Name: Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende a disociar tejidos humanos frescos sin enzimas para analizar linfocitos infiltrantes mediante citometría de flujo. Este método preserva el estado nativo de las células CD45+ para estudios inmunológicos.

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Este trabajo fue apoyado por becas fromthe Fondo Belga para la Investigación Científica (FNRS), Les Amis de l&#39;Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Cáncer del Plan de Bélgica, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson y Fonds Barsy.

NOTA: Todos los especímenes fueron adquiridos utilizando un protocolo aprobado por el Comité de Ética Médica del Instituto Jules Bordet con el consentimiento informado por escrito obtenido de cada paciente. 1. Preparación del homogeneizado de tejido <ol><li> Diseccionar tejidos resecados (tejido maligno y normal resecado de la sala de operaciones) están en el laboratorio de patología por personal capacitado para su recogida inmediata. Tumor, NANT (tomada la distancia más alejada del tumor como sea posible) y fragmentos de tejido normal se procesan de forma rutinaria plazo de 1 - 3 horas de la escisión quirúrgica en un laboratorio BSL2 usando procedimientos de bioseguridad estándar para los tejidos humanos. Un diagrama de flujo del protocolo se ilustra en la Figura 1. </li><li> Pesar todos los fragmentos de tejido (normal, NANT y tumorales) y medir la longitud, anchura y altura (largo x ancho x alto). Este es un paso importante para la posterior normalización de las subpoblaciones de células, el ARN extraído, etc. NOTE: El rango de tamaño de la muestra es de 100 a 10.000 mm 3 con nada de grasa si es posible. </li><li> Pie de imprenta el fragmento del tumor en un portaobjetos de vidrio para tinción H &amp; E para verificar que el tejido es en realidad parte del tumor. <ol><li> Para ello, pulsando un microscopio portaobjetos de vidrio en el fragmento del tumor y aplicar una suave presión con los dedos durante unos segundos. </li><li> Fijar el portaobjetos con isopropanol durante 2 min seguido de una etapa de lavado en agua. Contratinción el tejido durante 30 segundos con hematoxilina de Mayer. </li><li> Lave la diapositiva en seis baños de agua. Teñir en Floxina B 2% durante 15 s. </li><li> Lave en un baño de agua, seguido de cuatro baños de isopropanol y terminar con un baño de agua. </li><li> Incubar en isopropanol durante 1 min y de drenaje. Claro en dos baños de xileno. </li><li> Montar con medio de montaje basado xileno. Examine para celularidad tumoral (Figura 2). NOTA: Principalmente, las células tumorales se adhieren a la diapositiva improntado - el estroma, linfoide o adipose células raramente permanecen, dejando espacios entre las células tumorales (Figura 2). </li></ol></li><li> Coloque el fragmento de tejido en un pequeño plato de cultivo que contiene 1 ml de la, medio de células hematopoyéticas libre de suero definido químicamente (en lo sucesivo denominado medio) a temperatura ambiente y trocea en pedazos pequeños (~ 1 - 2 mm 2) utilizando un estéril bisturí. </li><li> Transferir todo (fragmentos de tejido + medio) a un tubo disociador C mecánica. </li><li> Enjuague la placa de Petri y el bisturí con 2 ml de medio con una pipeta Pasteur y añadir esta al tubo C (volumen de medio para la disociación = 3 ml). </li><li> Utilice la A.01 programa disociador mecánico para tubos C (el programa más suave) para homogeneizar los fragmentos de tejido en una suspensión de células individuales. Coloque el tubo de C en el aparato y ejecutar el programa dos veces seguidas (un ciclo = 25 segundos). NOTA: Este procedimiento de homogeneización se ha establecido y validado por el tejido mamario humano, otra tumo tejido o tipos pueden necesitar usar un programa diferente y debe ser probado primero. </li><li> Retire el tubo C del aparato y decantar el homogeneizado directamente en un filtro de células de 40 micras sentado en un tubo de 50 ml. Usando la misma pipeta Pasteur como en el paso 1.6, transferir cualquier líquido restante en el tubo C para el filtro de células. </li><li> Transferir el líquido filtrado en un tubo de 15 ml con una punta de micropipeta 1 ml. Temporalmente mantener el filtro de células y su tubo 50 ml. </li><li> Enjuague el tubo C con un adicional de 3 ml de medio y transferir este, de nuevo utilizando la misma pipeta Pasteur como en el paso 1.6, para el filtro de células todavía sentado en el tubo de 50 ml. Exprima una cantidad máxima del líquido residual atrapado en el tejido no homogeneizada en el tubo de 50 ml moviendo suavemente alrededor del filtro con una pipeta Pasteur limpia o 1 ml punta que posteriormente desechado para evitar contaminar el eluido. </li><li> Coloque