Name: Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a caracterizar microcircuitos neuronales mediante grabaciones de patch-clamp pareadas en rodajas agudas de cerebro. Este método combina análisis electrofisiológico y morfológico para estudiar conexiones sinápticas.

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del Grupo de 'Función de los Microcircuitos Neuronales' en el Instituto de Neurociencia y Medicina, INM-2, Centro de Investigación Jülich y al Grupo de 'Función de los Microcircuitos Corticales' en el Departamento de Psiquiatría, Psicoterapia y Psicosomática, Facultad de Medicina, JARA, Universidad RWTH de Aquisgrán por sus fructíferas discusiones. Este trabajo ha contado con el apoyo del grupo de investigación DFG sobre la función de la corteza del barril (BaCoFun).

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Grabaciones apareadas de excitatorio sinápticamente acoplado y / o las neuronas inhibidoras son un enfoque muy versátil para el estudio de microcircuitos neuronales. No sólo este enfoque permite a uno estimar la conectividad sináptica entre tipos de neuronas sino que también permite la determinación de las características funcionales de la conexión y la morfología de las neuronas pre y postsinápticos. Además, agonista y / o antagonista pueden ser fácilmente aplicadas a las neuronas en las preparaciones rebanada. Esto pe...

Microcircuitos neuronales entre dos neuronas sinápticamente acoplados son los bloques de construcción de redes a gran escala en el cerebro y son las unidades fundamentales de procesamiento de la información sináptica. Un requisito previo para la caracterización de tales microcircuitos neuronales es conocer la morfología y propiedades funcionales de las neuronas asociadas ambos pre y postsinápticos, el tipo de la conexión sináptica (s) y su estructura y mecanismo funcional. Sin embargo, en muchos estudios de conexiones sinápticas al menos una de las neuronas en un microcircuito no está bien caracterizado. Esto resulta de los protocolos de estimulación relativamente inespecíficos menudo utilizados en los estudios de la conectividad sináptica. Por lo tanto, las propiedades estructurales y funcionales de la neurona presináptica o bien no están identificados en absoluto o sólo a una parte bastante pequeña medida (es decir, la expresión de proteínas marcadoras etc.). Grabaciones pareadas en combinación con tinción intracelular de marcadores such como biocitina, neurobiotin o tintes fluorescentes son más adecuados para el estudio de pequeños microcircuitos neuronales. Esta técnica permite a uno investigar muchos parámetros estructurales y funcionales de una conexión sináptica morfológicamente identificado al mismo tiempo. Las denominadas conexiones monosynaptic &#39;unitarios&#39; entre dos neuronas se han investigado en ambas regiones cerebrales corticales y subcorticales 1-10 utilizando el tramo preparativos agudas. Inicialmente, se utilizaron microelectrodos afilados en estos experimentos; más tarde, la grabación de patch clamp fue empleado para obtener grabaciones de señales sinápticas con un nivel de ruido inferior y una mejor resolución temporal. Un avance técnico significativo fue el uso de contraste de interferencia diferencial de infrarrojos (IR-DIC) óptica 11-14, una técnica microscópica que mejoró significativamente la visibilidad y la identificación de las neuronas en el cerebro rebanada de manera que se hizo posible to obtener grabaciones de las conexiones sinápticas identificados visualmente 15-17. En general, las grabaciones pareados se realizan en el tramo preparativos agudas; sólo muy pocas publicaciones son grabaciones de informes disponibles de neuronas conectadas sinápticamente in vivo 18-20. La ventaja más importante de grabaciones emparejados es el hecho de que una caracterización funcional puede ser combinado con un análisis morfológico, tanto en la luz y nivel microscópico de electrones (véase, por ejemplo., 7,16,21). Después del procesamiento histoquímica, la morfología dendrítica y axonal del par de neuronas conectadas sinápticamente se traza. Posteriormente, es posible cuantificar las características morfológicas, como la longitud, la densidad espacial, la orientación, el patrón de ramificación etc. Estos parámetros pueden entonces servir de base para una clasificación objetiva de una conexión sináptica específica. Además, en contraste a la mayoría de otras técnicas utilizadas para el estudio de connecti neuronalesVity, emparejado grabaciones también permiten la identificación de los contactos sinápticos para las conexiones sinápticas unitarios. Esto se puede hacer directamente utilizando una combinación de luz y microscopía electrónica 16,21-27 o el uso de imágenes de calcio 28,29 de las espinas dendríticas. Sin embargo, con este último enfoque sólo excitatorio pero no conexiones inhibitorias se pueden estudiar ya que requiere la entrada de calcio a través de los canales de los receptores postsinápticos. Además de un análisis detallado de la transmisión sináptica en un microcircuito emparejado grabaciones neuronales definidas también permitir que el estudio de las reglas de plasticidad sináptica 30,31 o - en combinación con la aplicación agonista / antagonista - la modulación de la transmisión sináptica por los neurotransmisores tales como la acetilcolina 32 y adenosina 33.

