Name: Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprende a aislar e inyectar intravenosamente monocitos derivados de médula ósea murina para investigación cardiovascular. Este protocolo reduce costos y sacrificio animal en estudios de crecimiento vascular.

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Este trabajo fue apoyado por la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundación Alemana de Investigación) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de investigación colaborativo). 
Gracias a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Universidad Otto-von-Guericke de Magdeburgo, Magdeburgo, Alemania, por su soporte técnico.

Este estudio se realizó con permiso del Estado de Sajonia y Sajonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, de acuerdo con el Artículo 8 de la Ley alemana de protección de los animales (24D-9168,11-1 / 2008-24). Aislamiento 1 celular 1.1 Preparación de fémur y la tibia <ol><li> Anestesiar al ratón usando una concentración de isoflurano 5% mediante la vaporización de isoflurano en un contenedor cerrado. Después de que el ratón ha dejado de moverse durante 3 segundos, realice la dislocación cervical. </li><li> Desinfectar las extremidades traseras con etanol (96%). Quite la piel y los músculos y separar los huesos con un bisturí estéril. <ol><li> Comience con una incisión en la piel inguinal, y extender la incisión hacia el maléolo interno y realizar una disección circular de la piel alrededor de la pantorrilla. Retire la piel de las piernas completamente por pelarla proximal. </li><li> Separe el músculo cuádriceps del fémur con un bisturí afilado, eliminar tanto las peroneo anteriory los grupos de músculos gastrocnemios y desarticular la pierna en la articulación de la cadera mediante la localización y la disección de los ligamentos. </li><li> Iniciar anterior y proceder alrededor de la articulación, girando con cuidado la pierna y seccionar los ligamentos, desarticulando con ello la articulación. </li></ol></li><li> Lavar fémur y la tibia con etanol al 96% durante un mínimo de 90 segundos para garantizar la preparación de células aséptico. Continuar el proceso de lavado con PBS estéril para enjuagar el etanol restante. Nota: Todas las etapas posteriores deben ser estériles para evitar la contaminación. </li></ol> 1.2 La recolección de médula ósea <ol><li> Cortar el extremo proximal y distal de cada hueso con un par de tijeras finas para obtener acceso a los ejes femoral y tibial. Tenga cuidado con este paso, ya que estos huesos se rompen con mucha facilidad. </li><li> Lavar los huesos con medio caliente (M199 + 10% de suero de ternera fetal (FCS), + 1% de penicilina / estreptomicina). Utilice una aguja estéril 28-G, una jeringa de 1 ml, y entre 10-15 ml por medio dehueso para enjuagar. </li><li> Sostenga el hueso con pinzas finas y enjuague uno por uno hasta que se vuelva semi-transparente. Cuidado aplique presión al extremo del émbolo de jeringa con el fin de minimizar el estrés celular. </li><li> Filtrar la médula ósea a través de una web nylon 70 micras y recoger el filtrado. Para extraer la cantidad máxima de médula ósea, enjuagar varias veces desde los extremos distal y proximal. </li><li> Enjuague el tamiz con PBS y recoger el filtrado. Desalojar cuidadosamente escombros y conglomerados celulares por agitación suave y pipeta. </li></ol> 1.3 Cultivo <ol><li> Centrifugar la suspensión celular a 250 xg durante 10 min a TA. Desechar el sobrenadante y resuspender las células con aproximadamente 25 ml de medio. Repetir una vez. </li><li> Resuspender las células en 6 ml de medio después de la segunda etapa de lavado. Mezclar 50 l de la solución de células con 50 l de azul de tripano. Contar las células en una cámara de recuento bajo un microscopio de luz. Calcular el número de cells en la solución utilizando esta fórmula: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" /></li><li> Seed las células en placas de superficie ultra-bajo de fijación 6 pocillos para evitar la adhesión permanente a la parte inferior de la placa. Utilice una concentración de 10 6 células por ml con un máximo de 6 ml por pocillo. </li><li> Suplemento de la suspensión con 20 ng / ml de M-CSF para promover la diferenciación celular. </li><li> Cultivar las células durante 5 días a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5% y observar todos los días. </li></ol> 1.4 La recolección de células Nota: Estos pasos se deben realizar en hielo. Proceda con cualquiera 1.4.1 o 1.4.2 en consecuencia. <ol><li> En este punto, efectuar toda la cultura, incluyendo macrófagos diferenciados que se adherirá a la cultura placas, incluso si son placas de superficie ultra bajo de apego. <ol><li> Efectuar toda la cultura por pipeteo suave y separar con una solución de 4 ° C PBS, 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y EDTA 2 mM. Repita hasta que las placas son claras de quedarse células adherentes - confirmar con un microscopio si no está seguro. </li></ol></li><li> Alternativamente, desechar los macrófagos adherentes al cosechar el sobrenadante con las células en suspensión, que contienen predominantemente monocitos. <ol><li> Recoger las células no adherentes con una solución de PBS-EDTA libre y 0,5% de BSA. No aplique demasiada fuerza con el fin de evitar que se desprenda macrófagos ligeramente adherentes. </li></ol></li></ol> 1.5 FACS-análisis (Opcional) Nota: Es posible agotar la suspensión celular de células progenitoras stem- y CD117 + por el uso de MACS. Utilice los protocolos del fabricante para este procedimiento. <ol><li> Recoger las células de acuerdo a cualquiera de los pasos 1.4.1 o 1.4.2. </li><li> Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y repetir este paso de nuevo. </li><li> Volver a suspender al menos 250.000 células en 300 l de FACS bUffer por sonda. </li><li> Transferencia de solución de células en un 96 pocillos de la placa (30 l por pocillo). </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 25 l de anticuerpo a cada pocillo (dilución de uso del fabricante). </li><li> Teñir las células con anticuerpos (siguientes protocolos del fabricante para el fenotipado de células después de los pasos 1.5.1-1.5.6. Marcadores comúnmente utilizados para la identificación de monocitos / macrófagos incluyen CD11b, F4 / 80 (Figura 3), CD115 (Figura 2), y Gr- 1. Nota: Para obtener una descripción más amplia de soluciones de células, se recomienda el uso de marcadores como CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G y CD192. Características celulares se han descrito anteriormente 12. </li><li> Se incuban las sondas para 20 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar las sondas a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender con 200 l de tampón FACS. Repita ªes el paso dos veces. </li><li> Transferir las sondas en tubos de FACS y realizar el análisis FACS 12. </li><li> Realizar análisis FACS 12 en el día 0, 3 y 5 para analizar la diferenciación celular. </li></ol> 2. vena de la cola de inyección 2.1 Preparación <ol><li> Calentar los animales en una placa de calentamiento a 37 ° C durante unos 10 minutos. Observar a los animales mientras se calentaba a reconocer los signos de sobrecalentamiento. </li><li> Resuspender los monocitos, aislados en pasos 1.1- 1.4, en 150 l de NaCl, y cargar las células en una jeringa de 1 ml de insulina con una aguja 30G. Ligeramente agite la solución antes de cargar la jeringa para asegurar que todos los monocitos se inyectan. Siempre manipular células en hielo para evitar la fijación mediada por el calor y la activación de los monocitos. </li></ol> 2.2 Restricción <ol><li> Evitar molestar a otros ratones en la jaula la hora de elegir un ratón para inyección intravenosa. </li><li> Coloque el ratón en el inmovilizador. Evite el exceso de prEssure y tenga cuidado con las extremidades posteriores. (Figura 4) Nota: También puede utilizar anestesia general para garantizar el estrés libre manejo de los animales. </li><li> Asegúrese de que el ratón dispone de espacio para respirar antes de cerrar el inmovilizador. </li></ol> 2.3 Inyección <ol><li> Desinfectar el lugar de inyección con un agente de desinfección. Rocíe en la cola del ratón y dejar reposar durante al menos 1 min. </li><li> Detenga el flujo de sangre venosa de la cola mediante la aplicación de una presión suave en la parte lateral de la cola por encima de la zona de inyección, para una mejor visibilidad de las venas. </li><li> Gire la cola 90 grados, antes de la inyección. (Figura 5) </li><li> Inyectar en un ángulo de 45 grados. Inyectar lentamente y no más de 5 l por g para evitar dañar a los animales. </li><li> Si hay una ampolla, que es un signo de una inyección fallado, descontinuar inmediatamente y repetir la inyección más proximal. </li><li> Detenga el sangrado en el lado de la inyección mediante la aplicación de p suaveresión durante aproximadamente 1 min. </li><li> Al final del procedimiento, abra el retractor y colocar el ratón en su jaula. </li><li> Observe el ratón durante 20 minutos para asegurarse de que el animal no se vea perjudicada por la inyección y decúbito esternal se mantiene. Extender el momento de la observación hasta que el ratón recupera la conciencia suficiente. Devuelva el ratón a la compañía de otros animales sólo después de que se ha recuperado totalmente. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Se describe un método simple y rentable para aislar grandes cantidades de monocitos murinos de la médula ósea. En comparación con otros protocolos que utilizan la sangre periférica, que obtienen rendimientos de monocitos 5 de 1,4 x10 6, somos capaces de obtener mayores rendimientos de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocitos de un solo ratón donante. Al considerar los desafíos con este método, es importante mencionar la posibilidad de contaminación cuando se...

