Modelado El ciclo de vida de Ebola Virus Bajo Nivel de Bioseguridad 2 Condiciones Con-Virus como partículas que contienen Tetracistronic minigenomas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en modelar el ciclo vital del virus del Ébola altamente patógeno bajo condiciones de nivel de bioseguridad dos. Esto se logra mediante la producción de partículas similares al virus, que tienen la misma composición proteica que las partículas del virus del Ébola, pero que portan un genoma miniatura en lugar del genoma viral. Un genoma miniatura es una versión reducida del genoma viral en la cual se han eliminado los genes virales y se han sustituido por un gen reportero como la luciferasa.

Es importante destacar que el genoma mini utilizado para este experimento aún conserva una serie de genes virales, que codifican las proteínas virales VP40, GP-uno dos y VP24. Las partículas similares a virus se producen mediante la expresión de un genoma mini en células 293T denominadas células productoras, junto con las proteínas virales np, VP35, VP30 y L, que en conjunto también se denominan proteínas RNP.

El minigenoma luego se replica y se transcribe en ARNm por las proteínas virales. Los ARNm codifican para el reportero luciferasa y para las proteínas virales adicionales VP40, GP-uno dos y VP24. Conjuntamente, estas tres proteínas conducen a la producción de partículas similares a virus, denominadas partículas similares a virus competentes para la transcripción y replicación o TRVLPs, ya que los nucleocápsidos en su interior son capaces de llevar a cabo la replicación y transcripción del genoma. Dado que las TLPs portan la glicoproteína del virus del Ébola GP-uno dos, pueden infectar células diana.

Estas células diana han sido previamente transfectadas con un plásmido de expresión para np, VP35, VP30 y L. Conjuntamente, estas proteínas del RNP reconocen el mini genoma que fue introducido en las células diana dentro de los TRVLP. A continuación, el mini genoma se replica y transcribe, lo que lleva a la actividad del reportero, así como a la producción de nuevos TRVLP, que pueden utilizarse nuevamente para infectar nuevas células diana.

Es importante destacar que el genoma mini no lleva la información genética necesaria para su replicación. Por lo tanto, los TRVLP no pueden infectar productivamente células que no expresen las cuatro proteínas del RNP. Esto hace que el sistema sea seguro para su uso bajo condiciones de nivel de bioseguridad dos.

La principal ventaja de este método es que permite modelar el ciclo vital completo del virus, incluyendo la replicación del genoma, la expresión de los productos génicos virales, la producción de partículas virales y la infección de células diana durante múltiples ciclos de infección bajo condiciones de nivel de bioseguridad dos. Esto significa que este trabajo puede realizarse sin necesidad de un laboratorio de contención máxima, el cual sería necesario para trabajar con virus del Ébola vivos. Este método puede combinarse con otras técnicas, como la inhibición mediada por ARN de factores celulares o la sobreexpresión de dichos factores, para estudiar el papel de estos factores en la biología viral. Asimismo, podemos introducir mutaciones en los genes virales para estudiar el papel de estos genes virales y sus productos génicos en la biología del virus.

Divida las células eliminando el medio de células 293T con una confluencia del 80 al 90 %, lavándolas dos veces con PBS y agregando dos mililitros de tripsina a las células. Espere hasta que las células adquieran una forma redondeada.

Luego, despréndalas golpeando suavemente el matraz y añadiendo ocho mL de medio con 10 %FBS a las células. Cuente las células utilizando un contador automático de células, luego diluya las células hasta dos veces 10 a la quinta células por mililitro y siembre dos mL en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Devuelva las células a un incubador húmedo a 37 grados con 5 %CO2. Después de 24 horas, transfecte las células con los plásmidos necesarios para la producción de TRVLPs. En una cabina de seguridad biológica, aspire el ADN y colóquelo en un tubo utilizando puntas con filtro. Como control negativo en un pocillo, se debe omitir el plásmido que codifica para la polimerasa viral L; en su lugar, se puede transfectar un plásmido que codifique para GFP para visualizar la eficacia de la transfección. A continuación, añada 100 microlitros de OptiMEM por pocillo al ADN. Vortexee el tubo y centrifúguelo brevemente.

A continuación, agregue 7,5 µL del reactivo de transfección transIT LT-one al ADN diluido. Vortexee suavemente el tubo e incúbelo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, mezcle suavemente la mezcla de transfección pipeteando hacia arriba y hacia abajo, luego agregue 100 µL a cada pocillo de una placa de seis pocillos de forma gota a gota.

