Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

El objetivo general de este procedimiento es homogenizar rápidamente fragmentos de tejido humano en una suspensión de células individuales sin digestión enzimática, para análisis cualitativo y cuantitativo y para el aislamiento de subpoblaciones específicas de linfocitos. Esto se logra primero utilizando un escalpelo estéril para cortar los fragmentos de tejido en trozos pequeños. A continuación, la mezcla de tejido se transfiere a un tubo de disociación mecánica, donde los fragmentos se homogenizan aún más hasta obtener una suspensión de células individuales.

A continuación, las células se recogen mediante centrifugación para su análisis posterior. En última instancia, la citometría de flujo puede utilizarse para analizar los linfocitos infiltrantes, subpoblaciones asiáticas. Mi laboratorio desarrolló esta técnica porque estábamos buscando un método que nos permitiera obtener imágenes de los linfocitos infiltrantes del tumor sin afectar drásticamente su estado nativo.

Queríamos algo que nos permitiera aislar rápidamente las células y analizarlas tal como estaban durante la cirugía. Esta técnica se ha utilizado en más de 300 tumores de mama y tejidos normales en nuestro laboratorio, es fácil de usar y puede emplearse de forma rutinaria. Puede utilizarse para examinar marcadores pronósticos, la respuesta al tratamiento y el resultado clínico a largo plazo.

Hoy, esta técnica será demostrada por John Nicola Loic, un técnico en mi laboratorio. Comience por pesar la muestra de tejido y luego mida la longitud, anchura y altura del tejido. A continuación, transfiera el fragmento de tejido a una pequeña placa de Petri que contenga un mililitro del medio celular hematopoyético adecuado, químicamente definido y libre de suero, y utilice un escalpelo estéril para cortar las muestras en pequeños trozos de uno a dos milímetros cuadrados.

A continuación, transfiera el contenido del recipiente a un tubo C de disociación mecánica y enjuague el recipiente y el escalpelo con dos mililitros de medio. Añada el lavado al tubo C y luego ejecute dos veces seguidas el programa de disociación mecánica 0.01 para homogeneizar suavemente los fragmentos de tejido hasta obtener una suspensión de células individuales. Después del segundo ciclo, vierta el homogeneizado a través de un filtro celular de 40 micrómetros hacia un tubo cónico de 50 mililitros.

Luego, utilice el mismo pistilador para pipeta para pasar el líquido restante en el tubo C al filtro celular, lavando la placa de Petri. A continuación, use una micropipeta de un mililitro para transferir el líquido filtrado a un tubo cónico de 15 mililitros y enjuague el tubo C con tres mililitros adicionales de medio. Pase este lavado a través del filtro celular hacia el tubo de 50 mililitros.

Luego, mueva suavemente el tejido no homogeneizado dentro del colador con una punta limpia de un mililitro para exprimir la mayor cantidad posible del líquido residual atrapado en el tejido hacia el tubo de 50 mililitros. Ahora, coloque el colador celular boca abajo sobre el tubo C original y enjuague el colador con tres mililitros más de medio, de modo que el tejido no homogeneizado caiga nuevamente en el tubo C. Vuelva a homogeneizar el tejido durante dos ciclos más tal como se acaba de demostrar, y luego vierta este segundo homogenato a través del colador celular.

Nuevamente, enjuague el tubo C con otros tres mililitros de medio. Luego, filtre el sobrenadante a través del colador y exprima el líquido residual del tejido tal como se acaba de demostrar. En este punto, debería haber un volumen de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensión de células individuales en el tubo de 15 mililitros, y aproximadamente nueve mililitros deberían observarse en el tubo de 50 mililitros.

Para separar el sobrenadante del tejido de las células, primero centrifugue ambos tubos del homogenato durante 15 minutos a 600 G y temperatura ambiente, decante el sobrenadante del tubo de 15 mililitros a un tubo de 1,5 mililitros, colóquelo a cuatro grados Celsius y deseche el sobrenadante del tubo de 50 mililitros. Luego, golpee suavemente cada tubo sobre una superficie dura para desagregar cada uno de los botones celulares. Re_suspenda el botón celular suelto en el tubo de 50 mililitros con 500 microlitros de medio y transfiera las células al tubo de 15 mililitros para re_suspender el segundo botón.

Luego, enjuague el tubo de 50 mililitros con otros 500 microlitros de medio y transfiera el lavado al tubo de 15 mililitros para obtener una recuperación máxima de células. Después de contar el número de células viables mediante exclusión con azul de trian, peletee la suspensión celular. Finalmente, centrifugue el sobrenadante de tejido reservado.

Luego, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a al menos un tubo limpio sin tocar ni perturbar el precipitado y almacénelo a menos 80 grados Celsius para análisis posteriores. En estos gráficos, se muestran gráficos de dispersión representativos de citometría de flujo de homogeneizados de células tumorales disociadas, seguidos de marcado con anticuerpos específicos contra marcadores de leucocitos y células epiteliales, tal como se demuestra. Este protocolo no altera significativamente la viabilidad de las células positivas para CD 45.

Sin embargo, se produce una pérdida considerable de células EPAM positivas viables. A pesar de esto, los subconjuntos viables EPAM positivos y CD45 positivos pueden segregarse en función de su tamaño y estructura en células tumorales epiteliales grandes, células epiteliales pequeñas, o células CD45 positivas grandes y pequeñas. Aquí se muestran gráficos de dispersión representativos de citometría de flujo de los principales subconjuntos infiltrantes tumorales, con los linfocitos seleccionados según la viabilidad de las células CD45 positivas.

Finalmente, la expresión de citocinas o los inmunoglobulinos totales presentes en el sobrenadante de cáncer de mama pueden compararse con el sobrenadante de tejido mamario normal, revelando, como se demuestra en este experimento representativo, aumentos en ambos tipos de proteínas asociadas con el tejido tumoral. Aunque el procedimiento es sencillo, es importante recordar trabajar rápidamente y de manera limpia, y recuperar la máxima cantidad de material en cada paso del procedimiento para obtener un número suficiente de células para el análisis final.