Un Proteoliposoma Basada Eflujo Ensayo para determinar una sola molécula Propiedades de Cl ^- Canales y Transportadores

El objetivo general de este procedimiento es determinar cuantitativamente la actividad de transporte de los canales o transportadores de cloruro reconstituido. Esto se logra reconstituyendo primero el transportador purificado puro en liposomas a una baja densidad de modo que cada liposoma contenga cero o una copia del complejo activo. Después de eliminar los iones de cloruro externos para que haya un gradiente iónico dirigido hacia el exterior, los liposomas se agregan a la cámara de registro donde la concentración de cloruro se monitorea utilizando un electrodo sensible al cloruro. El siguiente cloruro de los liposomas se inicia mediante la adición de Val Mycin, un ionóforo de potasio, que aumenta el potencial de membrana.

Una vez que la señal alcanza el estado estacionario, el experimento se termina con la adición de detergente para disolver los liposomas. En última instancia, al medir la tasa de eflujo de cloruro de los liposomas de protea, reconstituidos con un canal o transportador purificado, es posible determinar cuantitativamente la tasa de transporte unitaria y la estequiometría del complejo proteico activo. La principal ventaja de esta técnica sobre otros enfoques existentes, como las mediciones de flujo basadas en fluorescencia, es que con esta técnica es posible determinar cuantitativamente parámetros clave del transportador reconstituido, como la tasa de rotación unitaria y la geometría del complejo.

Además de proporcionar medidas cuantitativas de estos parámetros clave, este método se puede utilizar para determinar de forma rápida y precisa el efecto de las moléculas pequeñas de mutación y monitorear las subunidades en la proteína de transferencia reconstituida. La configuración de registro consta de dos cámaras, un electrodo de cloruro, un medidor de pH con una salida eléctrica analógica o digital, un digitalizador y una computadora con el software de adquisición adecuado. Conecte el electrodo de cloruro al medidor de pH, luego conecte la salida del medidor de pH al digitalizador, que está conectado a la computadora.

Coloque el electrodo de referencia en una cámara y el cable de recodificación en la otra. A continuación, coloque las cámaras en una placa de agitación con la barra de agitación en la cámara de registro. Asegúrese de que la barra agitadora no toque el electrodo.

Conecte las cámaras con un puente de agar la noche anterior a los experimentos: hinche un gramo de perlas de cidex G 50 en 15 mililitros de tampón externo con una agitación suave durante al menos tres horas a temperatura ambiente antes de su uso. Cada experimento requiere aproximadamente tres mililitros de perlas hinchadas mientras los liposomas se descongelan a temperatura ambiente. Vierta aproximadamente tres mililitros de cuentas G 50 hinchadas en cada columna.

Déjalos secar por gravedad. Caudal a temperatura ambiente. Esto suele tardar de uno a dos minutos.

A continuación, prepare las vesículas ulares extruyendo los liposomas de protea 11 veces a través de una mini extrusora utilizando un corte de teflón de 0,4 micras. A continuación, coloque la columna en una centrífuga de tubo redondo de plástico durante 20 a 30 segundos a 1400 G en una centrífuga clínica para eliminar el exceso de solución. Después de esto, protegiendo el flujo a través, coloque la columna en un tubo de vidrio de 13 por 100 milímetros y agregue 100 microlitros de las vesículas extruidas a la columna.

Girar la columna durante un minuto a 500 G.In una centrífuga clínica, recoger aproximadamente 200 microlitros del caudal a través de los cuales se añadirán a la cámara de registro. Para realizar la medición del eflujo, coloque dos mililitros de cloruro de potasio de 100 milimolares en la cámara de referencia y 1,8 mililitros del tampón externo en la cámara de registro. Inicie el programa de adquisición.

Deje que la línea de base se equilibre. Esto puede tardar unos minutos. Una vez que la señal alcance una línea de base estable, comience a grabar.

Agregue 15 microlitros de una solución de cloruro de potasio para calibrar el sistema. A continuación, añade los liposomas. Un pequeño salto puede ser visible debido a la eliminación incompleta del cloruro externo de los liposomas proteicos.

Espere hasta que la línea de base se estabilice. A continuación, agregue CIN para iniciar flx. Deje que el FLX siga su curso en el tiempo hasta que se estabilice.

En este punto, agregue 40 microlitros de beta octacida 1.5 molar de glucocida preparado en el tampón externo para disolver todos los liposomas. Luego espere de 10 a 15 segundos. Finalice la grabación y proceda al análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.

Cuando los liposomas que contienen alto contenido de cloruro interno se sumergen en un bajo contenido de cloruro produciendo un gradiente de cloruro de 300 veces, no se observa un flujo neto de iones. Esto se debe a que los liposomas libres de proteínas tienen una baja permeabilidad intrínseca a los iones. No se observa FLX macroscópico a partir de liposomas prot reconstituidos con el transportador de cloruro acoplado a protones, C-L-C-E-C one.

Dado que la pequeña cantidad de cloruro que sale de la vesco se acumula, se acumula una carga positiva neta en el liposomado, la adición de CIN permite que los iones de potasio se muevan a través de la membrana, aliviando el potencial eléctrico e iniciando el flujo de cloruro. La reacción se termina y se mide la cantidad total de iones de cloruro contenidos en las vesículas para determinar las propiedades de las proteínas reconstituidas individuales. Los datos brutos del curso del tiempo de eflujo se convierten primero de milivoltios a una concentración de cloruro y luego se normaliza, luego se ajusta el curso del tiempo.

Se determinó que la constante de tiempo del eflujo es de 41 segundos y la fracción de liposomas que contiene cero copias activas de C-L-C-E-C uno es el punto 31, lo que indica que aproximadamente un tercio de los liposomas contienen cero proteínas activas de estos valores y midiendo el contenido de cloruro de las vesículas que contienen al menos una copia de C-L-C-E-C uno, es posible determinar una velocidad de transporte unitaria de C-L-C-E-C uno igual a aproximadamente 2.500 iones de cloruro por segundo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la necesidad de rotación de un transportador. Estos experimentos se pueden llevar a cabo en 10 a 15 minutos cuando se realizan con cuidado.

Es fundamental evaluar cuidadosamente la calidad de los liposomas, ya que las fugas afectan negativamente a las estimaciones de la tasa de renovación.