Culturas organotípicos rebanada de Estudios de Postnatal neurogénesis

El objetivo general de este procedimiento es producir cultivos de cortes con una topografía clara del hipocampo y evaluar la neurogénesis en el giro dentado del hipocampo. Esto se logra cultivando primero rodajas de hipocampo en una placa de cultivo provista de una membrana especial. A continuación, las células en división se marcan con un marcador mitótico.

A continuación, el tejido marcado se corta en secciones. Finalmente, las secciones se tiñen utilizando procedimientos inmunohistoquímicos estándar para identificar las neuronas recién nacidas. En última instancia, la inmunohistoquímica y el recuento celular se utilizan para medir la densidad celular y las propiedades celulares.

Generalmente, las personas nuevas en esta técnica pueden encontrarla desafiante porque requiere mucha práctica. La demostración visual es fundamental, ya que los pasos de disección y el proceso de transferencia de tejido de la placa de cultivo a la etapa de vibram pueden ser difíciles de aprender. Adam Moza, un estudiante graduado en nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento, utilizando una hoja de bisturí limpia, para separar los dos hemisferios de un cerebro envoltura aislado.

Transfiera el hemisferio izquierdo de regreso a la placa de Petri grande y coloque el otro lado PS hacia abajo en hielo. Solución de disección en frío. Observa la cara medial del hemisferio derecho e identifica el fórnix del borde.

Una banda prominente de materia blanca a lo largo del borde medial del hipocampo, una vez identificada, cortó el fórnix usando solo unos 0,5 centímetros de la hoja del bisturí. Con dos microespátulas. Retire el hipocampo colocando la espátula de la mano derecha en el tronco encefálico y levantando la corteza suprayacente.

Con la espátula de la mano izquierda. Levanta suavemente la corteza para revelar el ventrículo lateral y la superficie medial del hipocampo. Una línea curva blanca.

La FIA debería ser ahora visible. Alinee la curvatura de la espátula con la curvatura de la fia, y presione suavemente la espátula debajo de la FIA, deslice la espátula hacia la izquierda y recorra el eje del cudo rostral antes de levantarla en la dirección dorsal. Para extirpar el hipocampo, transfiera el hipocampo a una placa de Petri pequeña separada con una solución de disección helada.

Repita este procedimiento en el hemisferio izquierdo para extirpar el hipocampo izquierdo. Una vez aislado, transfiera con cuidado el hipopótamo campi a la etapa de corte de tejidos. Colóquelos adyacentes y paralelos entre sí y perpendiculares al eje de la cuchilla picadora.

Usa un pincel para colocar el pañuelo y agrega unas gotas de la solución de disección encima del hipopótamo. Campi. Corta el tejido en rodajas de 400 micrómetros sin hacer una pausa para eliminar las rodajas individuales Después de haber cortado todo el hipocampo, usa un pincel para transferir suavemente las secciones a una pequeña placa de Petri con solución de disección. Bajo un microscopio de disección, separe cuidadosamente las rodajas flotantes con un micros, una espátula y un pincel.

A continuación, retire de la incubadora una placa de cultivo previamente preparada con un inserto de cultivo y colóquela en la campana de flujo laminar. Con una pipeta o PE pulida al fuego, extraiga de cuatro a cinco rodajas y colóquelas en la superficie apical del cultivo. Membrana de inserción.

Use un pincel para ajustar su espaciado, dejando espacio entre las secciones individuales y el borde de la cultura. Inserte una vez en posición, retire el exceso de solución diseccionante de la superficie apical de la membrana. Vuelva a colocar la placa de cultivo con suero que contenga el medio de cultivo y las rodajas del hipocampo en la incubadora a 35 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Alimente los cultivos en una campana de flujo laminar estéril, dos días después de la disección. Primero aspire el medio de cultivo antiguo y luego agregue un mililitro de medio que contenga suero fresco a los pocillos. Con una pipeta de vidrio esterilizada, vuelva a colocar suavemente el inserto de cultivo y tenga cuidado de eliminar las burbujas de aire que puedan haberse formado debajo de la superficie de la membrana.

Después de la primera alimentación, cambie el medio cada dos días. Para estudiar la maduración e integración de las células granulosas dentadas, cambie el medio de alimentación a uno con un análogo de timidina e incube durante dos horas a 35 grados centígrados. Después de la incubación, retire el medio contenedor análogo y reemplácelo con un medio de alimentación regular.

Reanudar el horario normal de alimentación en el momento deseado. Recupere la placa de cultivo y retire el medio de cultivo. A continuación, agregue un mililitro de 4% de PFA a cada cultivo.

Sellar bien con paraform y almacenar a cuatro grados centígrados durante 24 horas al día siguiente. Retire el fijador y agregue un mililitro de PBS con sello de azida de sodio y guarde las placas como se muestra anteriormente. Cuando esté listo para el corte, use un bisturí para cortar cuidadosamente a lo largo del perímetro del inserto circular y transfiera la membrana desprendida a una placa de Petri que contenga PBS.

Después del enjuague, use pinzas para transferir la membrana a la etapa de montaje del vibram. A continuación, utilice un bisturí para eliminar el exceso de membrana que rodea dos o tres rodajas seleccionadas para seccionar los bordes limpios. La ayuda con el corte asegura que la membrana sea plana y que pueda adherirse fácilmente a la superficie de corte.

Coloque una o dos gotas de adhesivo en la etapa de corte de vibram y extiéndalo en una capa uniforme. Con una aguja de calibre 22, extienda rápidamente el adhesivo en forma rectangular con un borde largo paralelo a la cuchilla de corte. Use pinzas para transferir la membrana recortada al pegamento en la etapa de corte y asegúrese de que no haya burbujas de aire mientras se seca el superpegamento.

Transfiera la etapa Vibram de nuevo a la placa de Petri que contiene PBS. Prepare la cuchilla Vibram y una placa de 48 pocillos que contenga azida de sodio para almacenar las secciones de tejido. Utilice el vibrato para generar secciones de 30 micrómetros de tejido cortado típico de órganos.

Transfiera las secciones a una placa de 48 pocillos que contenga PBS con azida de sodio para su almacenamiento y posterior tinción inmunohistoquímica. Realizar procedimientos estándar de tinción inmunohistoquímica reemplazando secuencialmente PBS con soluciones que contienen anticuerpos primarios y secundarios, e incubando las secciones en estas soluciones durante los períodos de tiempo deseados. Estas fotografías de microscopio de fluorescencia resaltan la morfología del hipocampo preservada en cultivo.

Aquí, las rodajas organotípicas fueron inmunomarcadas para cloro, desoxi, uridina y calbindina. Aquí se muestra una micrografía de muestra de un corte inmunomarcado para CLDU y doble cottin. La imagen del lado izquierdo muestra una neurona marcada con doble cottin.

La imagen del medio muestra un núcleo marcado con cloro desoxiuridina. La imagen del lado derecho muestra ambos marcadores superpuestos para ilustrar una neurona madura. La imagen del lado izquierdo muestra un núcleo marcado con cloro desoxiuridina.

La imagen del medio muestra una neurona marcada con unión de vaca. La imagen del lado derecho muestra ambos marcadores superpuestos para ilustrar una neurona madura siguiendo este procedimiento. Otras técnicas, como la inmunohistoquímica in vivo, se pueden utilizar para hacer preguntas adicionales, como por ejemplo, ¿cómo se compara el desarrollo neuronal en cultivo con el desarrollo neuronal in vivo, especialmente en el cerebro adulto?