Name: Metodología sintética para asimétrica Ferroceno derivados Sistemas de Bio-conjugadas vía sólida metodología a base de resina de fase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprende a sintetizar bioconjugados ferroceno-biotina asimétricos mediante síntesis en fase sólida con resina. Este método simplifica la purificación y permite la inmovilización efectiva en superficies de oro para aplicaciones en biosensores.

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KG fue apoyado por la subvención P-1760 Fundación RA Welch, TCU Instituto Andrews de Matemáticas y Educación la Ciencia (a KG), TCU Investigación y Creatividad Actividad Grant (a KG) y TCU SERC Grant (a JHS).

1. Síntesis de biotina-Fc-cisteína (1) <ol><li> Métodos en fase sólida para producir unidos a la resina 1. <ol><li> Coloque resina cargada biotina (250 mg, 0,145 mmol) en una jeringa de vidrio fritado y se hinchan la resina mediante la elaboración de dimetilformamida (5 ml) y agitando la jeringa en un agitador de laboratorio durante 20 min. Expulsar a la solución y repita dimetilformamida hinchazón una vez más. </li><li> Eliminar el grupo protector Fmoc mediante la adición de 4-6 ml de 20% de piperidina en dimetilformamida a la jeringa seguido de 10-15 min de agitación. Repita el proceso de desprotección con otro 4-6 ml de piperidina. Lavar la resina con una secuencia de 3x dimetilformamida, 3x dimetilformamida: metanol (1: 1), metanol 3x: diclorometano (1: 1), 3x diclorometano, ~ 5 ml cada uno. Hacer una prueba de la ninhidrina (+) en una pequeña muestra (~ 10) de las perlas para confirmar la desprotección con éxito por la presencia de azul después del calentamiento. </li><li> Mezcle una solución que contiene ácido 1&#39;-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico(203,3 mg, 0,4350 mmol), 1-hidroxibenzotriazol hidrato (58,8 mg, 0,413 mmol), diisopropil carbodiimida (0,0673 ml, 0,435 mmol), diisopropiletilamina (0,0757 ml, 0,435 mmol), y una mezcla 4: 1 de diclorometano y dimetilformamida. Dibuje esta en la jeringa poroso y agite suavemente en un agitador de laboratorio durante 6 horas. Entonces expulsar la solución de la jeringa y lavar como se describió anteriormente. </li><li> Realizar la prueba de la ninhidrina (-) como se describe anteriormente para confirmar acoplamiento. La prueba de la ninhidrina todavía puede ser útil para confirmar acoplamiento a pesar del color anaranjado de la perla derivado de la unión del resto que contiene hierro. </li><li> A continuación, eliminar el grupo Fmoc mediante la adición de 20% de piperidina en dimetilformamida y se lavó como se describe anteriormente. El ensayo de ninhidrina (+) se debe utilizar para confirmar la eliminación de Fmoc. </li><li> Preparar una solución compuesta de Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-hidroxibenzotriazol hidrato (58,8 mg, 0,4125 mmol), diisopropil carbodiimida (0,0673 ml, 0,4350mmol), diisopropiletilamina (0,0757 ml, 0,4350 mmol), y una mezcla 4: 1 de diclorometano y dimetilformamida. Añadir este cóctel acoplamiento cisteína la jeringa poroso y agite suavemente durante 6 horas. Lave usando el protocolo descrito anteriormente. </li><li> Confirmar el acoplamiento mediante la prueba de la ninhidrina (-), seguido de la eliminación del componente de Fmoc con piperidina al 20% y lavado. Verifique el terminal libre amina mediante la prueba de la ninhidrina (+). </li></ol></li><li> La escisión de 1 de la resina. <ol><li> Prepare una solución de TFA (9,45 ml), agua (0,25 ml), 1,2-etanoditiol (0,25 ml), y silano triisopropilo (0,1 ml), añadirlo a la jeringa y agite suavemente durante 4 horas. </li><li> Recoger la solución rojo-marrón resultante en un tubo Eppendorf y se evapora el TFA lentamente usando una corriente de aire. </li><li> Añadir éter dietílico frío (~ 15 ml) al tubo Eppendorf para precipitar 1, que formará agitación suave. Aislar el producto a través de centrifugación (1 g, 5 min). Trepetición de gallina ciclos de lavados de éter de dietilo (~ 60 ml total) y centrifugar para obtener 1 como un sólido rojo / marrón. </li></ol></li></ol> 2. Caracterización y Análisis de 1 <ol><li> Confirmar que la identidad coincide con la conectividad y la composición que se muestra en la Figura 2 usando 1 H (16 scans) y 13 C NMR (512 exploraciones) en metanol deuterado (300 l) y el análisis ESI-MS. Cuente con los siguientes resultados: Espectro de RMN 1H (CD3OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4,426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) y 13 C espectro de RMN (CD3OD) δ / ppm: 24,644 (CH 2), 25.472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28,300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38,698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (anillo Cp), 60,286 (CH), 61.964 (CH), 62.521 / 62.821 (Cp-ring), 66.038 / 66.170 (Cp-ring), 69.153 / 69.328 (Cp-ring), 71.468 / 71.593 (anillo Cp), 76.466 (CH), 171.770 (C = O), 175,361 (C = O). ESI-MS (m / z): Encontrado: 639.00 [1 + Na] +, teórico: 639,1 [1 + Na] + y HR-MS (m / z): Encontrado: 617,2049 [1 + H] +, teórico: 617.1622 [1 + H] +. </li><li> Realizar HPLC, análisis elemental para confirmar la composición de aislado 1. Llevar a cabo cromatogramas de HPLC usando una columna de fase inversa C8 con 100% de MeOH a un caudal de 0,5 ml / min. Nota: los tiempos de retención de HPLC fueron: 3,198 a 4,674 min. </li></ol> 3. Inmovilización de 1 sobre una superficie de oro <ol><li> Polímero Cut respaldado diapositivas de oro en cuadrados de ~ 0,25 en 2. </li><li> Llenar un vaso de precipitados de 50 ml con una solución de agua DI de 1 (~ 1 mM). </li><li> Añadir la diapositiva de oro al vaso de precipitados y cubrir con un vidrio de reloj. Todosow el portaobjetos de vidrio para incubar O / N a temperatura ambiente sin agitación. </li><li> Retire la diapositiva oro de la solución y permitir que se seque al aire. </li><li> Obtener la digitalización de imágenes de microscopía electrónica utilizando un microscopio electrónico de barrido (o equivalente) para observar inmovilizado 1. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La síntesis de derivados del ferroceno asimétricas es un reto en solución. Por ejemplo, los intentos para producir 1 en solución resultó en bajos rendimientos del producto deseado (menos de 20%). Asimismo, las reacciones que utilizan el ácido carboxílico 1&#39;-amino-ferroceno (sans Fmoc) y resina de biotina unido resultaron en producto insoluble consistente con el producto polimerizado reportado por Baristic et al. y el producto mínimo 47. Esto se complica aún más por el fe...