<table><tbody><tr><td>Amplificador</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triple</td><td>con 2 - 3 preamplificadores</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>con 2 puertos de cámara, un objetivo 4X y un objetivo de inmersión en agua 40X</td></tr><tr><td>Cámara</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>cámara CCD infrarroja</td></tr><tr><td></td><td>Estación de trabajo Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>con una platina x-y motorizada y un eje de enfoque motorizado para el microscopio</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Luigs & Manipuladores Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z para 2 - 3 preamplificadores</td></tr><tr><td>jaula de Faraday</td><td>Luigs & Mesa</td> antivibratoria Neumann <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Neurolucida</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>con softwares Neurolucida y Neuroexplorer</td></tr></tbody></table>

electrofisiológico y caracterización morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro usando emparejados patch-clamp grabaciones

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

La combinación de grabaciones de patch clamp de dos (o más) las neuronas sinápticamente acoplados (grabaciones emparejadas) en forma de preparados agudos cortes de cerebro con relleno biocitina intracelular simultánea permite un análisis de correlación de sus propiedades estructurales y funcionales. Con este método es posible identificar y caracterizar las neuronas pre y postsinápticos por su morfología y patrón de respuesta electrofisiológica. Grabaciones apareadas permiten el estudio de los patrones de conectividad entre estas neuronas, así como las propiedades tanto de la transmisión sináptica química y eléctrica. Aquí, le damos una descripción paso a paso de los procedimientos necesarios para obtener grabaciones pareadas fiables junto con una óptima recuperación de la morfología de las neuronas. Vamos a describir cómo se identifican los pares de neuronas conectadas a través de las sinapsis químicas o cruces brecha en el tramo preparativos cerebro. Vamos a describir cómo se reconstruyen las neuronas para obtener su morfología 3D del Dendritic y dominio axonal y cómo los contactos sinápticos son identificados y localizados. También discutiremos las salvedades y limitaciones de la técnica de grabación emparejado, en particular los relacionados con truncamientos dendríticas y axonales durante la preparación de cortes de cerebro, porque esto afecta fuertemente las estimaciones de conectividad. Sin embargo, debido a la versatilidad del enfoque de grabación emparejado seguirá siendo una herramienta valiosa en la caracterización de diferentes aspectos de la transmisión sináptica en microcircuitos neuronales identificados en el cerebro.

Grabaciones vinculados son el método de elección para una caracterización en profundidad de las conexiones sinápticas uni o bidireccionales morfológicamente identificados, así como las uniones comunicantes conexiones (eléctricas) (Figura 1). Un ejemplo de una grabación emparejado en la capa 4 de la corteza somatosensorial barril se muestra en la Figura 1A. Tanto excitador unidireccional y conexiones sinápticas inhibitorias pueden ser caracterizadas (Figura 1B, C). Ademá...

