Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

El objetivo general del siguiente experimento es establecer un sistema de co-cultivo para evaluar la capacidad de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas de formar conexiones funcionales mediante un enfoque genético basado en la fotoestimulación de neuronas en cultivo a través de channel RUSIN dos o CR dos. Esto se logra primero aislado células progenitoras neurales primarias de ratón, o NPCs, y permitiendo que se diferencien en astrocitos. A continuación, neuronas corticales primarias de rata se transfectan con CH R dos y se siembran sobre la capa de astrocitos, que sirve como la población neuronal existente.

Luego, las NPC humanas derivadas de cultivos de células madre pluripotentes inducidas o cultivos de IPSC se transducen con el virus de tomate sinapsina uno 2D, y después se siembran sobre el cultivo de neuronas astrocíticas e inducidas a diferenciarse, formando posteriormente conexiones sinápticas. Los resultados muestran que las neuronas derivadas de IPSC forman conexiones sinápticas con neuronas corticales de rata, según grabaciones electrofisiológicas de corrientes postsinápticas en las neuronas derivadas de IPSC tras la estimulación foto génica de las neuronas corticales que expresan CHR dos. La ventaja principal de este método frente a los existentes, como los que consisten en cocultivos de solo astrocitos con neuronas humanas derivadas de IPSC, es que el tiempo de maduración de estas neuronas humanas es más corto.

Esto se debe a que la presencia de neuronas primarias puede acelerar la maduración de estas neuronas humanas. Quien demuestre el procedimiento será Uni Chin, estudiante de posgrado de mi laboratorio, y Y usando del laboratorio de George Augustine. Después de extraer los cerebros embrionarios de rata y aislar el tejido cortical según el protocolo descrito, transfiera los tejidos corticales a una placa que contenga la solución de digestión de tejido cortical precalentada. Pique los tejidos corticales lo más finamente posible antes de incubarlos a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Tras la incubación, transfiera los tejidos corticales a un tubo cónico de 50 mililitros, disocie los tejidos utilizando una pipeta serológica hasta obtener una solución homogénea sin fragmentos de tejido.

Pase la solución de tejido a través de un filtro celular de 70 micrones para eliminar cualquier grumo de tejido restante. Aliquote tres mililitros de solución en tubos cónicos de 15 mililitros.

Añada 800 microlitros de BSA al 7,5% en un XPBS en la parte inferior de cada tubo, formando una capa debajo de la capa de tejido. Centrifugue a 200 Gs durante cinco minutos. Luego, elimine el sobrenadante aspirando desde la interfase de las dos capas. Evite perturbar el pellet de selp en el fondo del tubo.

Después de usar un mililitro de medio neuronal primario para resuspender cada paleta celular, combínelos todos en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, utilice un hemocitómetro para determinar la densidad celular. Centrifugue 6 millones de neuronas corticales de rata a 200 G durante cinco minutos y retire el sobrenadante.

Se requieren al menos 6 millones de neuronas corticales para la electroforesis. Para asegurar la formación de una red neuronal por parte de las neuronas sobrevivientes, agregue 100 microlitros de solución de electroforesis al sedimento celular y resuspenda suavemente. Luego combine 100 microlitros de la suspensión celular con seis microgramos del plásmido CR dos y transfiera la mezcla a un vial certificado.

Seleccione y aplique el programa adecuado para la electroforesis según las instrucciones del fabricante. Tras la electroforesis, añada 500 microlitros de MEM al vial. Transfiera las células a 11,5 mililitros de medio para neuronas primarias y resuspenda suavemente.

Luego, agregue 500 microlitros en cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga astrocitos de ratón. Incube la placa a 37 grados Celsius y 5 %CO2. Después de generar células madre pluripotentes inducidas o CMI, induzca y mantenga las células como una cultura de células progenitoras neurales humanas o CPN según el protocolo descrito en el texto.

En este ejemplo, las CNP se marcan utilizando el vector lentiviral synapse en un tomate TD al día siguiente de añadir neuronas primarias a un cultivo de astrocitos. Utilice un XPBS para lavar una vez las CNP humanas, luego añada la solución de desprendimiento celular e incube durante cinco minutos a 30 grados Celsius. Asegúrese de que todas las células se hayan desprendido.

