Name: Métodos para evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de Combustible Tabaco Preparativos del producto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de preparaciones de tabaco combustible utilizando células mononucleares de sangre periférica humana. Este método permite analizar la secreción de citocinas y la capacidad citolítica mediante citometría de flujo.

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Este trabajo está financiado por RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) bajo un acuerdo de investigación en colaboración con la Wake Forest University School of Medicina. GL Prasad es un empleado a tiempo completo de RJRT.

NOTA: consentimiento informado por escrito para hacer este estudio se obtuvo en una unidad de investigación clínica local bajo la aprobación del IRB, por Buenas Prácticas Clínicas. Procesamiento de la sangre, el aislamiento de PBMCs y otros experimentos de cultivo celular se realizan bajo condiciones estériles, utilizando suministros microbiológicamente estériles y reactivos. 1. WS-CM Preparación <ol><li> Generar WS-CM como se ha descrito previamente 12. <ol><li> Preparar WS-CM pasando humo de cuatro 3R4F cigarrillos de referencia a través de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sin rojo fenol mediante el siguiente régimen de fumar: 35-60-2, el volumen de hojaldre en ml, intervalo de hojaldre en seg, y la duración de hojaldre en segundos, respectivamente. Cada preparación genera una muestra de 20 ml. </li></ol></li><li> Tubo (s) etiqueta con fecha, hora completado, y el nombre y el número de cigarrillos. Almacene los 500 ml de alícuotas a -80 ° C inmediatamente después de fumar se ha completado. </li><li> Analizar alícuotas de WS congelados-CM Para determinar los niveles de nicotina, las nitrosaminas específicas del tabaco y los hidrocarburos aromáticos policíclicos como se describió anteriormente 12. </li></ol> 2. Aislamiento de PBMC <ol><li> Recoger la sangre fresca de donantes sanos (que son los no consumidores de productos de tabaco) Aislar PBMCs de sangre fresca como se describe más adelante en obtener autorización de Wake Forest Baptist Health IRB 15. <ol><li> Antes de la llegada de la bolsa de sangre, una botella de 500 ml, tijeras, tampón de aislamiento, y salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (RT) dispuestos en un nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) campana de cultivo celular. Tampón de aislamiento debe ser protegido de la luz. </li><li> Mantenga la bolsa de sangre hacia abajo y cortar el tubo justo debajo de donde se ha sujetado dejando al menos 3 cm de tubo. </li><li> Retire el tapón de la botella de 500 ml y mantener el tubo por encima de la boca de la botella. Recojo la bolsa de sangre e invertirla para permitir que la sangre fluya libremente de la bolsa en tque la botella hasta que la bolsa está vacía. Deje que la sangre fluya hacia la pared interior de la botella frente hacia abajo para evitar la creación de burbujas. </li><li> Verter tampón de aislamiento dentro de la botella en una proporción de 1: 5 de tampón de aislamiento a la sangre. Se tapa el frasco bien y suavemente invertirlo, de extremo a extremo, 10 veces. Deja la botella en la campana de cultivo de células para la incubación con luces apagadas, durante 1 hora a RT. </li><li> Una capa de luz, color paja se acumula por encima de la sangre. Eliminar esta capa usando una pipeta serológica 25 ml en 50 ml tubos cónicos. El monto recaudado puede variar desde 50 hasta 300 ml, dependiendo del tema que donaron sangre. </li><li> Centrifugar los tubos a 200 xg durante 10 min a TA. </li><li> Aspirar el sobrenadante transparente, dejando el sedimento de color sangre oscura. El sedimento se suelta pero viscoso. </li><li> Pipetear 3 ml de tampón de aislamiento en tubos de 15 ml cónicos. </li><li> Para resuspender el pellet, añadir 20 ml de DPBS por cada 50 ml de líquido de color paja recogidos en sTep 2.1.5. Vortex para mezclar a fondo, y consolidar el líquido resuspendido de múltiples tubos. Este líquido contiene suspendió células sanguíneas. </li><li> Con una pipeta de transferencia, la transferencia de 5 ml de las células sanguíneas suspendidas en 3 ml de tampón de aislamiento en el paso 2.1.8. Incline el tubo cónico de 15 ml que contiene la suspensión celular lentamente y suavemente para crear dos capas separadas. Centrifugar los tubos a 400 xg durante 40 min a TA con una aceleración mínimo y sin freno. </li><li> Utilice una pipeta de transferencia para eliminar la capa resultante nublado medio (capa leucocitaria) que contiene PBMCs en un tubo cónico de 50 ml. Evite dibujar otras capas claras por debajo de ella. Transferencia no más de 25 ml en cada tubo cónico de 50 ml. </li><li> Añadir 25 ml de tampón corriente fría (o más para llenar todo el volumen restante del tubo cónico de 50 ml) para lavar las células. Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado con 10 ml tampón. Esta contiene las PBMC. Contar las células y usar immediata o lugar en hielo durante la congelación. </li></ol></li></ol> 3. La congelación y descongelación de las PBMCs <ol><li> Centrifugar las CMSP que se recogieron en el paso 2.1.13 durante 10 minutos a 400 x g. </li><li> Llenar el recipiente de congelación con alcohol isopropílico según las instrucciones del fabricante. PRECAUCIÓN: El alcohol isopropílico es inflamable y muy tóxico. </li><li> Resuspender el pellet con medio RPMI 1640 (4 ° C) que contenía suero bovino fetal al 20% (FBS) y 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Esto es RPMI 1640 medio de congelación. Resuspender el sedimento con una cantidad de medio de congelación que se traducirá en una suspensión tiene alrededor de 5 x 10 7 células / ml. El número de células disponibles para la congelación puede variar. </li><li> Dispensar alícuotas de 1 ml de suspensión celular en criotubos de 2 ml y colocar los criotubos en el recipiente de congelación. Coloque el recipiente de congelación con criotubos en un congelador a -80 ° C para almacenar O / N y luego retire los criotubos y traslado a almacenar en uncongelador criogénico entre -150 ° C a -190 ° C. </li><li> Retire el tubo criogénico de almacenamiento criogénico y descongelar rápidamente con agitación suave en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Inmediatamente transferir las PBMC descongeladas en el criotubo en un tubo cónico de 15 ml con 10 ml de RPMI 1640 medio completo (4 ° C) que contiene 10% de FBS, 1% Pen / Strep y 1% de L-glutamina. El contenido de la criotubo descongelados deben ser transferidos tan pronto como sea posible para obtener la viabilidad celular máxima 15. </li><li> Centrifugar los PBMCs a 400 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender el precipitado con 5 ml de medio RPMI 1640 completo y contar las células. </li><li> Medir la viabilidad celular por métodos establecidos, tales como el método de exclusión con azul de tripano. Generalmente la viabilidad celular con este método es de aproximadamente 90 - 95%. Las PBMCs ahora están listos para usar en experimentos. </li></ol> 4. Determinación de la célula de la Muerte NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudy. Las diluciones se pueden cambiar en consecuencia. <ol><li> Diluir WS-CM o la nicotina en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completo hasta un volumen total de 100 l / pocillo, como se indica a continuación. </li><li> Diluir WS-CM a las siguientes concentraciones: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina (basado en el contenido de nicotina en WS-CM) 12. </li><li> Diluir la nicotina en medio RPMI a las siguientes concentraciones: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, y 3000 g / ml. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente. </li><li> Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a cada pocillo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo. </li><li> Para el propósito de este estudio, preparar dos conjuntos de placas como anteriormente. Cubrir las placas e incubar una placa durante 24 horas y una placa durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Ajuste los puntos de tiempo como sea necesario. </li&gt; <li> Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente resuspender las células con 200 l de tampón de hielo frío, y repetir la etapa de lavado una vez más. </li><li> Añadir 95 l de tampón seguido de 5 l de 7-aminoactinomicina D (7AAD) a cada pocillo para un volumen total de 100 l / pocillo. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Añadir 100 l de tampón a los tubos de racimo. Transferir todo el volumen de suspensión de células de cada pocillo de la placa a los tubos de racimo y adquirir las muestras en el citómetro de flujo. </li><li> Determinar el porcentaje de células positivas 7AAD utilizando citometría de flujo de software de análisis. </li></ol> 5. CE 50 Determinación <ol><li> Los valores de EC50 de WS-CM y la nicotina se determinan mediante tinción 7AAD-positivo de CMSP. </li><li> El valor de EC50 se define como la concentration en la que 50% de las células fueron ya no es viable en un ensayo de 24 h, y los valores se expresan como g de equi-nicotina unidades / ml. </li><li> A los efectos de este estudio, los valores de EC50 se determinó que eran 1,56 g / ml y 1,650 g / ml para WS-CM y la nicotina, respectivamente. </li></ol> 6. Las citoquinas secretadas NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudio. Las diluciones se pueden ajustar en consecuencia. <ol><li> Diluir WS-CM en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completa a un volumen total de 100 l / pocillo a la concentración de 0,3, 1,56, 3, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina. </li><li> Diluir la nicotina a las siguientes concentraciones: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, y 3000 mg / mL. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente. </li><li> Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a cada pocillo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo.El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo. </li><li> Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente la suspensión de células con 200 l de hielo frío tampón y repetir la etapa de lavado una vez más. </li><li> Añadir 200 l de medio RPMI completo y repita el paso de lavado una vez más. </li><li> Añadir 200 l de 10 mg medio LPS / ml a cada pocillo. </li><li> Cubrir la placa e incubar durante 4 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Ajuste los tiempos de incubación según sea necesario. </li><li> Centrifugar la placa a 300 × g durante 3 min. </li><li> Tomar 175 l de sobrenadante de cada bien y guardar en un congelador a -80 ° C para llevar a cabo los ensayos en los pasos 7 y 8. </li></ol> Ensayo matriz 7. citométricos de bolas &lt;ol&gt; <li> Descongelar los sobrenadantes de células preparados a partir de paso 6.10 y el uso en el ensayo de CBA. Realizar el ensayo de citometría de bolas de serie (CBA) según las instrucciones del fabricante. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> Descongelar los sobrenadantes de las células de la etapa 6.10 y su uso en la IL-8 ELISA. Realizar el ensayo ELISA según las instrucciones del fabricante. </li></ol> 9. Intracelular tinción y citometría de flujo NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudio. Las diluciones se pueden ajustar en consecuencia. <ol><li> Diluir WS-CM en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completa a un volumen total de 100 l / pocillo a la concentración de 0,3, 1,56, 3, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina. </li><li> En la misma placa, diluir la nicotina a las siguientes concentraciones: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, y 4000 g / ml. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y ambientalmente hazardous. </li><li> Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo. </li><li> Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente resuspender las células con 200 l de tampón de hielo frío, y repetir la etapa de lavado una vez más. </li><li> Añadir 200 l de medio RPMI completo a la placa, y repetir el paso de lavado una vez más. </li><li> Preparar las concentraciones de trabajo de 2 l / ml GolgiPlug y / ml de LPS 10 g utilizando medio RPMI completo y añadir 200 l a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa durante 6 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Al final de la etapa 9.8, se lavan las células con tampón (4 ° C) y girando a 300g durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 100 l de Cytofix a cada pocillo e incubar durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células 3 veces como se ha descrito en el paso 9.9 con 1x PermWash (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 45 l de 1x Cytoperm a cada pocillo seguido de 5 l de cada de uno de los siguientes anticuerpos a cada pocillo: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar las células dos veces tal como se describe en el paso 9.9 con 1x PermWash (4 ° C) y una vez con tampón (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células con 200 l de 2% de paraformaldehído (4 ° C). Transferir las células en tubos de 12 x 75 mm, y analizar las muestras en el citómetro de flujo. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es corrosivo, tóxico agudo y un peligro para la salud. </li></ol> 10. K562 Ensayo Matar NOTA: K562 células deben cultivarseen cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 con medio RPMI completo hasta que alcanzan 80% de confluencia antes del ensayo. <ol><li> Preparar una solución de 5 mM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) stock mediante la adición de 18 l de DMSO al vial. </li><li> Diluir WS-CM o la nicotina en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completo hasta un volumen total de 100 l / pocillo para lograr las unidades de equi-nicotina deseada o las concentraciones de nicotina para cada pocillo. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente. </li><li> Añadir 100 l de PBMCs en medio RPMI completo a una concentración de 1,5 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células con WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo. </li><li> Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar las células K562 mediante la adición de 10 ml de DPBS y centrifugar a 400 xg durante 8 min a TA. </li><li> Resuspender las células con 10 ml de DPBS y contar las células K562. </li><li> Preparar CFSE working solución mediante la adición de 1 l de solución madre CFSE a 1 ml de DPBS. </li><li> Añadir 1 ml de la solución de trabajo CFSE a 1 ml de la suspensión de células K562 que contiene 1 - 2 x 10 7 células. Vortex y se incuba precisamente por 2 min a TA. </li><li> Inmediatamente añadir 200 l de FBS. Vortex y se incuba precisamente por 2 min a TA. </li><li> Añadir 10 ml de medio RPMI completo y se centrifuga el tubo a 400 xg durante 8 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante RPMI y romper la pastilla y resuspender las células con 10 ml de medio completo RPMI y contar las células K562 marcadas con CFSE. </li><li> Lavar las PBMCs por centrifugación de la placa a 300 xg durante 3 min a TA. Aspirar el sobrenadante por decantación del líquido. Vuelva a colocar la tapa y agite la parte inferior de la placa. Añadir 200 l de medio RPMI completo y repita el paso de lavado una vez más. </li><li> Añadir células K562 marcadas con CFSE en una proporción de 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMCs) a cada pocillo de muestra de la placa de PBMC y más incubate durante 5 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar la mezcla de células por centrifugación a 300 xg durante 3 min a TA. Aspirar el sobrenadante por desechar el líquido. Coloque la tapa y agitar la parte inferior de la placa. </li><li> Añadir 200 l de tampón y repetir el paso de lavado descrito en la etapa 10.14 una vez más. </li><li> Añadir 95 l de tampón de ejecución seguido de 5 l de 7AAD a cada pocillo para un volumen total de 100 l / pocillo. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Añadir 100 l de tampón a cada pocillo y transferir todo el volumen de suspensión de células de cada pocillo de la placa a los tubos de racimo y adquirir las muestras en el citómetro de flujo. </li><li> Determinar el porcentaje de células 7AAD-positivos y CFSE-positivos utilizando citometría de flujo de software de análisis. </li></ol>

