es Helen Kuster y estoy trabajando en el Grupo de Investigación Cardiovascular del Dr. Harold y profesora en la Universidad Auto Vica en MacBook. Estamos interesados en la caracterización del aislamiento de monocitos marinos con el fin de utilizarlos como vehículos en el crecimiento de vasos colaterales. Los siguientes pasos principales son necesarios para el cultivo de monocitos derivados de la médula ósea, primero la anestesia del ratón y la luxación cervical, la segunda extracción y el enjuague del fémur.

Tercer filtrado de la médula ósea. En cuarto lugar a los pasos de lavado con el medio quinto, cultivo de las células en placas de fijación ultrabajas. Sexta citometría de flujo.

Con el fin de extraer monocitos de la médula ósea, el ratón será anestesiado mediante el uso de flúor ISO y eutanasiado mediante luxación cervical. Se fijará el ratón y se separarán ambas extremidades inferiores con un bisturí de esteroides. Tanto el fémur como la tibia se cosecharon y lavaron con etanol al 96% de etano durante un mínimo de 90 segundos.

Después de esto, todos los pasos deben ser estrictamente estériles para evitar la contaminación. Se extirparán músculos o tendones del hueso. El fémur y la tibia se enjuagan con PBS tibio varias veces.

Para la extracción de la médula ósea, los extremos proximal y distal de cada hueso se cortan con unas tijeras finas. Para enjuagar el hueso, necesitamos una aguja esteroide de 28 G, una jeringa de un mililitro y entre 10 y 15 mililitros de medio por hueso. A continuación, se filtra la médula ósea a través de una S de 70 micrómetros mientras se sujeta el hueso con una pinza fina.

Enjuague los huesos uno por uno hasta que se vuelvan ilusos. Para minimizar el estrés celular, aplique presión con cuidado sobre el sello de la jeringa. Enjuague el tamiz con PBS.

A continuación, las células se centrifugan a 250 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. ¿Y los reus se suspenden con medio? Después de este paso, repita el paso una vez más.

Para los monocitos derivados de la médula ósea de la médula ósea nativa, utilizamos M 199 con 1% de penicilina y estreptomicina y 10% de suero fetal para la tos. Además, añadimos 20 nanogramos por mililitro de INE MCSF el primer día. En el último día de cultivo se añaden al medio ocho nanogramos por mililitro de interferencia gamma.

Si se desea una regulación al alza de MHC dos, las células se siembran en placas de fijación ultra bajas con pocillos gruesos para evitar la adhesión permanente al fondo. Utilizamos una concentración de una vez de 10 a seis células por mililitro con hasta seis mililitros por pocillo. El período de cultivo es de cinco días a una temperatura de 37 grados y 5% de dióxido de carbono.

Las células se revisan diariamente después de cinco días, entre el 60 y el 80% de las células son monocitos. Mi nombre es Martin Bachner y soy estudiante de medicina aquí en la Universidad Auto Fungi en el Departamento de Cardiología, Anología y Cronología. Y cuando se hace la inyección intravenosa, es importante practicar mucho antes de hacerla porque de lo contrario no se podrán aplicar los monocitos de forma adecuada.

Los experimentos han demostrado que los monocitos son más eficaces para mejorar la agenesia del arte cuando se aplican sistémicamente. Una forma común de aplicación sistémica de medicamentos es una inyección de cola WA. En nuestro caso, inyectamos 2,5 millones de monocitos, que son resuspendidos y cloruro de sodio.

Hay cuatro vasos en la cola de las arterias del ratón en el lado ventral y dorsal, y dos menguantes en el lado lateral. Entonces, para la inyección de WA, tenemos que girar la cola unos 90 grados. Para facilitar el procedimiento, el mouse debe calentarse con una almohadilla térmica durante unos 10 minutos.