el colador celular al revés de tél tubo C original y enjuague con 3 ml de medio para que el tejido no homogeneizada cae de nuevo en el tubo C. </li><li> Vuelva a homogeneizar como en el paso 1.7 para dos ciclos del programa A.01. </li><li> Verter esta segunda homogeneizado a través del filtro de células sentado en el tubo de 50 ml, lavar el tubo C de nuevo con medio de 3 ml (como en el paso 1,10) y transferir con la pipeta Pasteur para el filtro de células sentado en el tubo de 50 ml de nuevo apretando un máximo cantidad de líquido desde el tejido conectivo residual atrapado en el filtro de células. </li><li> En este punto, un volumen de ~ 2,5 ml es en el tubo de 15 ml y ~ 9 ml en el tubo de 50 ml. </li></ol> 2. La separación del sobrenadante de tejidos y células <ol><li> Centrifugar los homogeneizados en los 15 ml y 50 ml tubos durante 15 min a 600 xg a temperatura ambiente. </li><li> Decantar el SN desde el tubo de 15 ml en un tubo limpio y almacenar temporalmente a 4 ° C. Este sobrenadante = tumor primario, NANT o Ti normalesDICIÓN SN (volumen final de 2,5 ml) se precisó y alicuotó antes de su almacenamiento a -80 ° C para análisis futuros (ver más abajo). </li><li> Desechar el sobrenadante del tubo de 50 ml. </li><li> Resuspender suavemente ambos sedimentos celulares en un volumen final de 1 ml de medio. Brevemente, primero romper suavemente el sedimento celular en ambos tubos (tocando el tubo sobre una superficie dura). Resuspender el sedimento celular suelta en los 50 ml con 500 l de medio y transferir la suspensión celular al tubo de 15 ml para resuspender el pellet segundos. Repita este paso una vez con los segundos 500 l de medio para la recuperación máxima de las células. </li><li> Transferencia de 10 l de la suspensión celular a un tubo pequeño, mezcle con 10 l de azul de tripano (dilución 1: 1) y contar el número de células viables utilizando un hemocitómetro. NOTA: En este punto una fracción de la suspensión celular puede también ser analizada por citometría de flujo para evaluar el tamaño celular, granularidad y si se desea un número limitado de marcadores subpoblación para más precise evaluación de la distribución relativa de célula en el homogeneizado antes de extenso análisis o experimentación. Todos los análisis por citometría de flujo incorporan etiquetado CD45 para la normalización de las subpoblaciones. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Las células del tumor, NANT, o tejido normal están ahora listos para la purificación adicional o análisis. Estos pasos adicionales son mejores cuando se realizan en el mismo día de la cirugía. NOTA: Para el análisis de citometría de flujo pero no de clasificación de células de las células rojas de la sangre residual debe ser lisadas después del marcaje de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de sangre roja tampón de lisis celular al sedimento celular, inmediatamente agitación durante 1 seg y la incubación de un mínimo de 10 min en la sala de temperatura (protegido de la luz) antes del análisis. </li></ol> 3. Aclaración del sobrenadante de Tejidos <ol><li> Centrifugar los tubos de 1,5 ml con SN tejido a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Retire con cuidado tél sobrenadante sin tocar o alterar el sedimento. Transferir a un tubo limpio (o tubos) dependiendo del número y volumen de alícuotas deseados. </li><li> Almacenar el sobrenadante a -80 ° C para uso futuro. </li></ol> 4. sangre del paciente <ol><li> Se recoge una muestra de sangre de cada paciente como un control por punción venosa en tubos heparinizados el día antes de la cirugía. Centrifugar la sangre a 400 xg durante 10 min a 20 ºC con el freno para obtener el plasma y la capa leucocitaria. </li><li> Retire el plasma y clarificar por centrifugación a 10.000 xg durante 15 min a 20 ºC. Alícuota y almacenar plasma a -80 ° C para uso futuro. Se diluye la capa leucocitaria en medio </li><li> Separar las células mononucleares utilizando estándar de centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque antes del análisis inmediato, el aislamiento subpoblación, ADN / ARN / extracción de la proteína o la criopreservación. </li></ol> 5. Citometría de Flujo <ol><li> Las células de la etiqueta según fabricacióninstrucciones del r a 4 ° C, protegido de la luz. Lisar las células rojas de la sangre en las suspensiones de células a partir de fragmentos de tejido después del marcaje de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de tampón de lisis celular al sedimento celular. </li><li> Vortex inmediatamente durante 1 segundo e incubar un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Pasar las células marcadas en un citómetro de flujo para la adquisición de datos sin lavar. </li></ol>