El aislamiento de monocitos es importante y crítico para muchos estudios in vitro e in vivo. Estas células son dianas de enfermedades como la enfermedad arterial periférica, la enfermedad coronaria u otras enfermedades isquémicas, ya que el crecimiento de los vasos colaterales está fuertemente impulsado por la inflamación local. Las respuestas inflamatorias incluyen la activación endotelial y el reclutamiento local de leucocitos, principalmente monocitos, que luego maduran a macrófagos y crean un entorno altamente arteriogénico mediante la secreción de múltiples factores de crecimiento para inducir la remodelación de una arteriola en una arteria colateral funcional1-3. Los monocitos también maduran hasta convertirse en células dendríticas, que se utilizan con frecuencia para estudios inmunológicos4,5 y para la investigación del cáncer6,7.
Problemático en el enfoque para el aislamiento de monocitos de sangre periférica8 es el alto número de animales donantes necesarios para producir una cantidad suficiente de monocitos para la mayoría de los análisis. Los protocolos anteriores describen métodos como la centrifugación en gradiente de densidad y el agotamiento celular a través de MACS9 al aislar monocitos; Sin embargo, estas técnicas pueden alterar las características y la funcionalidad de los monocitos, lo que puede llevar a dificultades en la interpretación10,11. Además, estos métodos son difíciles y pueden reducir la reproducibilidad experimental.
Nuestro objetivo con este protocolo es proporcionar un método simple y rentable para generar grandes cantidades de monocitos derivados de la médula ósea. Debido al alto rendimiento celular de células 11 x 106 ± 3 x 106 células obtenido por este protocolo, podemos reducir sustancialmente el número de ratones necesarios durante el aislamiento de monocitos derivados de la médula ósea. El procedimiento se puede completar en un tiempo mínimo y sin utilizar técnicas costosas y complicadas como las mencionadas anteriormente. Aquí, extraemos monocitos de la suspensión de médula ósea nativa de ratones donantes, cultivamos la suspensión en placas de fijación ultrabajas y complementamos la solución con 20 ng/ml de M-CFS. En el día 5 de incubación, las células se cosechan y caracterizan para confirmar las propiedades funcionales y fenotípicas.
Para los experimentos en el campo de la arteriogénesis, el trasplante intravenoso de estos monocitos derivados de la médula ósea en ratones es un método eficaz de administración sistémica de fármacos, que puede combinarse con la ligadura de la arteria femoral en modelos comunes de enfermedad arterial periférica.