Luego transfiera las células a un tubo de 15 mililitros que contenga el doble de la cantidad de D-M-E-M-F 12 y centrifugue a 200 ×g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y utilice medio de diferenciación neuronal para resuspender suavemente el sedimento en células individuales. Use un hemocitómetro para contar las células.

A continuación, aspire cuidadosamente el medio de la placa de cultivo de neuronas corticales y astrocitos. Las NPCs humanas a 5.000 células por centímetro cuadrado por pocillo en medio de diferenciación neuronal. Incube a 37 grados Celsius y 5 %CO2, y sustituya el medio cada dos o tres días durante al menos 28 días.

Para confirmar si los IPC humanos se comportan como neuronas maduras, utilice un microscopio confocal equipado con un objetivo de inmersión en agua de 60 x para localizar células diferenciadas a partir de IPC humanos. Visualizando TD tomate. Prepare una pipeta de registro con una resistencia de cuatro a seis ohmios y perfunda.

Las células a temperatura ambiente en una solución externa burbujeada constantemente con 95%oxígeno, 5%dióxido de carbono. Utilice una solución interna para llenar la micropipeta de registro y realice un parche en una célula positiva para TD tomate en modo de célula completa, y registre la generación de potenciales de acción en respuesta a la inyección de corriente en el clamp de corriente. Para confirmar que el potencial de acción de las células corticales que expresan CHR dos es evocado de manera confiable mediante estimulación luminosa.

Primero, localice células corticales que expresen CR dos mediante la visualización de GFP a través de la iluminación con una lámpara de arco de mercurio, utilizando un filtro de excitación con una longitud de onda de 480 sobre 40 nanómetros. Verifique que un potencial de acción sea evocado de manera confiable mediante la grabación en modo de clamp de corriente en el modo de célula completa. Para realizar la estimulación génica, realice un parche en una célula positiva para TD tomate en modo de célula completa y establezca el clamp de voltaje en menos 70 milivoltios con la lámpara de mercurio de campo completo y un filtro de excitación de 480 sobre 40.

Estimule todo el campo durante 30 segundos. Registre las corrientes postsinápticas o PSC de una célula parcheada inducidas por la estimulación fotónica de neuronas corticales presinápticas que expresan CHR2. Establezca el umbral para la amplitud y el área de las corrientes en cinco picoamperios aquí y PICO respectivamente, e inspeccione manualmente estos eventos para descartar cualquier traza que no corresponda a PSC.

Como se demuestra en este video, se requieren varios pasos para generar el cultivo conjunto de neuronas derivadas de neuronas corticales primarias de IPC y astrocitos. Esta imagen muestra que al segundo día de diferenciación de NPC de ratón en astrocitos, pueden observarse fácilmente astrocitos positivos para la proteína ácida fibrilar glial o GFAP. Se permitió que los NPC de ratón se diferenciaran durante al menos una semana antes de sembrar las neuronas corticales, expresando CR dos sobre la monocapa de astrocitos, y ambos se identifican en este cultivo conjunto mediante tinción inmunofluorescente de GFAP y CHR dos.

Después de tres a cuatro semanas de diferenciación de NPC humanas, se detectaron neuronas positivas para tomate TD en los cultivos, como se muestra aquí. Cuando se estimulan con luz, se generan potenciales de acción en neuronas corticales que expresan CHR dos IPSC. Las neuronas derivadas también son excitables, mostrando un aumento en la actividad eléctrica.

Disparos potenciales a medida que se incrementaba la amplitud de los pulsos de corriente despolarizantes. En ausencia de luz, las neuronas derivadas de IPSC recibieron entradas sinápticas espontáneas. Estas corrientes postsinápticas entrantes fueron predominantemente mediadas por receptores AMPA.

La estimulación luminosa de las neuronas corticales se mantuvo durante todo el 32.º destello luminoso prolongado, mientras que la frecuencia de las PSC aumentó. Cuando las neuronas corticales que expresaban CHR dos fueron estimuladas con luz, su amplitud no se vio afectada. Tras este procedimiento, podemos utilizar otros sistemas de cultivo conjunto con diferentes tipos celulares específicos de pacientes para responder preguntas adicionales, como el efecto de compuestos farmacéuticos candidatos sobre enfermedades específicas de interés.