Name: Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprende a evaluar la formación de conexiones sinápticas entre neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales primarias mediante estimulación optogenética con channelrhodopsin-2. Este método acelera la maduración neuronal y permite registrar la actividad sináptica funcional.

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Damos las gracias a K. Deisseroth y S. Je para las construcciones lentiviral ChR2 y Synapsin1-tdTomato respectivamente, C. Chai para el intercambio de conocimientos y el protocolo en la generación de IPSC, WY Leong para el apoyo técnico, los miembros del laboratorio Goh para compartir reactivos y conocimientos. Este trabajo fue apoyado por Abbott Nutrición y el Centro Académico de Excelencia (ACE) premio de investigación de GlaxoSmithKline (GSK) para ELG, por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur bajo su Programa de Investigación Competitiva (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) a ELG y GJA, y por el (WCI) Programa del Instituto de clase mundial de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología de Corea (MEST) (NRF número de concesión: WCI 2009-003) a GJA

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</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

La optogenética proporciona precisión temporal y espacial para la activación de las poblaciones definidas de neuronas 13. En nuestros experimentos, todo el campo de el objetivo del microscopio se iluminó durante 30 segundos a sólo neuronas corticales foto-estimular expresan ChR2. Esto nos permitió determinar si las conexiones sinápticas se formaron entre diferentes poblaciones de neuronas dentro del co-cultivo. Nuestros resultados revelaron que la fotoestimulación aumenta la frecuencia PSC en neuronas derivadas de IPSC, lo que demuestra que estas neuronas reciben entrada sináptica de las neuronas corticales presináptica expresan ChR2. Esto, a su vez, estableció que las neuronas derivadas de IPSC incorporado con éxito en circuitos con las neuronas corticales. Hay varios pasos críticos para la generación de este sistema de co-cultivo. Es importante asegurarse de que los cultivos de astrocitos derivados de NPC ratón son saludables, con la muerte celular mínima, antes de proceder con el chapadode otros tipos de células. Las neuronas corticales y NPCs humanos atribuyen bien en astrocitos sanos y registros electrofisiológicos dependen en gran medida de las condiciones de cultivo. Los otros pasos clave en este protocolo son la electroporación y chapado de neuronas corticales en cultivos de astrocitos. Como un gran número de células mueren después de la electroporación, es importante asegurarse de que al menos 6 millones de neuronas corticales se electroporación para placas en cultivos de astrocitos en placas de 24 pocillos. Hemos observado que cuando se sometieron a electroporación menos de 6 millones de células, el número de neuronas que sobreviven no forman una red neuronal densa, que afectó registros electrofisiológicos. El número de neuronas corticales electroporación también debe ser coherente para cada experimento de co-cultivo para permitir la comparación entre los diferentes estudios. Para todas las etapas que implican la digestión enzimática, es esencial no dejar las células en solución digestivo durante demasiado tiempo ya que puede conducir a la muerte celular. Esteenfoque puede ser utilizado para detectar la capacidad de las neuronas derivadas de fibroblastos de pacientes específicos para formar contactos sinápticos con otras neuronas. Las neuronas derivadas de fibroblastos de pacientes que padecen el trastorno del desarrollo neurológico Síndrome de Rett (RTT) exhiben defectos de la transmisión sináptica: RTT neuronas muestran una disminución significativa en la frecuencia de PSC y la amplitud en comparación con las neuronas sanas, presumiblemente debido a la menor conectividad sináptica 14. Nuestro sistema de co-cultivo permite el examen de los efectos del fármaco sobre las neuronas que muestran defectos de desarrollo. Esto puede llevarse a cabo mediante la adición de compuestos de interés durante la siembra de NPC humanos enfermos, así como durante la exposición continua a los compuestos a lo largo del tiempo de la diferenciación neuronal. Si bien este sistema de co-cultivo también se puede utilizar como un modelo para las pruebas de drogas, una limitación de este enfoque es que el proceso de investigación de los efectos de cada compuesto candidato puede ser largo y tedioso comono es un método de cribado de alto rendimiento. Tras el tratamiento con los compuestos candidatos, neuronas derivadas de IPSC tienen que ser parcheado individualmente para determinar los efectos de cada compuesto sobre PSC. Por otra parte, en estos momentos no hay muchos disponibles fibroblastos y células iPS de pacientes. Por lo tanto, será de interés en el futuro próximo para tener más células del paciente y también para adaptar este protocolo para la selección de alto rendimiento. Por ejemplo, por marcación de neuronas derivadas de IPSC con un indicador de actividad, tales como sensores genéticamente codificados de iones o el potencial de membrana, sería posible aumentar la tasa de rendimiento sustancialmente por el procedimiento electrofisiológico tiempo-escalonamiento lado. Como todo el proceso de generación de este sistema de co-cultivo, desde la reprogramación de fibroblastos para la realización de registros electrofisiológicos, requiere más de 90 días, se recomienda que, o bien las células iPS o NPCs humanos ampliarse, después de la reprogramación y pasos de inducción neural, respectivamente,y criopreservados para reducir el tiempo necesario para futuros experimentos. En nuestros experimentos, expresamos ChR2 en neuronas corticales bajo el promotor synapsin1. Debido a que este promotor es pan-neuronal, que presumiblemente estaban photostimulating ambas neuronas corticales inhibidoras y excitadoras. Si el objetivo de los experimentos futuros es interrogar específicamente circuitos inhibitorios o excitatorios o bien, se podrían utilizar los promotores más específicos. Alternativamente, las neuronas corticales podrían obtenerse a partir de transgénicos (o virus inyectado ratones) donde la expresión ChR2 se dirige específicamente a las subpoblaciones genéticamente definidas de neuronas. Por ejemplo, los tejidos corticales de cosecha de un ratón que tiene la recombinasa Cre expresan en interneuronas que contiene parvalbúmina (interneuronas PV) que se cruza con un ratón con floxed ChR2 dará lugar a una situación en la que las únicas neuronas corticales que expresan ChR2 serán interneuronas PV 15. El uso de tales ChR2 interneuronas que expresan en nuestros co-culture sistema permitirá a la determinación de si una neurona parcheado derivados de IPSC es capaz de incorporar en un circuito con interneuronas PV. Basado en un estudio previo 9, las neuronas corticales son maduros con dendritas superposición después de 14 días in vitro. Por lo tanto, si la fotoestimulación no provoca una respuesta de un patched neurona derivada de IPSC, se debe indicar que la neurona no tiene la capacidad de hacer conexiones sinápticas con las neuronas corticales. Una neurona derivada de IPSC es capaz de recibir la entrada sináptica, tanto de otras neuronas derivadas de IPSC o neuronas corticales. Si se utilizaron grabaciones de patch clamp tradicional, no sería posible distinguir donde la entrada sináptica está viniendo. La ventaja de nuestro sistema es que las respuestas postsinápticas de entrada presináptica cortical pueden ser evocados y se identificaron selectivamente. Los procedimientos descritos aquí proporcionan un método sencillo para evaluar la capacidad de las neuronas derivadas de IPSC para integraren una red neuronal definido.