<table><tbody><tr><td>Placa de fijación ultra baja de 6 pocillos</td><td>Corning Incorporated, NY, EE. UU</td><td></td>. <td>Placa de fijación ultra baja de 6 pocillos, con tapón, estéril</td></tr><tr><td>de 8 a 12 semanas de edad, macho, ratones balb/c&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul de células muertas</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>GE Healthcare, Friburgo, Alemania</td><td></td><td>Fracción V, pH 7.0</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania</td><td></td><td>28G, 30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience, San Diego, EE. UU.</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience, San Diego, EE. UU.</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td>Con tapón, estéril</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemania</td><td></td><td>Allegra&reg; Centrífuga X-15R</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Veet, Mannheim, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente desinfectante</td><td>Sch&uuml; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemania</td><td></td><td>Kodan Tinktur forte</td></tr><tr><td>Bistur desechable No.10&nbsp;</td><td>Maquinilla de afeitar de seguridad de plumas Co.Ltd, Osaka, Japón &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%&nbsp;</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidad de extracción Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>AbD Serotec, D&uuml; sseldorf, Alemania</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>tampón FACS&nbsp;</td><td>Fabricado por nuestro grupo con un solo componente</td><td></td><td>PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3</td></tr><tr><td>FACS</td><td>dispositivo Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU</td><td></td>. <td>BD FACS Canto II</td></tr><tr><td>FACS tubes&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; pipeta</td><td>Becton Dickenson Labware, NY, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Rubis, Stabio, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience, San Diego, EE. UU</td>. <td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml; ttingen, Alemania &nbsp;</td><td></td><td>Placa caliente 062</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemania</td><td></td><td>Incu safe</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemania</td><td></td><td>Axiovert 40 &deg; C</td></tr><tr><td>Factor estimulante de colonias de macrófagos</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp; region=DE">SRP3110&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Agitador mecánico</td><td>IKA, Staufen, Alemania</td><td></td><td>MS2 minishaker</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar Microtubos de ensayo</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banco de trabajo microbiológico</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemania</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Tampón de lavado de monocitos&nbsp;</td><td>Fabricado por nuestro grupo con componentes individuales</td><td></td><td>PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Sujetador de ratón</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG, Berlín, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (ácido de sodio)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellsieve de nylon</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td></td><td>Colador de celdas, 70 &micro; m tamaño de malla</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td>pH 7,4,</td></tr><tr><td>pipetas estériles</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td>10&micro; l/100 y micro; l/200 y micro; l/1.000 y micro; l</td></tr><tr><td>Cabezales de pipeteo</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td>Cellstar 5 ml, 10 ml</td></tr><tr><td>Unidad de succión</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Alemania</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>.</td> <td>JeringaB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania</td><td></td><td>Jeringa de insulina Omnifix&reg; -F de 1 ml</td></tr><tr><td>Tubos con tapón</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td>15 ml/50 ml Tubos Cellstar Baño de</td></tr><tr><td>agua caliente</td><td>Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Alemania</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Como subtipo de leucocitos y progenitores de macrófagos, los monocitos están involucrados en muchos procesos importantes de los organismos y a menudo son objeto de varios campos en la ciencia biomédica. El método que se describe a continuación es una forma sencilla y eficaz de aislar monocitos murinos de médula ósea heterogénea.
La médula ósea del fémur y la tibia de los ratones Balb/c se extrae mediante lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La suspensión celular se complementa con el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y se cultiva en superficies de unión ultrabajas para evitar la diferenciación de monocitos provocada por la adhesión. Las propiedades y la diferenciación de los monocitos se caracterizan en varios intervalos. Para el fenotipado se utiliza la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), con marcadores como CD11b, CD115 y F4/80. Al final del cultivo, la suspensión consta de un 45%± un 12% de monocitos. Al eliminar los macrófagos adhesivos, la pureza se puede aumentar hasta un 86%± un 6%. Después del aislamiento, los monocitos se pueden utilizar de varias maneras, y uno de los métodos más efectivos y comunes para la administración in vivo es la inyección intravenosa de la vena de la cola. 
Esta técnica de aislamiento y aplicación es importante para los estudios de modelos de ratón, especialmente en los campos de la inflamación o la inmunología. Los monocitos también se pueden utilizar terapéuticamente en modelos de enfermedad en ratones.

La solución de células extraída de la médula ósea murina se compone de diversos tipos de células. Los tipos de células principales son los linfocitos, granulocitos y monocitos. Los tipos de células pueden ser estimados por el tamaño y la granularidad, que se muestra en la Figura 1 para ambas suspensiones nativas y células cosechadas después de 5 días de diferenciación. Tenga en cuenta la composición celular cambiando durante el cultivo. Sin embargo, la clasificación exacta de las poblaciones debe confia...

Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Hola, mi nombre es Helen Kuster y trabajo en el grupo de investigación cardiovascular del doctor Harold y como profesora en la Universidad Auto Vica en MacBook. Estamos interesados en el aislamiento y caracterización de monocitos marinos con el fin de utilizarlos como vehículos para el crecimiento de vasos colaterales. Los siguientes pasos principales son necesarios para el cultivo de monocitos derivados de médula ósea: primero, anestesia del ratón y dislocación cervical; segundo, extracción y lavado del fémur.Tercer filtrado de la médula ósea. Cuarto a sexto paso de lavado con medio, cultivo de las células en placas de adherencia ultrabaja. Séptima citometría de flujo.Con el fin de extraer monocitos de la médula ósea, el ratón será anestesiado utilizando ISO fluorado y sacrificado por dislocación cervical. El ratón será fijado y ambas extremidades inferiores serán separadas con un escalpelo esterilizado. Se extraerán ambos fémures y tibias, y se lavarán con etanol al 96 % durante un mínimo de 90 segundos.Después de esto, todos los pasos deben realizarse de forma estrictamente estéril para evitar contaminación. Se eliminarán los músculos o tendones del hueso. El fémur y la tibia se enjuagan varias veces con PBS tibio.Para la recolección de la médula ósea, se cortan los extremos proximal y distal de cada hueso con un par de tijeras finas. Para enjuagar el hueso, se necesita una aguja esteroide de 28 G, una jeringa de un mililitro y entre 10 y 15 mililitros de medio por hueso. Posteriormente, la médula ósea se filtra a través de un filtro de 70 micrómetros S mientras se sostiene el hueso con una pinza fina.Lave los huesos uno por uno hasta que adquieran un aspecto ilusionado. Con el fin de minimizar el estrés celular, aplique con cuidado presión sobre el émbolo de la jeringa. Lave el conjunto con PBS.Posteriormente, las células se centrifugan a 250 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Y se re-suspenden con medio. Después de este paso, repita la etapa una vez más.Para monocitos derivados de médula ósea a partir de médula ósea nativa, utilizamos M 199 con 1% de penicilina y estreptomicina y 10% de suero fetal bovino. Además, añadimos 20 nanogramos por mililitro de M-CSF el primer día. Ocho nanogramos por mililitro de interferón gamma se añaden el último día de cultivo al medio.Si se desea una regulación positiva del MHC clase II, las células se siembran en placas de adherencia ultrabaja con pozos profundos para evitar la adherencia permanente al fondo. Utilizamos una concentración de un tiempo 10 a la seis células por mililitro, con hasta seis mililitros por pozo. El período de cultivo es de cinco días a una temperatura de 37 grados y 5 % de dióxido de carbono.Las células se revisan diariamente después de cinco días, hasta que entre el 60 y el 80 % de las células sean monocitos. Mi nombre es Martin Bachner y soy estudiante de medicina aquí en la Universidad Auto Fungi, en el Departamento de Cardiología, anología y cronología. Y cuando se realiza la inyección intravenosa, es importante practicar mucho antes de llevarla a cabo, porque de lo contrario no se podrán aplicar los monocitos de manera adecuada.Los experimentos han demostrado que los monocitos son más eficaces para mejorar la artenesia cuando se aplican de forma sistémica. Una forma común de administración sistémica de fármacos es la inyección en la cola. En nuestro caso, inyectamos 2,5 millones de monocitos, que se resuspenden en cloruro de sodio.Hay cuatro vasos en la cola de las arterias del ratón en los lados ventral y dorsal, y dos venas en el lado lateral. Por lo tanto, para la inyección en la vena caudal, es necesario girar la cola aproximadamente 90 grados. Para facilitar el procedimiento, el ratón debe calentarse utilizando una almohadilla calefactora durante unos 10 minutos.Los animales deben ser observados mediante calentamiento. Esto es importante para reconocer signos de sobrecalentamiento. Además, necesitamos este agente infeccioso y un conjunto de agujas de 30 genes en una jeringa de insulina de un mililitro.Fije cuidadosamente al animal en un sujetador, lo que facilita mucho la inyección en la cola. Asegúrese de que el ratón tenga suficiente espacio para respirar antes de cargar la solución en la jeringa. Vortexee la solución de monocitos para asegurarse de que todos los monocitos puedan ser inyectados.Desinfecte el sitio de inyección para evitar infecciones; tome la cola entre el pulgar y el índice. En el punto más distal, se inserta la aguja en un ángulo plano. Si se coloca en la vena, es muy fácil inyectar la solución de monocitos.Si hay una ampolla, es un