registros de patch-clamp y el llenado simultáneo de biocitona intracelular de neuronas sinápticamente acopladas en cortes agudos de cerebro permiten un análisis correlacionado de sus propiedades estructurales y funcionales. El objetivo de este protocolo es describir los pasos técnicos esenciales del registro electrofisiológico a partir de microcircuitos neuronales y su posterior análisis morfológico.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar cómo se caracterizan tanto funcional como estructuralmente las conexiones sinápticas entre neuronas identificadas morfológicamente. Esto se logra mediante la obtención de cortes agudos de cerebro, que están optimizados para estudiar una conexión sináptica particular. A continuación, se utiliza el pinzamiento de parches para detectar neuronas acopladas sinápticamente.Para ello, se coloca un parche en una posible neurona postsináptica individual y se utiliza una segunda pipeta para estimular las neuronas circundantes con el fin de establecer la existencia de una conexión sináptica. Si no se observa ninguna respuesta, se mueve el electrodo estimulador. Una vez que se encuentra una conexión, la neurona presináptica se vuelve a emparejar en modo mayorista.Después de los registros electrofisiológicos de estas neuronas y los rellenos simultáneos de biotina, se fija el corte, se procesa para biotina y se realizan reconstrucciones 3D asistidas por computadora de las neuronas. En última instancia, nuestro método tiene como objetivo un análisis cuantitativo estructural y funcional correlacionado de los microcircuitos neuronales. La principal ventaja de los registros emparejados de neuronas acopladas sinápticamente es que podemos realizar un análisis estructural y funcional correlacionado de neuronas pre y postsinápticas en microcircuitos neuronales.Incluso más recientemente, técnicas introducidas, como la estimulación óptica de las neuronas, no han sido capaces hasta ahora de conseguirlo con tanto detalle. Este método permite estudiar las interacciones de excitación e inhibición de tipos de neuronas identificados morfológicamente y cómo se modula la actividad. Demostrando los procedimientos para las grabaciones de mascotas estará Guan.El que es postdoc en mi laboratorio. Después de preparar las rodajas de la región objetivo, déjelas incubar durante este tiempo, tire de las pipetas de parche, que deben tener un vástago largo y delgado. Después de asegurar un corte de cerebro con un arpa de platino en una cámara experimental, llene una pipeta de grabación con solución interna.Coloque la pipeta en el preamplificador y conecte una neurona postsináptica putativa en modo de celda completa utilizando una pipeta de parche de búsqueda de resistencia de ocho a 10 mega ohmios llena de una solución interna en la que las sales de potasio se reemplazan por sales de sodio. Aplique una succión suave a la pipeta de búsqueda para parchear una posible neurona presináptica en una célula suelta. Configuración adjunta.Mantenga el potencial de la membrana debajo del sello suelto entre menos 30 y menos 60 milivoltios en el modo de pinza amperimétrica. A continuación, aplique grandes pulsos de corriente de 0,2 a dos nanoamperios para provocar un potencial de acción en la célula presináptica potencial. Observe este potencial de acción como una pequeña espiguilla en la respuesta de voltaje.Ajuste la frecuencia de estimulación a 0,1 hercios para evitar el agotamiento de la respuesta postsináptica. Si la neurona postsináptica no responde a la estimulación del parche de neurona potencialmente presináptica probado, una nueva neurona presináptica potencial en modo de sello suelto. Pruebe hasta 30 neuronas potencialmente presinápticas de esta manera.Continuar usando el mismo electrodo de parche de búsqueda siempre que se pueda establecer un sello con una resistencia superior a 30 mega ohmios. Si la estimulación en el modo de sellado suelto da como resultado un EPSP o IPSP con una latencia inferior a cinco milisegundos en la neurona postsináptica, retire la pipeta de búsqueda de la neurona presináptica utilizando un electrodo de parche de registro lleno de biotina que contiene una solución interna regular con una resistencia de cuatro a ocho mega ohmios. Conecte la neurona presináptica y registre en modo de pinza de corriente de célula completa.Provocar potenciales de acción por inyección de corriente en las neuronas presinápticas y registrar la respuesta postsináptica. Almacene los datos en una computadora para su posterior análisis fuera de línea. A lo largo del registro, la biotina se difunde en la neurona para obtener una tinción adecuada.Deje que la biotina se difunda durante al menos 15 