Name: Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a caracterizar microcircuitos neuronales mediante grabaciones de patch-clamp pareadas en rodajas agudas de cerebro. Este método combina análisis electrofisiológico y morfológico para estudiar conexiones sinápticas.

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del Grupo de 'Función de los Microcircuitos Neuronales' en el Instituto de Neurociencia y Medicina, INM-2, Centro de Investigación Jülich y al Grupo de 'Función de los Microcircuitos Corticales' en el Departamento de Psiquiatría, Psicoterapia y Psicosomática, Facultad de Medicina, JARA, Universidad RWTH de Aquisgrán por sus fructíferas discusiones. Este trabajo ha contado con el apoyo del grupo de investigación DFG sobre la función de la corteza del barril (BaCoFun).

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Grabaciones apareadas de excitatorio sinápticamente acoplado y / o las neuronas inhibidoras son un enfoque muy versátil para el estudio de microcircuitos neuronales. No sólo este enfoque permite a uno estimar la conectividad sináptica entre tipos de neuronas sino que también permite la determinación de las características funcionales de la conexión y la morfología de las neuronas pre y postsinápticos. Además, agonista y / o antagonista pueden ser fácilmente aplicadas a las neuronas en las preparaciones rebanada. Esto pe...

Microcircuitos neuronales entre dos neuronas sinápticamente acoplados son los bloques de construcción de redes a gran escala en el cerebro y son las unidades fundamentales de procesamiento de la información sináptica. Un requisito previo para la caracterización de tales microcircuitos neuronales es conocer la morfología y propiedades funcionales de las neuronas asociadas ambos pre y postsinápticos, el tipo de la conexión sináptica (s) y su estructura y mecanismo funcional. Sin embargo, en muchos estudios de conexiones sinápticas al menos una de las neuronas en un microcircuito no está bien caracterizado. Esto resulta de los protocolos de estimulación relativamente inespecíficos menudo utilizados en los estudios de la conectividad sináptica. Por lo tanto, las propiedades estructurales y funcionales de la neurona presináptica o bien no están identificados en absoluto o sólo a una parte bastante pequeña medida (es decir, la expresión de proteínas marcadoras etc.). Grabaciones pareadas en combinación con tinción intracelular de marcadores such como biocitina, neurobiotin o tintes fluorescentes son más adecuados para el estudio de pequeños microcircuitos neuronales. Esta técnica permite a uno investigar muchos parámetros estructurales y funcionales de una conexión sináptica morfológicamente identificado al mismo tiempo. Las denominadas conexiones monosynaptic &#39;unitarios&#39; entre dos neuronas se han investigado en ambas regiones cerebrales corticales y subcorticales 1-10 utilizando el tramo preparativos agudas. Inicialmente, se utilizaron microelectrodos afilados en estos experimentos; más tarde, la grabación de patch clamp fue empleado para obtener grabaciones de señales sinápticas con un nivel de ruido inferior y una mejor resolución temporal. Un avance técnico significativo fue el uso de contraste de interferencia diferencial de infrarrojos (IR-DIC) óptica 11-14, una técnica microscópica que mejoró significativamente la visibilidad y la identificación de las neuronas en el cerebro rebanada de manera que se hizo posible to obtener grabaciones de las conexiones sinápticas identificados visualmente 15-17. En general, las grabaciones pareados se realizan en el tramo preparativos agudas; sólo muy pocas publicaciones son grabaciones de informes disponibles de neuronas conectadas sinápticamente in vivo 18-20. La ventaja más importante de grabaciones emparejados es el hecho de que una caracterización funcional puede ser combinado con un análisis morfológico, tanto en la luz y nivel microscópico de electrones (véase, por ejemplo., 7,16,21). Después del procesamiento histoquímica, la morfología dendrítica y axonal del par de neuronas conectadas sinápticamente se traza. Posteriormente, es posible cuantificar las características morfológicas, como la longitud, la densidad espacial, la orientación, el patrón de ramificación etc. Estos parámetros pueden entonces servir de base para una clasificación objetiva de una conexión sináptica específica. Además, en contraste a la mayoría de otras técnicas utilizadas para el estudio de connecti neuronalesVity, emparejado grabaciones también permiten la identificación de los contactos sinápticos para las conexiones sinápticas unitarios. Esto se puede hacer directamente utilizando una combinación de luz y microscopía electrónica 16,21-27 o el uso de imágenes de calcio 28,29 de las espinas dendríticas. Sin embargo, con este último enfoque sólo excitatorio pero no conexiones inhibitorias se pueden estudiar ya que requiere la entrada de calcio a través de los canales de los receptores postsinápticos. Además de un análisis detallado de la transmisión sináptica en un microcircuito emparejado grabaciones neuronales definidas también permitir que el estudio de las reglas de plasticidad sináptica 30,31 o - en combinación con la aplicación agonista / antagonista - la modulación de la transmisión sináptica por los neurotransmisores tales como la acetilcolina 32 y adenosina 33.