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<li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Nosotros y otros han demostrado previamente que el tratamiento de las PBMC con TPPs suprime varias respuestas, incluyendo la expresión y secreción de citoquinas y medidas funcionales tales como célula diana matando a 14. Los métodos experimentales descritos en el anterior trabajo requieren períodos de incubación más largos y fueron modestos en magnitud 14. Teniendo en cuenta las posibles aplicaciones de este atractivo modelo ex vivo para la investigación básica y aplicada, se investigó si ...

Un importante conjunto de puntos de conocimiento a los efectos adversos para la salud del tabaquismo crónico, incluyendo la enfermedad cardiovascular (ECV), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el cáncer de 1,2. Fumar cigarrillos crónica se ha sabido para causar la inflamación y la supresión inmune, y estas alteraciones se informó de contribuir a un mayor riesgo de infección microbiana y el cáncer en fumadores 3. In vitro y técnicas ex vivo son útiles en la elucidación de la base molecular de los efectos fisiopatológicos de el humo del cigarrillo 4-9 (Tabla 1) y se reconocen como importantes herramientas para guiar la regulación emergente de diversos productos del tabaco 10,11. Por ejemplo, hemos demostrado que materias inflamables de productos de tabaco (TPP), como medio de todo el humo acondicionado (WS-CM) y partículas totales (TPM) son mucho más citotóxica y perjudicial paraADN de los TPP no combustibles o la nicotina 12,13. De acuerdo con el trabajo publicado, se informó recientemente que los TPP combustibles o la nicotina 12,13. De acuerdo con el trabajo publicado, recientemente informó de que los TPP combustibles causados ​​inmunosupresión marcada. Esto se evidenció por la supresión de Toll-like receptor (TLR) -ligands, estimulado la secreción de citoquinas y célula diana (K562) matando por PBMCs en un modelo ex vivo 14. Dada la importancia de la inflamación en los procesos de enfermedad inducida por el humo de cigarrillos, una mayor optimización de las condiciones de ensayo para evaluar los efectos inmunomoduladores del humo del cigarrillo se presenta en este informe. Los ensayos ex vivo miden típicamente intracelular y citoquinas, así como la función citolítica de las células T citotóxicas y NK en células K562 matar ensayos de 14 secretadas. Los ensayos implicados pre-incubación con WS-CM y la nicotina y la posterior estimulación de PBMCs con TLR agonistas durante un período de 3 días; las lecturas finales se realizaron usando ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y / o citometría de flujo. Hemos utilizado lipopolisacárido bacteriano (LPS), que se une a los receptores TLR-4 y estimula PBMCs que resulta en la producción de citocinas intracelulares y la secreción de citocinas. Además de la optimización de las diferentes etapas del ensayo para evaluar los efectos inmunomoduladores de TPP, nosotros también presentes métodos para el aislamiento de PBMCs, ensayos de muerte celular, y IL-8 cuantificación. Estos métodos pueden ser aplicados para abordar otras cuestiones de investigación y perfeccionar todavía más para evaluar los productos del tabaco en el marco regulatorio. Tabla 1. publicado informes de métodos in vitro y ex vivo utilizan para estudiar varilus efectos fisiopatológicos de las preparaciones de los productos de tabaco CS, medio humo del cigarrillo.; CSC, cigarrillo condensado de humo; CSE, extracto de humo de cigarrillo; ELISA, enzima-ensayo de inmunoabsorción ligado; GADPH, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; qPCR, reacción de cadena de polimerasa cuantitativa; RT, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; TS, humo de tabaco. <table><tbody><tr><td> Autor (año de estudio) </td><td> Laan et al. (2004) </td><td> Moodie et al. (2004) </td><td> Oltmanns et al. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden et al. (2004) </td><td> Birrell et al. (2008) </td></tr><tr><td> Las células utilizadas </td><td> Células bronquiales humanas endotelio (BEAS-2B), neutrófilos humanos </td><td> Células epiteliales alveolares humanos (A549) </td><td> Las células del músculo liso de las vías respiratorias Humanos (HASMC) </td><td> Las células humanas U937 premonocítica, monocitos humanos </td><td> Alveolares tipo II las células epiteliales (ATII) </td><td> Monocítica humanalínea celular (THP-1), macrófagos pulmonares humanos </td></tr><tr><td> TPP utilizado </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> Método utilizado </td><td> ELISA, qPCR, migración, cambio electromovilidad </td><td> Inmunohistoquímica, electroforesis, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforesis </td><td> Gel cambio de la movilidad </td><td> Microscopía de luz, microscopía electrónica, electroforesis, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, kit E-Toxate (Sigma), ensayo de placa de p65 (TransAM), electroforesis, varios kits de inmunoensayo </td></tr><tr><td> Medida </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migración </td><td> Acetiltransferasas histonas, las histonas desacetilasas, NF-kB, IL-8, pI kappa B-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina </td><td> Proteínas de estrés / tensión (HSP / Hsp70), factor de transcripción HF, NF-kB,TNF-α </td><td> Proteína surfactante (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilación de ERK, cJUN: unión a ADN, el glutatión, p65: unión al ADN </td></tr><tr><td> Resultado final </td><td> CSE regula a la baja la producción de citoquinas a través de la supresión de la AP-1 de activación. </td><td> H 2 O 2 y CSC mejorar la acetilación de las histonas, disminuir la actividad de la histona deacetilasa, diferencialmente regular la liberación de citoquinas proinflamatorias. </td><td> El humo del cigarrillo puede causar la liberación de IL-8 de HASMC, reforzada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 liberación, inhibición de la eotaxina y RANTES por el humo del cigarrillo. </td><td> TS factor de transcripción HF, que se asoció con sobreexpresión de Hsp70 y la inhibición de la actividad NFkB y la liberación de TNF-α vinculante activados. </td><td> Reducción ATII niveles de quimioquinas derivadas de células compromiso alveoreparación lar, contribuyendo al cigarrillo daños y enfisema alveolar inducida por el humo. </td><td> Los datos proporcionan explicación mecanicista de por qué los fumadores han aumentado las infecciones respiratorias. Supresión de la respuesta innata está acompañado por un aumento en IL-8. </td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>12 tubos de 75 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos de 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td> 3R4F cigarrillos <td></td></tr><tr><td>de referencia</td><td>Univ. de Kentucky, Facultad de Agricultura</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>botella</td> <td>de 500 mlCorning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo redondas de 96 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo celular</td><td>Centrífuga Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sondas moleculares Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de racimo</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>Nocivos si se ingieren, carcinógenos</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido</td>) inflamables <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>Software analiza los datos CBA</td></tr><tr><td>Unidad de filtro</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II 8</td><td>colores, a Ex 405 y Em 785.</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur 4</td><td>colores a Ex 495 y Em 785.</td></tr><tr><td>software de análisis por citometría de flujo</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de congelación</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Contiene DMSO, irritante</td></tr><tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Carcinógeno, irritante, corrosivo</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>kit de citocinas inflamatorias humanas</td><td>BD Biosciences</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma; V-500 Anticuerpo</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>sensibilizador cutáneo</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA Kit</td><td>R and D Systems</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de aislamiento</td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>Líquido inflamable, irritante</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&alpha; PE Anticuerpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>Toxicidad aguda, oral</td></tr><tr><td>Monensina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nicotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Toxicidad aguda, peligro ambiental</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>" M"</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Inflamable, irritación de la piel</td></tr><tr><td>Pluma/estreptococo</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ejecución</td><td>MACS Tampón de ejecución, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF-y alfa; Alexa Fluor 488 Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de combustible tabaco preparativos del producto