Los animales deben ser observados por calentamiento. Esto es importante para reconocer signos de sobrecalentamiento. Además, necesitamos este agente infeccioso y una aguja de 30 genes colocada en una jeringa de insulina de un mililitro.

Fije al animal con cuidado en un sujetador, lo que hace que sea mucho más fácil inyectarlo en la cola. Asegúrese de que el ratón tenga suficiente espacio para respirar antes de cargar la solución en la jeringa. Vortex, la solución de monocitos para asegurarse de que todos los monocitos se puedan inyectar.

Desinfecta el sitio de inyección para evitar infecciones, tome la cola entre su golpe y su dedo índice. En el punto más distal, la aguja se inserta en un ángulo plano. Si se coloca en la vena, es muy fácil inyectar la solución de monocitos.

Si hay una ampolla, es un signo de una inyección incorrecta. Debe detenerse de inmediato y probar más. Proximal, procura inyectar siempre despacio y no más de cinco microlitros por gramo.

Si la inyección tuvo éxito, detenga el sangrado en el lugar de la inyección aplicando una presión suave durante aproximadamente un minuto. Al final del procedimiento, abra el retractor y coloque el ratón en su jaula para caracterizar los monocitos. Utilizamos los efectos con una combinación de antígenos, a saber, CD 11 B, F cuatro 80, CD 115 y GL uno.

La expresión de estos antígenos se correlaciona con una etapa de desarrollo para el análisis de los monocitos. Hicimos los hechos en el día 0, 3, 5 y siete, la pureza de los monocitos aumenta hasta un 90% en el día cinco. Para lograr esa pureza, es importante agotar fuertemente los macrófagos de la terrina.

Las células que no son de terrina se agotan mediante el uso de tampón de lavado sin EDTA. Para agotar las células de la terrina, estamos usando EDTA que contiene lavado, tampón y p. Este diagrama muestra los principales tipos de células para su cultivo de un extremo.

Los diferentes tipos de células que se muestran son un linfocito, dos monocitos, tres granulocitos, lo que aumenta la pureza de los monocitos después del quinto día. Y la cultura. Tenga en cuenta que la composición celular cambiante durante la población de células de cultivo incluye un monocitos y dos macrófagos.

Figura dos, línea de tiempo de la expresión de CD 115 durante la diferenciación. Tenga en cuenta que más del 95% de todas las células son CD 115 positivas después de cinco días de diferenciación, lo que indica que la gran mayoría de las células son monocitos o macrófagos. La clasificación puede basarse en el tamaño y la granularidad de las células, pero los marcadores celulares específicos son más fiables.

Figura tres, aumento de la expresión de la madurez de los macrófagos monocitos. El marcador F 4 80, día cinco, observa la aparición de una población con expresión intermedia de F 4 80, lo cual es consistente con el fenotipo de monocitos. Día siete, observe el desplazamiento a la derecha de la expresión de F four 80 consistente con la maduración de los macrófagos.

El aislamiento de monocitos es esencial para muchos estudios in vitro e in vivo. Estas células son un objetivo interesante, por ejemplo, en relación con enfermedades como la enfermedad arterial periférica o la enfermedad coronaria, que están relacionadas con la isquemia. La médula ósea de FEMA y la tibia de los ratones con biopsia se recolecta mediante el lavado de huesos con una suspensión celular de medio cálido, se complementa con MCSF y se cultiva en superficies de adhesión ultra bajas para evitar la adhesión, la diferenciación desencadenada de las propiedades de los monocitos y la diferenciación de los monocitos se verifica en diferentes momentos y los hechos con marcadores como CD 11 b, CD 115 y FO 80 se utilizan para fenotipar las células.

Si se desea la administración sistémica de fármacos, la inyección intravenosa es una forma fácil y eficaz de hacerlo. Describimos el método para aislar grandes cantidades de monocitos MI de la médula ósea de una manera sencilla y rentable. Con este nuevo método, somos capaces de generar alrededor de 11 millones de monocitos por ratón.