<table><tbody><tr><td>Amplificador</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triple</td><td>con 2 - 3 preamplificadores</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>con 2 puertos de cámara, un objetivo 4X y un objetivo de inmersión en agua 40X</td></tr><tr><td>Cámara</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>cámara CCD infrarroja</td></tr><tr><td></td><td>Estación de trabajo Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>con una platina x-y motorizada y un eje de enfoque motorizado para el microscopio</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Luigs & Manipuladores Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z para 2 - 3 preamplificadores</td></tr><tr><td>jaula de Faraday</td><td>Luigs & Mesa</td> antivibratoria Neumann <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Neurolucida</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>con softwares Neurolucida y Neuroexplorer</td></tr></tbody></table>

electrofisiológico y caracterización morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro usando emparejados patch-clamp grabaciones

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

La combinación de grabaciones de patch clamp de dos (o más) las neuronas sinápticamente acoplados (grabaciones emparejadas) en forma de preparados agudos cortes de cerebro con relleno biocitina intracelular simultánea permite un análisis de correlación de sus propiedades estructurales y funcionales. Con este método es posible identificar y caracterizar las neuronas pre y postsinápticos por su morfología y patrón de respuesta electrofisiológica. Grabaciones apareadas permiten el estudio de los patrones de conectividad entre estas neuronas, así como las propiedades tanto de la transmisión sináptica química y eléctrica. Aquí, le damos una descripción paso a paso de los procedimientos necesarios para obtener grabaciones pareadas fiables junto con una óptima recuperación de la morfología de las neuronas. Vamos a describir cómo se identifican los pares de neuronas conectadas a través de las sinapsis químicas o cruces brecha en el tramo preparativos cerebro. Vamos a describir cómo se reconstruyen las neuronas para obtener su morfología 3D del Dendritic y dominio axonal y cómo los contactos sinápticos son identificados y localizados. También discutiremos las salvedades y limitaciones de la técnica de grabación emparejado, en particular los relacionados con truncamientos dendríticas y axonales durante la preparación de cortes de cerebro, porque esto afecta fuertemente las estimaciones de conectividad. Sin embargo, debido a la versatilidad del enfoque de grabación emparejado seguirá siendo una herramienta valiosa en la caracterización de diferentes aspectos de la transmisión sináptica en microcircuitos neuronales identificados en el cerebro.

Grabaciones vinculados son el método de elección para una caracterización en profundidad de las conexiones sinápticas uni o bidireccionales morfológicamente identificados, así como las uniones comunicantes conexiones (eléctricas) (Figura 1). Un ejemplo de una grabación emparejado en la capa 4 de la corteza somatosensorial barril se muestra en la Figura 1A. Tanto excitador unidireccional y conexiones sinápticas inhibitorias pueden ser caracterizadas (Figura 1B, C). Ademá...

registros de patch-clamp y el llenado simultáneo de biocitona intracelular de neuronas sinápticamente acopladas en cortes agudos de cerebro permiten un análisis correlacionado de sus propiedades estructurales y funcionales. El objetivo de este protocolo es describir los pasos técnicos esenciales del registro electrofisiológico a partir de microcircuitos neuronales y su posterior análisis morfológico.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar cómo se caracterizan tanto funcional como estructuralmente las conexiones sinápticas entre neuronas identificadas morfológicamente. Esto se logra mediante la obtención de cortes agudos de cerebro, que están optimizados para estudiar una conexión sináptica particular. A continuación, se utiliza el pinzamiento de parches para detectar neuronas acopladas sinápticamente.Para ello, se coloca un parche en una posible neurona postsináptica individual y se utiliza una segunda pipeta para estimular las neuronas circundantes con el fin de establecer la existencia de una conexión sináptica. Si no se observa ninguna respuesta, se mueve el electrodo estimulador. Una vez que se encuentra una conexión, la neurona presináptica se vuelve a emparejar en modo mayorista.Después de los registros electrofisiológicos de estas neuronas y los rellenos simultáneos de biotina, se fija el corte, se procesa para biotina y se realizan reconstrucciones 3D asistidas por computadora de las neuronas. En última instancia, nuestro método tiene como objetivo un análisis cuantitativo estructural y funcional correlacionado de los microcircuitos neuronales. La pr

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Investigación

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Neurociencia

Un enfoque multifacético para investigar cambios funcionales en los circuitos del hipocampo se explica. Técnicas electrofisiológicas se describen junto con el protocolo de lesión, las pruebas de comportamiento y método de disección regional. La combinación de estas técnicas se pueden aplicar de forma similar para otras regiones del cerebro y preguntas científicas.

Las investigaciones sobre alteraciones de la función del circuito del hipocampo después de una lesión cerebral traumática leve

La preparación de cortes de cerebro de agudos de hipocampo aislado, así como los registros simultáneos electrofisiológicas de los astrocitos y las neuronas...

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

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Registro de las conexiones neuronales en cortes cerebrales agudos

Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

Los protocolos de bucle cerrado están cada vez más extendidos en la electrofisiología moderna. Presentamos una forma sencilla, versátil y económica de realizar protocolos electrofisiológicos complejos en neuronas piramidales corticales in vitro, utilizando un ordenador de sobremesa y una placa de adquisición digital.

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Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

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Slice Patch Clamp técnica para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje

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Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Aprende a caracterizar microcircuitos neuronales mediante grabaciones de patch-clamp pareadas en rodajas agudas de cerebro. Este método combina análisis electrofisiológico y morfológico para estudiar conexiones sinápticas.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones (Video) | JoVE Journal

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

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