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Entre otros cambios fisiopatológicos, la exposición crónica al humo del cigarrillo provoca inflamación y la supresión inmune, que han sido vinculados a un aumento de la susceptibilidad de los fumadores a infecciones microbianas y la incidencia de tumores. Ex vivo supresión de las respuestas inmunes mediadas por el receptor en las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) tratado con los componentes del humo es un enfoque atractivo para estudiar los mecanismos y evaluar los probables efectos a largo plazo de la exposición a los productos de tabaco. Aquí, hemos optimizado los métodos para llevar a cabo ensayos ex vivo utilizando PBMCs estimulados por lipopolisacárido bacteriano, un receptor-4 ligando Toll-like. Los efectos del humo de medio acondicionado conjunto (WS-CM), una preparación de productos de tabaco combustible (TPP), y la nicotina se investigaron sobre la secreción de citoquinas y la destrucción de células diana por PBMCs en los ensayos ex vivo. Se demuestra que las citoquinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 y citoquinas intracelulares IFN47 ;, TNF-α, y MIP-1α fueron suprimidos en PBMCs expuestos-WS-CM. La función citolítica de PBMCs efectoras, tal como se determina mediante un ensayo de célula diana K562 matar se redujo también por la exposición a WS-CM; nicotina era mínimamente eficaz en estos ensayos. En resumen, presentamos un conjunto de ensayos mejorados para evaluar los efectos de los TPP en ensayos ex vivo, y estos métodos podrían adaptarse fácilmente para probar otros productos de interés.