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<li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+human+CD8%2B+T+cells+using+autologous+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help.</a> PLoS One. 7 (1), 30229(2012).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+artificial+antigen+presenting+cells+facilitate+direct+and+efficient+expansion+of+tumor+infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes.</a> J Transl Med. 9, 131(2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.

Este estudio describe un método optimizado para la rápida preparación de los homogeneizados de tejidos normales y malignos de mama sin digestión enzimática para la clasificación posterior de células, la extracción, la criopreservación y / o análisis fenotípico de CD45 + subpoblaciones. El objetivo de este enfoque experimental es para producir imágenes de la TIL que refleja de cerca su estado in vivo y compararlos con los tejidos normales con mínima manipulación de los tejidos frescos de la sala de op...

El microambiente tumoral está compuesto por varios tipos de células, con numerosos estudios que demuestran que cada uno de ellos desempeña funciones distintas e importantes en la tumorigénesis1,2. Estos incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias infiltrantes, células estromales, células endoteliales y células tumorales3. Estudios ex vivo de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL; Las células CD45+ o leucocitos, que son predominantemente linfocitos en los tumores de mama) de muestras frescas de tejido humano se ven dificultadas por su baja frecuencia, los pequeños tamaños de muestra a menudo disponibles para la investigación y la posibilidad de pérdida de viabilidad durante la extracción. Debido a que las células inmunitarias que infiltran los tumores suelen estar presentes como pasajeros en lugar de residentes permanentes, en general son más fáciles de liberar de la matriz tisular.
Disociar el tejido tumoral mientras se mantiene la integridad celular es técnicamente desafiante y tradicionalmente se ha realizado utilizando una combinación de pasos mecánicos y enzimáticos para preparar suspensiones unicelulares4-8. Este enfoque implica largos períodos de incubación y se asocia con una reducción significativa de la viabilidad celular, así como con la pérdida de receptores de la superficie celular por escisión enzimática. Los estudios de citometría de flujo de alta calidad que caracterizan el TIL en el microambiente tumoral, así como las purificaciones limpias de las subpoblaciones de CD45+ mediante citometría de flujo o perlas recubiertas de anticuerpos, son más difíciles de lograr a partir de tejido tumoral digerido por enzimas. Además, el sobrenadante (SN) del homogeneizado tumoral resultante no es susceptible de análisis adicionales, incluida la cuantificación de las proteínas secretadas (citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas o antígenos tumorales) o el tratamiento experimental de las células normales, debido al potencial de degradación de proteínas en los digestos enzimáticos.
En nuestra búsqueda de un método para preparar homogeneizados de células individuales a partir de tejidos mamarios [incluyendo tejidos mamarios tumorales, no tumorales no adyacentes (NANT) y normales (a partir de reducciones mamarias)] sin digestión enzimática, probamos una variedad de técnicas de homogeneización mecánica. Los homogeneizados preparados utilizando un disociador mecánico aumentaron la viabilidad celular (2 veces) y la recuperación total de células (2 veces), al tiempo que preservaron la expresión del receptor de superficie. La digestión enzimática del material insoluble restante no recuperó células CD45+ adicionales, lo que sugiere que todas se liberaron en el homogeneizado inicial. Por lo tanto, este enfoque rápido y simple permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de las subpoblaciones CD45+ presentes en varios tejidos humanos normales y malignos. Una ventaja añadida de este enfoque es que el SN del homogeneizado inicial (SN de tejido primario) puede recogerse y almacenarse para su posterior análisis o experimentación.