Los biosensores son dispositivos pequeños que emplean la tecnología de reconocimiento biomolecular como la plataforma para el análisis selectivo y se utilizan por su especificidad, velocidad y bajo costo. Biosensores electroquímicos para la detección de biomoléculas están a la vanguardia de este campo debido a su simplicidad, eficacia de costes, y alta sensibilidad. 1,3 La anatomía general de estos sensores es un electrodo equipado con una molécula de reconocimiento específica para el marcador biológico de interés . La unión del biomarcador por la molécula de reconocimiento se traduce en un cambio local de potencial o corriente que puede ser detectado por medición simple. Hasta la fecha, el fragmento de reconocimiento puede variar de enzimas, anticuerpos 4-8, 9-12 células enteras, 13-16, 17-20 receptores péptidos 21-23 y 24 de ADN y se han centrado en gran medida de mayor tamaño, las moléculas biológicas. 25-28 Investigación los esfuerzos en este campo se han concentrado principalmente en inmunosensores where una inmunoglobulina es inmovilizado con un núcleo activo redox (tal como ferroceno) y se utiliza para detectar un anticuerpo de interés. Estos estudios han sido excluidos de las aplicaciones clínicas debido a la escasa precisión y tiempo de consumo derivados de las complicaciones derivadas de la utilización de antígenos / anticuerpos. 1,3 creciente atención se ha centrado en la detección de moléculas pequeñas (menos de 1 kg / mol) de biomédica , la comida y el interés ambiental, además de la seguridad nacional. 29 Los ejemplos más conocidos de dispositivos biosensores son monitores de glucosa en la auto-prueba, que tienen serigrafiadas electrodos enzimáticos acoplados a un metro amperométrica bolsillo. Estos sistemas utilizan típicamente un método coulométrica donde se mide la cantidad total de carga generada por la reacción de oxidación de la glucosa durante un período de tiempo. Dispositivos negociables deben ser portátil, robusto y de mano para hacer un uso fácil para la población en general. Etiquetas redox tales como ferroceno son necessary para proporcionar la detección electroquímica de biomarcadores o pequeñas moléculas en solución como la mayoría de los biomarcadores no son intrínsecamente electroquímicamente activo. 30-38 ferroceno es una molécula organometálica que es un estándar de oro para la electroquímica, lo que hace que sea una excelente opción para la integración en biosensores electroquímicos. Especies activas redox a base de ferroceno ya han ganado considerable atención debido a su pequeño tamaño, buena estabilidad, el acceso sintético conveniente, modificación química fácil, lipofilicidad relativa, y la facilidad de sintonización redox. 3,30-42 moléculas pequeñas basado en el núcleo ferroceno tiene han utilizado ampliamente como detectores de iones metálicos y moléculas pequeñas. 32-38,43 sistemas de focalización especies más grandes, tales como biomoléculas han utilizado la fijación de grandes anticuerpos o inmunoglobulinas a derivados del ferroceno que han sido incrustados en una superficie electroquímica. 1,3,39 , 44 En cada caso, la intensi potencial y actualty de la pareja redox Fe III / Fe II se alteró tras el acoplamiento molecular, produciendo de este modo un nuevo mango espectroscópica que indica la presencia de la molécula de analito. Este cambio se debe a la amplia superposición que se produce entre el sistema pi de los anillos de ciclopentadienilo y las de hierro orbitales d. Si el sistema pi se modifica, es decir, derivado o se hace reaccionar, a continuación, la interacción orbital, a su vez, el cambio. Esto afectará el núcleo Fe y puede ser observada como un cambio en el potencial del par Fe III / Fe II. 40,45,46 Estas propiedades hacen que un sistema de este tipo atractivo para su uso como un agente de cuantificación en un inmunoensayo electroquímico o biosensor. Con el fin de producir sistemas de ferroceno que contiene específicas para capacidades de biosensores es óptimo para modificar un anillo de Cp con el específico para una molécula diana bio-receptor y utilizar el otro anillo Cp como una correa de sujeción molecular para la lectura electroquímica o elecelectrodo (Figura 1). La síntesis de estos derivados de ferroceno asimétricas es desafiada por reacciones secundarias y la formación de especies diméricas y poliméricas formadas sobre la reticulación intermolecular. 47 Sin embargo, la química de acoplamiento de la producción de un enlace amida es la ruta más directa para proporcionar derivados simples de ferroceno que implican componentes biológicos tales como péptidos y sus metabolitos. Por lo tanto, las técnicas de fase sólida desarrollados por primera vez en la década de 1950 por Merrifield de síntesis de péptidos se pueden aplicar a los compuestos organometálicos que contienen ferroceno. Mediante el uso de la molécula de ácido 1&#39;-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico ortogonalmente sustituido, un sistema de ferroceno que puede contener un resto receptor (biotina), lectura electroquímica (ferroceno), y el componente de inmovilización-enlazador (cisteína) tiene ha construido y se detalla en este documento. La síntesis de este bio-conjugado se discute, así como pruebas para la inmovilización en una superficie de oro. Este represen trabajots la primera presentación de un sistema compuesto de biotina, ferroceno y un aminoácido para la inmovilización en una superficie de oro.