Los resultados se presentan como media ± error estándar de la media (cuatro muestras de donantes). Se realizó la prueba t del estudiante entre las muestras de control de tratados y no tratados utilizando el software Excel, así como comparaciones de la prueba t para todos los tratamientos con sus correspondientes controles. La significación estadística se indica con: *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,005; ***, P &lt;0,0005. Para medir el efecto de la exposición a WS-CM y la nicotina, PBMCs se tratar...

Utilizando ensayos ex vivo optimizados de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), demostramos que una preparación de productos de tabaco combustible suprime marcadamente las citocinas secretadas intracelularmente mediadas por receptores y la capacidad citolítica de las PBMC efectoras. Estos ensayos rápidos pueden ser útiles para la evaluación de productos y la comprensión de los posibles efectos a largo plazo de la exposición al tabaco.

Métodos para evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de Combustible Tabaco Preparativos del producto

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar los efectos de la preparación de productos del tabaco sobre la secreción de citocinas y la lisis de células diana por los PBMC. Esto se logra primero tratando PBMC cultivados con medio condicionado con humo total, medio solo o nicotina, y luego se realiza la tinción intracelular de los PBMC tratados para determinar su producción de citocinas. Alternativamente, células K562 marcadas con CFSE se cultivan en conjunto con células efectoras PBMC tratadas con medio condicionado con humo total, y la viabilidad de las células K562 se evalúa mediante tinción con sieteAAD.Finalmente, los efectos de las preparaciones de productos de tabaco combustibles sobre las BMC-P de cualquiera de los ensayos se miden mediante citometría de flujo. Las principales ventajas de nuestras técnicas frente a los métodos existentes, como el ensayo de liberación de cromo o el ensayo ALI, son que nuestros métodos son de alto rendimiento, no radiactivos y permiten medir la funcionalidad celular. Aunque este método puede proporcionar información sobre los efectos biológicos de las preparaciones de productos de tabaco.También puede aplicarse a la evaluación de otros compuestos que afectan las funciones mediadas por receptores tipo Toll y las funciones STIC de las células efectoras de PBMC. Antes de comenzar el procedimiento de tinción, diluya la condición de humo completo, el medio y la nicotina a las concentraciones indicadas en medio RPMI completo hasta un volumen total de 100 microlitros por pozo en una placa de 96 pozos.Luego, agregue 100 microlitros de P BMCs, suspendidos en medio completo a una concentración de uno por diez a la seis células por pocillo, para un volumen total de 200 microlitros por pocillo. A continuación, tape la placa e incúbela a 37 grados Celsius y 5%CO2. Tras tres horas, lave las células y aspire el sobrenadante.Luego, cubra nuevamente la placa y agítela en vórtex para disociar los pellet. Lave las células dos veces más, una vez con tampón de lavado frío, y otra vez con medio completo después del segundo lavado. Trátelas con 200 microlitros por pozo de medio completo suplementado con Golgi plug y LPS durante seis horas a 37 grados Celsius y 5 %CO₂.Luego, lave las células con tampón corriente frío con hielo y trátelas con 100 microlitros de citofijador por pocillo a cuatro grados Celsius después de 20 minutos; a continuación, lave las células tres veces con tampón de permeabilización frío con hielo. Después, agregue 45 microlitros de citoperm a cada pocillo, seguido de cinco microlitros de cada uno de los anticuerpos indicados. Tras 30 minutos a cuatro grados Celsius, lave las células tres veces y fíjelas en 200 microlitros de paraformaldehído al 2%, frío con hielo.Luego transfiera las células a tubos de 12 por 75 milímetros y analice las muestras en un citómetro de flujo. Después de preparar una placa de pbmc tratadas con productos de tabaco tal como se acaba de demostrar, lave un cultivo de células K 5 62, recolectadas al 80 % de confluencia en 10 mililitros de DPBS.Resus. Suspenda el precipitado en cinco mililitros de DPBS y cuente las células.Luego, agregue un mililitro de solución de trabajo de CFSE recién preparada a uno o dos veces 10 a la séptima células K562 en un mililitro de medio completo y disperse la tinción celular mediante vortex. Incube las células a temperatura ambiente; transcurridos exactamente dos minutos, agregue 200 microlitros de suero bovino fetal (FBS) y vortex nuevamente las células, incubándolas durante otros dos minutos. Tras la segunda incubación, lave las células con 10 mililitros de medio completo, luego resuspenda el precipitado en otros 10 mililitros de medio completo y cuente las células.Ahora, centrifugue los pBMC tratados con tabaco y deseche el sobrenadante. Luego, reemplace la tapa, re suspenda las células mediante vortex y lávenlas con 200 microlitros de medio completo por pocillo. Para