<table><tbody><tr><td>GentleMacs Disociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine es algo equivalente</td>a la</tr><tr><td>centrífuga 5810</td><td>R Eppendorf</td><td></td><td>u otra centrífuga de mesa estándar</td></tr><tr><td>Centrífuga 5417</td><td>R Eppendorf</td><td></td><td>u otra microcentrífuga estándar</td></tr><tr><td>Esco Clase II A2 Gabinete de bioseguridad</td><td>ESCO global</td><td></td><td>u otra campana</td></tr> <tr><td>estándar BSL2Microscopio invertido</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>u otro microscopio compatible para un hemacitómetro</td></tr><tr><td>B&uuml; rker Cámara</td><td>Marienfield&nbsp;</td><td>640210</td><td>u otro hematitómetro estándar</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>u otro citómetro de flujo (se recomiendan 8-10 colores)</td></tr><tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine utiliza Filcon</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Sarstedt</td><td>72,710</td><td>u otros artículos de plástico no pirogénicos</td></tr><tr><td>Bisturí desechable</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>o bisturí estéril estándar de un solo uso</td></tr><tr><td>BD Cell Strainer 40 &micro; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>u otros artículos de plástico no pirogénicos</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>u otros artículos de plástico no pirogénicos</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 15 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>u otros artículos de plástico no pirogénicos</td></tr><tr><td>BD FACS Tubo 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>u otros artículos de plástico no pirogénicos</td></tr><tr><td>Pasteur estéril Pipeta 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>u otros artículos de plástico no pirogénicos</td></tr><tr><td>Tubo de microfuga 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>u otros artículos de plástico no pirogénicos</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>medio sin suero recomendado</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS fisiológico estándar</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>u otra mancha vital</td></tr><tr><td>VersaLyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A09777</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>Viabilidad fijable Tinte eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD3 Vio Blue</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-363</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>345769</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD8 ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>737659</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD8 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>345774</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD19 APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-643</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD45 VioGreen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-906</td><td>para experimentos de citometría de flujo</td></tr></tbody></table>

un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse tejidos humanos frescas para el análisis de los linfocitos infiltrantes