<table><tbody><tr><td>Biotina Resina</td><td>Novatag NovaBiochem</td><td>8550510001</td><td></td></tr><tr><td>TORVIQ 10 ml Luer Lock Jeringa Fritada</td><td>Fisher NC9299151</td><td></td><td></td></tr><tr><td>piperidina</td><td>Acros</td><td>P/3520/PB05</td><td></td></tr><tr><td>prueba de ninhidrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017-1ea</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico</td><td>Omm Scientific Pedido</td><td>especial</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime; -Diisopropilcarbodiimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Novabiochem</td><td>8520080025</td><td></td></tr><tr><td>ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5408</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>triisopropil silano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>tubos Eppendorf (20 ml)</td><td>Cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de metanol</td><td>Cualquier fuente</td><td></td><td>Secar con tamices moleculares antes de usar y almacenar en una botella de medios de 100 ml para facilitar su uso</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Cualquier fuente</td><td></td><td>Secar con tamices moleculares antes de usar y almacenar en una botella de medios de 100 ml para un uso fácil</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Cualquier fuente</td><td></td><td>Secar con tamices moleculares antes de usar & Almacene en un frasco de medios de 100 ml para facilitar su uso</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodología sintética para asimétrica ferroceno derivados sistemas de bio-conjugadas vía sólida metodología a base de resina de fase