a 30 minutos, dependiendo del tamaño de la neurona. Para microcircuitos neuronales con una alta relación de conectividad, no se utiliza un electrodo de búsqueda. Más bien, comience por parchear directamente una neurona presináptica en modo de célula completa.Luego, usando un electrodo de parche lleno de parche de solución interna regular, una posible neurona postsináptica también en modo de celda completa, ambas celdas deben estar bajo control de pinza amperimétrica. Provocar un potencial de acción en la célula presináptica y monitorear la neurona postsináptica prospectiva para un potencial postsináptico. Si la neurona no muestra una respuesta a la estimulación presináptica, use un nuevo electrodo para parchear una nueva neurona nuevamente en el modo de célula completa.Cuando se encuentre una conexión, proceda con la grabación como se ha demostrado anteriormente sin cambiar la pipeta de parches. Después de fijar y montar las rodajas como se describe en el protocolo de texto, examine las neuronas marcadas con biotina bajo un microscopio óptico. Asegúrese de que los bastones axonales y las espinas dendríticas sean claramente visibles.Usando un sistema comercial de rastreo de neuronas, rastree manualmente las neuronas o los pares de neuronas acopladas sinápticamente. Asegúrese de incluir incluso colaterales axonales o dendríticas pequeñas. Utilice los trazos para obtener reconstrucciones neuronales en 3D, corrija las reconstrucciones neuronales para la contracción en las tres dimensiones espaciales en la sección apropiada del programa de trazado.Los factores de corrección de contracción para el medio de incrustación son aproximadamente 1,1 para las direcciones x e y, y aproximadamente 2,1 para la dirección Z. Un par de células acopladas recíprocamente compuesto por una estrellada espinosa y una neurona que se introduce rápidamente en ella. En la capa cortical, cuatro se llenaron con biotina.Durante el registro, los puntos verdes indican contactos sinápticos excitatorios putativos entre la neurona espinosa presináptica y la interneurona postsináptica. Los puntos azules indican contactos sinápticos inhibidores recíprocos putativos. Aquí se muestran imágenes de alta potencia de los contactos sinápticos.Los círculos abiertos verdes muestran contactos excitatorios y los círculos abiertos azules muestran contactos inhibidores. Aquí se muestra una reconstrucción neurolúcida de este par de células conectadas recíprocamente. El axón interneuronal se muestra en azul y su soma y dendrita se muestran en rojo.El axón de las neuronas espinosas se muestra en verde y su soma y diva están en blanco. El recuadro muestra los compartimentos dendríticos somato de las neuronas pre y postsinápticas. Junto con los contactos sinápticos putativos, se identificaron contornos de barril en las fotomicrografías de campo claro de baja potencia realizadas a partir del corte agudo de cerebro.Aquí se muestra una conexión sináptica representativa con una relación de conectividad muy baja. Un potencial de acción presináptico en una célula parametálica de capa seis evocó un potencial postsináptico postsináptico monos en una neurona parametálica estrella de capa cuatro. La latencia que se muestra aquí de más de tres milisegundos de esta conexión translaminar es mucho más larga que la latencia de aproximadamente un milisegundo observada en las conexiones intralaminares locales.Dos potenciales de acción a 10 hercios provocados en la célula parametálica de la capa seis desencadenaron potenciales postsinápticos en la neurona parametálica estrella de la capa cuatro que se muestra aquí. Nótese la facilitación a corto plazo. Es importante recordar que la condición de corte debe optimizarse para una conexión sináptica determinada, y que durante la grabación la configuración debe ser absolutamente estable y luego se garantiza la comprensión óptima de la grabación.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se utilizan las mediciones electrofisiológicas y las reconstrucciones morfológicas para obtener una imagen general de las propiedades estructurales y funcionales de los microcircuitos neuronales en el neocórtex.

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Investigación

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Aprende a caracterizar microcircuitos neuronales mediante grabaciones de patch-clamp pareadas en rodajas agudas de cerebro. Este método combina análisis electrofisiológico y morfológico para estudiar conexiones sinápticas.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones (Video) | JoVE Journal

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

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