signo de una inyección incorrecta. Debe detenerse inmediatamente e intentarlo nuevamente. Proximalmente, intente siempre inyectar lentamente y no más de cinco microlitros por gramo.Si la inyección fue exitosa, detenga la hemorragia en el sitio de inyección aplicando presión suave durante aproximadamente un minuto. Al final del procedimiento, abra el retractor y coloque al ratón en su jaula para caracterizar los monocitos. Utilizamos los efectos con una combinación de antígenos, a saber, CD 11 B, F cuatro 80, CD 115 y GL uno.La expresión de estos antígenos se correlaciona con una etapa de desarrollo para analizar los monocitos. Realizamos las determinaciones en los días 0, 3, 5 y siete, y la pureza de los monocitos aumenta hasta un 90 % el día cinco. Para alcanzar esa pureza, es importante agotar fuertemente los macrófagos tisulares.Las células no terrinas se agotan utilizando un tampón de lavado sin EDTA. Para agotar las células terrinas, utilizamos un tampón de lavado que contiene EDTA y pipeteo suave. Este diagrama muestra los principales tipos celulares para su cultivo en un solo extremo.Los diferentes tipos celulares mostrados son: uno linfocitos, dos monocitos, tres granulocitos, con aumento de la pureza de monocitos después del día cinco. Y cultivo. Observe el cambio en la composición celular durante el cultivo; la población celular incluye uno monocitos y dos macrófagos.Figura dos, cronología de la expresión de CD115 durante la diferenciación. Obsérvese que más del 95 % de todas las células son positivas para CD115 tras cinco días de diferenciación, lo que indica que la gran mayoría de las células son monocitos o macrófagos. La clasificación puede basarse en el tamaño y la granularidad celular, pero los marcadores celulares específicos son más fiables.Figura tres, aumento de la expresión de madurez de monocitos y macrófagos. Marcador F cuatro 80, día cinco, observe la aparición de una población con expresión intermedia de F cuatro 80, lo cual es consistente con el fenotipo de monocito. Día siete, observe el desplazamiento hacia la derecha de la expresión de F cuatro 80, consistente con la maduración del macrófago.El aislamiento de monocitos es importante y esencial para muchos estudios in vitro e in vivo. Estas células son un objetivo interesante, por ejemplo, en relación con enfermedades como la enfermedad arterial periférica o la enfermedad coronaria, que están relacionadas con la isquemia. Se obtiene médula ósea de fémur y tibia de ratones de biopsia mediante lavado de los huesos con medio tibio; la suspensión celular se complementa con M-CSF y se cultiva en superficies de unión ultra baja para evitar la diferenciación inducida por adhesión de los monocitos. Las propiedades y diferenciación de los monocitos se evalúan en diferentes momentos y hechos mediante marcadores como CD11b, CD115 y F4/80, que se utilizan para determinar el fenotipo de las células.Si se desea una administración sistémica del fármaco, la inyección intravenosa es una forma sencilla y eficaz de hacerlo. Describimos el método para aislar grandes cantidades de monocitos MI a partir de la médula ósea de manera simple y rentable. Con este nuevo método, somos capaces de generar aproximadamente 11 millones de monocitos por ratón.

isolation-intravenous-injection-murine-bone-marrow-derived

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

En este video, demostramos la activación de macrófagos derivados de la médula ósea en respuesta al lipopolisacárido bacteriano y la inmunoglobulina intravenosa.

Activación de macrófagos derivados de la médula ósea de ratón en respuesta a anticuerpos

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Este protocolo se ha establecido para cultivar macrófagos murinos primarios deficientes en tetrahidrobiopterina (BH4) y óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) para estudiar la biología del NO-redox. El estudio se centra en reducir la contaminación potencial de BH4 y otros artefactos encontrados en los métodos tradicionales de aislamiento y cultivo que pueden confundir los resultados experimentales y la interpretación de los resultados.

Aislamiento y cultivo in vitro de macrófagos derivados de la médula ósea para el estudio de la biología NO-redox

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.

Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Aprende a aislar e inyectar intravenosamente monocitos derivados de médula ósea murina para investigación cardiovascular. Este protocolo reduce costos y sacrificio animal en estudios de crecimiento vascular.

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

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