Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

El objetivo general de este procedimiento es homogeneizar rápidamente fragmentos de tejido humano en una sola suspensión celular sin digestión enzimática para el análisis cualitativo y cuantitativo y el aislamiento de subpoblaciones de linfocitos específicos. Esto se logra usando primero un bisturí estéril para cortar los fragmentos de tejido en trozos pequeños. A continuación, la suspensión de tejido se transfiere a un tubo disociado mecánico donde los fragmentos se homogeneizan aún más en una suspensión de una sola célula.

A continuación, las células se recogen por centrifugación para su análisis posterior. En última instancia, la citometría de flujo se puede utilizar para analizar los linfocitos infiltrantes, subpoblaciones asiáticas. Mi laboratorio desarrolló esta técnica porque buscábamos una forma de obtener imágenes de los linfocitos infiltrantes de tumores sin afectar drásticamente su estado nativo.

Queríamos algo en lo que pudiéramos aislar rápidamente las células y analizarlas tal y como estaban en la cirugía. Esta técnica se ha utilizado en más de 300 tumores de mama y tejidos normales en nuestro laboratorio, es fácil de usar y se puede utilizar en el día a día. Se puede utilizar para examinar los marcadores pronósticos, la respuesta al tratamiento y los resultados clínicos a largo plazo.

Demostrando esta técnica hoy estará John Nicola Loic. Un técnico de mi laboratorio Comience pesando la muestra de tejido y luego mida la longitud, el ancho y la altura del tejido. A continuación, transfiera el fragmento de tejido a una pequeña placa de Petri que contenga un mililitro del medio de células hematopoyéticas libres de suero adecuado, químicamente definido, y utilice un bisturí estéril para cortar las muestras en trozos pequeños de uno o dos milímetros cuadrados.

A continuación, transfiera el contenido del plato a un tubo C de disociación mecánica y enjuague el plato y el bisturí con dos mililitros de medio. Agregue el lavado al tubo C y luego ejecute el programa de disociación mecánica de 0.01 dos veces seguidas para homogeneizar suavemente los fragmentos de tejido en una suspensión de una sola célula. Después del segundo ciclo, decantar el homogeneizado a través de un colador de celdas de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.

A continuación, utilice la misma plaga que su pipeta de lavar la placa de Petri para transferir cualquier líquido que quede en el tubo C al filtro de células. A continuación, utilice una micropipeta de un mililitro para transferir el líquido filtrado a un tubo cónico de 15 mililitros y enjuague el tubo C con tres mililitros adicionales de medio. Transfiera este lavado a través del filtro de celdas al tubo de 50 mililitros.

A continuación, mueva suavemente el tejido no homogeneizado alrededor del colador con una punta limpia de un mililitro para exprimir la máxima cantidad de líquido residual atrapado en el tejido en el tubo de 50 mililitros. Ahora, coloque el colador de células boca abajo sobre el tubo C original y enjuague el filtro con tres mililitros más de medio para que el tejido no homogeneizado vuelva a caer en el tubo C. Vuelva a homogeneizar el tejido durante dos ciclos más como se acaba de demostrar, y luego vierta este segundo homogeneizado a través del filtro de células.

Nuevamente, enjuague el tubo C con otros tres mililitros de medio. A continuación, filtre el sobrenadante a través del colador y exprima el líquido residual del tejido como se acaba de demostrar. En este punto, debe haber un volumen de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensión de una sola célula en el tubo de 15 mililitros, y se deben observar aproximadamente nueve mililitros en el tubo de 50 mililitros.

Para separar el sobrenadante tisular de las células, primero se centrifugan, se homogeneizan ambos tubos durante 15 minutos a 600 Gs y temperatura ambiente, se decanta el sobrenadante del tubo de 15 mililitros en un tubo de 1,5 mililitros, colocándolo a cuatro grados centígrados y se desecha el sobrenadante del tubo de 50 mililitros. A continuación, golpee suavemente cada tubo sobre una superficie dura para romper cada uno de los gránulos de la célula. Vuelva a suspender el pellet de celda suelta en el tubo de 50 mililitros con 500 microlitros de medio y transfiera las celdas al tubo de 15 mililitros para resuspender el segundo pellet.

A continuación, enjuague el tubo de 50 mililitros con otros 500 microlitros de medio y transfiera el lavado al tubo de 15 mililitros para obtener la máxima recuperación celular. Después de contar el número de células viables mediante una bolita de exclusión azul de trian, la suspensión celular. Por último, centrifuga el sobrenadante de tejido reservado.

A continuación, transfiera con cuidado el sobrenadante a al menos un tubo limpio sin tocar ni alterar el pellet y guárdelo a menos 80 grados centígrados para futuros análisis posteriores. En estos gráficos, se muestran diagramas de puntos representativos de citometría de flujo de homogeneizados de células tumorales disociadas, seguidos de marcaje con anticuerpos específicos contra leucocitos y marcadores de células epiteliales. Este protocolo no altera significativamente la viabilidad de las células CD 45 positivas.

Sin embargo, hay una pérdida considerable de células EPAM positivas viables. A pesar de esto, los subconjuntos viables EPAM positivos y CD 45 positivos se pueden segregar en función de su tamaño y estructura en células tumorales epiteliales grandes, células epiteliales pequeñas o células CD 45 positivas grandes y pequeñas. Aquí se muestran diagramas de puntos representativos de citometría de flujo de los principales subconjuntos de infiltrantes tumorales con los linfocitos determinados en función de la viabilidad de las células CD 45 positivas.

Finalmente, la expresión de citocinas o inmunoglobulinas totales presentes en el sobrenadante del cáncer de mama se puede comparar con el sobrenadante del tejido mamario normal revelando, como se demostró en este experimento representativo, aumentos en ambos tipos de proteínas asociadas con el tejido tumoral. su análisis de puntos finales.