Una vez que haya agregado los complejos de transfección a las células, agite la placa hacia adelante y hacia atrás, y de un lado a otro. No gire la placa en círculos, ya que esto provocará una transfección desigual. Después de esto, regrese las células al incubador. Veinticuatro horas después de la transfección, retire el sobrenadante de las células. Luego agregue cuatro mililitros de medio con 5 %FBS a las células y regrese la placa al incubador.

24 horas después de la transfección de las células productoras, divida las células 293T como se describió anteriormente. 24 horas después de la división, transfiéctelas con los plásmidos que codifican las proteínas RNP del virus del Ébola, así como Tim-uno, que sirve como un factor de adhesión para los virus del Ébola. 72 horas después de la transfección de las células productoras y 24 horas después de la transfección de las células diana, recolecte el sobrenadante de las células productoras y píquetelo en un tubo de 15 mililitros.

Después de haber recolectado el sobrenadante, elimine cualquier líquido restante y agregue 250 microlitros de tampón de lisis luciluminescente a las células e incúbelas durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, determine la actividad de luciferasa según se describe en el paso tres de este video. Mientras tanto, centrifugue el sobrenadante de las células productoras durante cinco minutos a 800 g y temperatura ambiente.

Luego, retire el medio de las células diana y agregue tres mililitros del sobrenadante clarificado de las células P-cero a las células diana. Hágalo en un pocillo a la vez. Cuando termine, regrese las células diana al incubador. 24 horas después de la infección.

Elimine el sobrenadante de las células diana. A continuación, agregue cuatro mililitros de medio con 5 %FBS a las células y devuélvalas al incubador. Para determinar la actividad del gen reportero en células productoras o células diana, estas células se recolectan 72 horas después de la transfección en el caso de las células productoras y 72 horas después de la infección en el caso de las células diana.

Para ello, retire el sobrenadante de las células y agregue 250 microlitros de tampón de lisis luminiscente a las células, incubándolas durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Si se desea, el sobrenadante puede utilizarse para infectar un nuevo conjunto de células diana. En este caso, recoja el sobrenadante e infecte las células diana como se describe en el paso dos de este video.

Mientras tanto, descongele 40 microlitros por pocillo de tampón para el ensayo de luciferasa y agregue un volumen de sustrato de luciferasa equivalente a una centésima parte al tampón. Vortexee el reactivo finalizado de luciferasa y asegúrese de que haya alcanzado la temperatura ambiente antes de continuar. Luego, pipetee 40 microlitros del reactivo en una placa blanca opaca de 96 pocillos. Para evitar problemas de crosstalk, se recomienda dejar un pocillo libre entre los pocillos de muestra. Una vez finalizada la incubación de 10 minutos, lave las células hacia el tampón de lisis mediante pipeteo y transfiera el lisado celular a un tubo. Centrifugue los lisados durante tres minutos a 10.000 g y temperatura ambiente. Posteriormente, pipetee 40 microlitros de los lisados en la placa de 96 pocillos que contiene el reactivo de luciferasa. Incube las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras los 10 minutos, mida la actividad de luciferasa utilizando un luminómetro. El tiempo de integración para la medición de luminiscencia debe ser de un segundo. Con un luminómetro para microplacas Modulus, las señales típicas de luminiscencia para el control positivo deberían estar alrededor de 1 × 10⁶ a 1 × 10⁷, mientras que la señal para el control negativo debería ser al menos dos a tres órdenes de magnitud más baja. En pasajes posteriores, la actividad del reportero en los controles positivos debería mantenerse estable, mientras que la actividad del reportero en los controles negativos debería disminuir hasta niveles de fondo.

Después de ver este video, usted debería ser capaz de producir partículas virales similares al virus del Ébola competentes para la replicación y transcripción, utilizarlas para infectar células diana y medir la actividad del reportero en las células productoras y en las células diana.

Es importante destacar que este método puede combinarse con otras técnicas, como la inhibición mediada por ARN de factores celulares, para estudiar el papel de estos factores en la biología viral. Asimismo, se pueden introducir mutaciones en los componentes virales utilizados en este método con el fin de estudiar la función de estos componentes en el ciclo vital del virus de Ébola. En el manuscrito que acompaña a este video se pueden encontrar más detalles experimentales y reactivos específicos.