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

La capacidad de las células malignas para evadir el sistema inmune, caracterizado por el escape del tumor de ambos respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, se acepta ahora como un sello importante de cáncer. Nuestra investigación sobre el cáncer de mama se centra en el papel activo que desempeñan linfocitos infiltrantes de tumores en la progresión tumoral y la evolución del paciente. Hacia este objetivo, hemos desarrollado una metodología para el aislamiento rápido de células linfoides intactos de tejidos normales y anormales en un esfuerzo para evaluar los próximo a su estado nativo. Los homogeneizados preparados usando un espectáculo disociador mecánica tanto una mayor recuperación de la viabilidad celular y preservando al mismo tiempo la expresión receptor de superficie en comparación tejidos digeridos con enzima para. Por otra parte, la digestión enzimática del material insoluble restante no se recuperó células CD45 + adicionales que indican que las mediciones cuantitativas y cualitativas en el homogeneizado primaria probablemente reflejen realmente la infiltración de las subpoblaciones en la Fragm tejidoent. Las células linfoides en estos homogeneizados pueden ser fácilmente caracterizado usando inmunológica (fenotipo, la proliferación, etc.) o molecular (ADN, ARN y / o proteína) enfoques. Células CD45 + también pueden ser utilizados para la purificación subpoblación, la expansión in vitro o crioconservación. Un beneficio adicional de este enfoque es que el sobrenadante tejido primario a partir de los homogeneizados se puede utilizar para caracterizar y comparar citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas y antígenos presentes en tejidos normales y malignos. Este funciones de protocolo extremadamente bien para los tejidos de mama humanos y deberían ser aplicables a una amplia variedad de tejidos normales y anormales.

La digestión enzimática de fragmentos de tejido, ya sea con soluciones disponibles en el mercado de disociación de tejido o diversas mezclas de laboratorio de colagenasa, DNasa y / o inhibidores de hialuronidasa, escinden una amplia variedad de receptores en la superficie de las células. Nuestros estudios, se centró inicialmente en las células T CD4 + que infiltran los tumores de mama, se presentaron rápidamente con un problema técnico importante debido a la escisión de los receptores de CD4 de la superficie ...

Este protocolo describe la disociación rápida no enzimática de fragmentos de tejido humano fresco para la evaluación cualitativa y cuantitativa de células CD45+ (linfocitos/leucocitos) presentes en varios tejidos humanos normales y malignos. Además, el sobrenadante obtenido del homogeneizado de tejido primario puede recogerse y almacenarse para su posterior análisis o experimentación.

