Métodos para evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de Combustible Tabaco Preparativos del producto

El objetivo general de este procedimiento es evaluar los efectos de la preparación de productos de tabaco sobre la secreción de citocinas y la destrucción de células diana por parte de las P BMC. Esto se logra tratando primero las BMC de P cultivadas con condición de humo completo, medio o nicotina, y luego se realiza la tinción intracelular de las BMC de P tratadas para determinar su producción de citocinas. Alternativamente, las células K 5 62 marcadas con CFSE se cocultivan con células efectoras PBMC tratadas con medio acondicionado con humo completo y la viabilidad de las células K 5 62 se califica mediante siete tinciones A a d.

En última instancia, los efectos de las preparaciones de productos de tabaco combustible en las BMC P de cualquiera de los ensayos se miden mediante citometría de flujo. Las principales ventajas de nuestras técnicas o de los métodos existentes, como el ensayo de liberación de cromo o el punto ALI, son nuestros métodos son de alto rendimiento, no radiactivos y podemos medir la funcionalidad de la célula. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre los efectos biológicos de las preparaciones de productos de tabaco.

También se puede aplicar a la evaluación de otros compuestos que afectan las funciones mediadas por receptores tolike y STIC de las células efectoras PBMC Antes de comenzar el procedimiento de tinción. Diluya la condición de humo completo, medio y nicotina en las concentraciones indicadas. En RPMI medio completo a un volumen total de 100 microlitros por pocillo en una placa de 96 pocillos.

A continuación, añada 100 microlitros de BMC de P, suspendidos en medio completo a una concentración de uno por 10 a las seis celdas por pocillo para un volumen total de 200 microlitros por pocillo. A continuación, cubra la placa e incube a 37 grados centígrados y 5%CO2. Después de tres horas, lavar las células y aspirar el sobrenadante.

A continuación, vuelva a cubrir la placa y vértice para disociar los gránulos. Lave las celdas dos veces más, una vez en un tampón de funcionamiento helado y una vez en medio completo después del segundo lavado. Trátelos con 200 microlitros por pocillo de medio completo suplementado con tapón Golgi y LPS durante seis horas a 37 grados centígrados y 5% de CO2.

Luego lavar las células con tampón de funcionamiento helado y tratarlas con 100 microlitros de cyto fix por pozo a cuatro grados centígrados después de 20 minutos, lavar las células tres veces con lavado permanente helado. A continuación, añada 45 microlitros de citopermanente a cada pocillo, seguidos de cinco microlitros de cada uno de los anticuerpos enumerados. Después de 30 minutos a cuatro grados centígrados, lavar las células tres veces y fijarlas en 200 microlitros de formaldehído al 2%.

A continuación, transfiera las células a tubos de 12 por 75 milímetros y analice las muestras en un citómetro de flujo. Después de preparar una placa de producto de tabaco tratado con pbmc como se acaba de demostrar, lavar un cultivo de K 5 62 células, recolectadas al 80% de fluidez en 10 mililitros de DPBS. Resus. Suspenda el pellet en cinco mililitros de DPBS y cuente las células.

A continuación, añada un mililitro de solución de trabajo de CFSE recién preparada a una o dos veces 10 a la séptima células K 5 62 en un mililitro de medio completo y disperse la tinción celular por vórtice. Incubar las células a temperatura ambiente después de exactamente dos minutos, añadir 200 microlitros de FBS y volver a vorexear las células, incubándolas durante otros dos minutos. Después de la segunda incubación, lave las células en 10 mililitros de medio completo, luego vuelva a suspender el pellet en otros 10 mililitros de medio completo y cuente las células.

Ahora centrifugar el tabaco tratado con p BMC y decantar el sobrenadante. Luego vuelva a colocar la tapa, vuelva a suspender las células por vórtice y lávelas en 200 microlitros de medio completo por pocillo. Para iniciar el ensayo de matanza, agregue las células K 5 62 marcadas con CFSE a la pbmc en una proporción de uno a 15 e incube el cocultivo a 37 grados Celsius y 5% de CO2.

Después de cinco horas, gire las células hacia abajo y deseche el sobrenadante. Suspenda los gránulos por vórtice y luego lave las celdas con 200 microlitros de tampón corriente por pocillo, luego agregue 95 microlitros de tampón corriendo, seguidos de cinco microlitros de siete A a d para un volumen total de 100 microlitros por pocillo. Finalmente, incube las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.

A continuación, añada 100 microlitros de tampón de funcionamiento a cada pocillo y transfiera todo el volumen a los tubos de fax correspondientes apropiados para determinar el porcentaje de siete células a, a, d y CFSE positivas. Mediante análisis de citometría de flujo, se observa un aumento dependiente de la dosis en la muerte celular con el medio acondicionado con humo completo a las 24 horas con casi el 80% de las células muertas a cuatro microgramos por mililitro de unidades de nicotina equina. Sin embargo, el tratamiento de las BMC p durante solo tres horas no resulta en una toxicidad significativa incluso a cinco microgramos por mililitro de unidades de nicotina equina de medio acondicionado para humo completo a las 24 horas.

No se observa un grado comparable de muerte celular antes del tratamiento con 3000 microgramos por mililitro de nicotina después de tres horas, el tratamiento con nicotina no causa muerte celular medible antes del tratamiento con concentración de 2000 microgramos por mililitro con condición de humo completo, medio y nicotina, seguido de la estimulación del receptor TLR cuatro por LPS da como resultado una disminución dependiente de la dosis de las citocinas secretadas. Aunque el grado de supresión varía entre las citocinas individuales. Además, cuando las células se tratan con LPS y tapón de Golgi durante solo seis horas, se observa una disminución en el número de células positivas para citocinas intracelulares después de la exposición al medio de condición de humo completo, incluso a las concentraciones más bajas de la unidad de nicotina equina en comparación con la exposición a la nicotina.

De hecho, los resultados de este ensayo de matanza ilustran que la exposición a 1,56 microgramos por mililitro de medio de condición de humo entero reduce significativamente la capacidad de matanza de la población efectora de PBMC en comparación con las concentraciones de control y dosis más bajas. Mientras que el tratamiento con nicotina en concentraciones altas o bajas no interfiere con la capacidad de matar de la población efectora de PBMC mientras se intentan estos procedimientos. Es importante ser preciso con el etiquetado CFSE, así como con las diluciones de anticuerpos, el tiempo de etiquetado y las temperaturas de incubación.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo utilizar las técnicas de marcaje de anticuerpos en la citometría de flujo para determinar los efectos de las preparaciones de productos de tabaco u otros tratamientos en las células mononucleares de sangre periférica.