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

La detección temprana es la clave para el éxito del tratamiento de la mayoría de las enfermedades, y es particularmente imprescindible para el diagnóstico y el tratamiento de muchos tipos de cáncer. Las técnicas más comunes utilizados son Imaging modalidades tales como imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de Topografía (PET), y computarizada Topografía (TC) y son óptimas para la comprensión de la estructura física de la enfermedad, pero sólo se pueden realizar una vez cada cuatro a seis semanas debido a la utilización de agentes de formación de imágenes y el coste total. Con esto en mente, el desarrollo de &quot;punto de atención&quot; técnicas, como biosensores, que evalúan el estado de la enfermedad y / o la eficacia del tratamiento en el consultorio del médico y lo hacen de una manera oportuna, revolucionaría protocolos de tratamiento. 1 Como un medio para explorar biosensores basados ​​ferroceno para la detección de moléculas biológicamente relevantes 2, se han desarrollado métodos para producir bio-conjugados ferroceno-biotina descritos en este documento. Este informe se centrará en un sistema biotina-ferroceno-cisteína que puede ser inmovilizada sobre una superficie de oro.

La forma unida a resina de 1 se muestra en la Figura 2. La unión covalente del componente de ferroceno da lugar a una coloración naranja a las perlas de resina que es persistente con lavado continuo e indicativo de una plancha inmovilizada que contiene el complejo en comparación con la absorción de hierro por el componente PEG de la perla de resina. La forma libre de resina de 1 es idéntico en color a las perlas de resina. Después de la eliminación del compuesto de la r...

La síntesis de especies asimétricas de ferroceno es un desafío utilizando técnicas de solución. Este informe se centra en los métodos llevados a cabo para producir un bioconjugado de ferroceno-biotina utilizando reacciones fáciles y limpias realizadas mediante síntesis en fase sólida. Se ha demostrado que la incorporación de una fracción tiolato imparte la capacidad de inmovilización en superficies de oro.

Metodología sintética para asimétrica Ferroceno derivados Sistemas de Bio-conjugadas vía sólida metodología a base de resina de fase

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

El objetivo general del siguiente experimento es producir conjugados asimétricos de ferreno, biotina, bio que puedan inmovilizarse sobre una superficie de oro. Esto se logra mediante la síntesis del conjugado de ferreno-biotina-bio en una resina de fase sólida. Como segundo paso, el conjugado se elimina de la resina, lo que permite el aislamiento y la caracterización del compuesto.A continuación, el bioconjugado se incuba con una superficie de oro para permitir la adhesión de los talatos al oro. Los resultados muestran que un bioconjugado de ferne puede producirse con buen rendimiento y pureza, y luego inmovilizarse sobre una superficie de oro. La principal ventaja de utilizar esta técnica frente a métodos existentes como los métodos basados en solución es que la purificación es sencilla y directa.Además de evitar los subproductos generados mediante métodos basados en solución, tuvimos por primera vez la idea de este método al reflexionar sobre la eficiencia y practicidad de los sensores de glucosa utilizados para monitorear a pacientes diabéticos. Quien demostrará este procedimiento será Sean Rodich de mi laboratorio y Paulina Gonzalez, estudiantes de pregrado y posgrado, respecti

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Química

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Síntesis en fase sólida de un péptido funcionalizado Bis-El uso de &quot;Cierre de seguridad&quot; Metodología

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Aprende a sintetizar bioconjugados ferroceno-biotina asimétricos mediante síntesis en fase sólida con resina. Este método simplifica la purificación y permite la inmovilización efectiva en superficies de oro para aplicaciones en biosensores.

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