iniciar el ensayo de citotoxicidad, agregue las células K562 marcadas con CFSE a los PBMC en una relación de 1 a 15 e incube el cultivo conjunto a 37 grados Celsius y 5% CO2.Después de cinco horas, centrifugar las células y desechar el sobrenadante. Suspender los pellets mediante vortex y luego lavar las células con 200 microlitros de tampón de trabajo por pocillo, a continuación agregar 95 microlitros de tampón de trabajo, seguidos de cinco microlitros de siete A a d, para un volumen total de 100 microlitros por pocillo. Finalmente, incubar las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.Luego, agregue 100 microlitros de tampón de corrida a cada pocillo y transfiera el volumen completo a los tubos de fax correspondientes adecuados para determinar el porcentaje de células positivas para siete a a D y CFSE. Mediante análisis citométrico de flujo, se observa un aumento dependiente de la dosis en la muerte celular con medio acondicionado por humo total a las 24 horas, con una muerte cercana al 80% de las células a cuatro microgramos por mililitro de unidades de nicotina equivalente. Sin embargo, el tratamiento de las BMC p durante solo tres horas no provoca una toxicidad significativa, incluso a cinco microgramos por mililitro de unidades de nicotina equivalente de medio acondicionado por humo total a las 24 horas.No se observa un grado comparable de muerte celular antes del tratamiento con 3000 microgramos por mililitro de nicotina tras tres horas; el tratamiento con nicotina no provoca muerte celular medible antes de la concentración de 2000 microgramos por mililitro con la condición de humo total, medio y nicotina. A continuación, la estimulación del receptor TLR4 mediante LPS resulta en una disminución dependiente de la dosis de las citocinas secretadas, aunque el grado de supresión varía entre las citocinas individuales. Además, cuando las células se tratan simultáneamente con LPS y bloqueador de Golgi durante solo seis horas, se observa una reducción en el número de células positivas para citocinas intracelulares tras la exposición al medio bajo la condición de humo total, incluso a concentraciones más bajas de unidades equimolares de nicotina en comparación con la exposición a nicotina.De hecho, los resultados de este ensayo de lisis ilustran que la exposición a 1,56 microgramos por mililitro de medio condicionado con humo completo reduce significativamente la capacidad de lisis de la población efectora de PBMC en comparación con el control y las concentraciones de dosis más bajas. Mientras que el tratamiento con nicotina, ya sea en concentraciones altas o bajas, no interfiere con la capacidad de lisis de la población efectora de PBMC. Es importante ser preciso con la marcación de CFSE, así como con las diluciones de anticuerpos, el tiempo de marcación y las temperaturas de incubación.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar técnicas de etiquetado con anticuerpos en citometría de flujo para determinar los efectos de preparaciones de productos del tabaco u otros tratamientos sobre las células mononucleares periféricas de la sangre.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Células epiteliales pulmonares pueden ser aislados de las vías respiratorias de los ratones y se cultivan en la interfaz aire-líquido como un modelo de epitelio respiratorio diferenciados. Un protocolo es descrito para el aislamiento, el cultivo y la exposición de estas células al humo del cigarrillo convencional, con el fin de estudiar la respuesta molecular a esta toxina ambiental.

Aislamiento de ratón las células epiteliales respiratorias y la exposición al humo del cigarrillo Experimental de la interfaz de aire líquido

Este video demuestra el efecto de las preparaciones de productos de tabaco, TPP, en la producción de citocinas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana utilizando citometría de flujo. El tratamiento de las células con TPP regula a la baja la producción de citocinas proinflamatorias, que se estima después de la estimulación con lipopolisacáridos, seguida de inmunotinción y análisis de citometría de flujo.

Análisis del efecto de las preparaciones de productos de tabaco en la producción de citocinas mediante tinción intracelular y citometría de flujo

En este video, estudiamos el efecto de un medio completamente acondicionado por humo, una preparación de producto de tabaco combustible, sobre la destrucción de células K562 por células mononucleares efectoras de sangre periférica.

Destrucción de células K562 por células mononucleares de sangre periférica expuestas a preparaciones de productos de tabaco

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Un ensayo para medir la citotoxicidad inducida químicamente en cortes de pulmón humanos cortados con precisión

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Evaluación del Impacto de la exposición repetida de Organotípicos 3D bronquiales y nasales Modelos Tissue Culture Whole humo del cigarrillo

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