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

El objetivo general de este procedimiento es homogenizar rápidamente fragmentos de tejido humano en una suspensión de células individuales sin digestión enzimática, para análisis cualitativo y cuantitativo y para el aislamiento de subpoblaciones específicas de linfocitos. Esto se logra primero utilizando un escalpelo estéril para cortar los fragmentos de tejido en trozos pequeños. A continuación, la mezcla de tejido se transfiere a un tubo de disociación mecánica, donde los fragmentos se homogenizan aún más hasta obtener una suspensión de células individuales.A continuación, las células se recogen mediante centrifugación para su análisis posterior. En última instancia, la citometría de flujo puede utilizarse para analizar los linfocitos infiltrantes, subpoblaciones asiáticas. Mi laboratorio desarrolló esta técnica porque estábamos buscando un método que nos permitiera obtener imágenes de los linfocitos infiltrantes del tumor sin afectar drásticamente su estado nativo.Queríamos algo que nos permitiera aislar rápidamente las células y analizarlas tal como estaban durante la cirugía. Esta técnica se ha utilizado en más de 300 tumores de mama y tejidos normales en nuestro laboratorio, es fácil de usar y puede emplearse de forma rutinaria. Puede utilizarse para examinar marcadores pronósticos, la respuesta al tratamiento y el resultado clínico a largo plazo.Hoy, esta técnica será demostrada por John Nicola Loic, un técnico en mi laboratorio. Comience por pesar la muestra de tejido y luego mida la longitud, anchura y altura del tejido. A continuación, transfiera el fragmento de tejido a una pequeña placa de Petri que contenga un mililitro del medio celular hematopoyético adecuado, químicamente definido y libre de suero, y utilice un escalpelo estéril para cortar las muestras en pequeños trozos de uno a dos milímetros cuadrados.A continuación, transfiera el contenido del recipiente a un tubo C de disociación mecánica y enjuague el recipiente y el escalpelo con dos mililitros de medio. Añada el lavado al tubo C y luego ejecute dos veces seguidas el programa de disociación mecánica 0.01 para homogeneizar suavemente los fragmentos de tejido hasta obtener una suspensión de células individuales. Después del segundo ciclo, vierta el homogeneizado a través de un filtro celular de 40 micrómetros hacia un tubo cónico de 50 mililitros.Luego, utilice el mismo pistilador para pipeta para pasar el líquido restante en el tubo C al filtro celular, lavando la placa de Petri. A continuación, use una micropipeta de un mililitro para transferir el líquido filtrado a un tubo cónico de 15 mililitros y enjuague el tubo C con tres mililitros adicionales de medio. Pase este lavado a través del filtro celular hacia el tubo de 50 mililitros.Luego, mueva suavemente el tejido no homogeneizado dentro del colador con una punta limpia de un mililitro para exprimir la mayor cantidad posible del líquido residual atrapado en el tejido hacia el tubo de 50 mililitros. Ahora, coloque el colador celular boca abajo sobre el tubo C original y enjuague el colador con tres mililitros más de medio, de modo que el tejido no homogeneizado caiga nuevamente en el tubo C. Vuelva a homogeneizar el tejido durante dos ciclos más tal como se acaba de demostrar, y luego vierta este segundo homogenato a través del colador celular.Nuevamente, enjuague el tubo C con otros tres mililitros de medio. Luego, filtre el sobrenadante a través del colador y exprima el líquido residual del tejido tal como se acaba de demostrar. En este punto, debería haber un volumen de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensión de células individuales en el tubo de 15 mililitros, y aproximadamente nueve mililitros deberían observarse en el tubo de 50 mililitros.Para separar el sobrenadante del tejido de las células, primero centrifugue ambos tubos del homogenato durante 15 minutos a 600 G y temperatura ambiente, decante el sobrenadante del tubo de 15 mililitros a un tubo de 1,5 mililitros, colóquelo a cuatro grados Celsius y deseche el sobrenadante del tubo de 50 mililitros. Luego, golpee suavemente cada tubo sobre una superficie dura para desagregar cada uno de los botones celulares. Re_suspenda el botón celular suelto en el tubo de 50 mililitros con 500 microlitros de medio y transfiera las células al tubo de 15 mililitros para re_suspender el segundo botón.Luego, enjuague el tubo de 50 mililitros con otros 500 microlitros de medio y transfiera el lavado al tubo de 15 mililitros para obtener una recuperación máxima de células. Después de contar el número de células viables mediante exclusión con azul de trian, peletee la suspensión celular. Finalmente, centrifugue el sobrenadante de tejido reservado.Luego, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a al menos un tubo limpio sin tocar ni perturbar el precipitado y almacénelo a menos 80 grados Celsius para análisis posteriores. En estos gráficos, se muestran gráficos de dispersión representativos de citometría de flujo de homogeneizados de células tumorales disociadas, seguidos de marcado con anticuerpos específicos contra marcadores de leucocitos y células epiteliales, tal como se demuestra. Este protocolo no altera significativamente la viabilidad de las células positivas para CD 45.Sin embargo, se produce una pérdida considerable de células EPAM positivas viables. A pesar de esto, los subconjuntos viables EPAM positivos y CD45 positivos pueden segregarse en función de su tamaño y estructura en células tumorales epiteliales grandes, células epiteliales pequeñas, o células CD45 positivas grandes y pequeñas. Aquí se muestran gráficos de dispersión representativos de citometría de flujo de los principales subconjuntos infiltrantes tumorales, con los linfocitos seleccionados según la viabilidad de las células CD45 positivas.Finalmente, la expresión de citocinas o los inmunoglobulinos totales presentes en el sobrenadante de cáncer de mama pueden compararse con el sobrenadante de tejido mamario normal, revelando, como se demuestra en este experimento representativo, aumentos en ambos tipos de proteínas asociadas con el tejido tumoral. Aunque el procedimiento es sencillo, es importante recordar trabajar rápidamente y de manera limpia, y recuperar la máxima cantidad de material en cada paso del procedimiento para obtener un número suficiente de células para el análisis final.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes (Video) | JoVE Journal

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

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