En los últimos años, nuestra comprensión de la neurona y la función del circuito neuronal han sido revolucionada por varias herramientas optogenética que controlan la excitabilidad neuronal. Una de estas herramientas es el canal catiónico activado por la luz, canalrodopsina-2 (ChR2): las neuronas que expresan ChR2 potenciales de acción del fuego en respuesta a la estimulación de la luz 1.3. Debido a que las neuronas no son normalmente sensibles a la luz, esta notable capacidad abre nuevas vías para el control temporal y espacial precisa de la actividad de las poblaciones genéticamente definidas de neuronas 4 y ha estudios de la función cerebral acelerado enormemente. ChR2 se ha aplicado a la investigación de células madre para diferentes propósitos, desde el seguimiento del desarrollo neuronal 5 a la actividad de las redes neuronales 6 regulación. Aquí hemos utilizado ChR2 para aumentar la utilidad de un sistema de co-cultivo neuronal. Sistemas de co-cultivo permiten la evaluación de las interacciones entre los diferentes tipos de células.Co-cultivos de neuronas y células gliales, los principales tipos de células del sistema nervioso, se utilizan comúnmente para investigar la señalización entre estos diferentes tipos de células, así como para evaluar la importancia de esta señalización para las respuestas fisiológicas, la propagación de los daños y para examinar la mecanismos moleculares que están potencialmente implicadas en esta señalización 7. Un estudio anterior reveló que iPS humanas se diferencian muy rápidamente en las neuronas de la presencia de la cultura que contiene neuronas de rata corticales primarias, los astrocitos, los oligodendrocitos y microglia 8. En este protocolo, se demuestra un método que utiliza ChR2 en un sistema de co-cultivo para interrogar a las conexiones sinápticas entre las neuronas corticales de rata y las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs). Describimos pasos para diseccionar y tejidos cerebrales cosecha 9, así como a mantener y diferenciar ratón células progenitoras neurales (CPN) en astrocitos y NPCs humanos INTneuronas o para crear el sistema de co-cultivo. Para establecer este sistema de co-cultivo, se utilizó el método de reprogramación-integración libre descrito por Okita et al. 10 para generar células iPS humanas. Estos iPSCs fueron entonces diferenciarse eficientemente en NPC en condiciones definidas químicamente utilizando inhibidores de molécula pequeña tal como se describe por Li et al. 11 En los co-cultivos, las diferentes poblaciones de neuronas se pueden identificar a través de la detección de la expresión de ChR2 en neuronas corticales y etiquetado de neuronas derivadas de IPSC a través de la proteína fluorescente, en tándem de dímero de tomate (tdTomato). La combinación de registros electrofisiológicos de neuronas derivadas de IPSC con fotoestimulación optogenético de las neuronas corticales permite la evaluación de la capacidad de estos dos tipos de neuronas para formar circuitos entre sí. En concreto, la fotoestimulación de ChR2 que expresan las neuronas corticales evocan respuestas sinápticas en neuronas derivadas de IPSC que se han formado los circuitos sinápticoscon la red de neuronas corticales fotoestimulada. Se demuestra que el aumento de las corrientes postsinápticas están efectivamente detectados en neuronas derivadas de IPSC en tales condiciones. Este protocolo permite la evaluación de los circuitos sinápticos bajo una variedad de condiciones experimentales, incluyendo recapitulación de diferentes modelos de enfermedades neurológicas mediante el uso de células iPS derivadas de fibroblastos de pacientes con la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>Kit de proliferación Neurocult (ratón)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>Contiene medio basal NSC y suplemento de proliferación NSC</td></tr><tr><td>Epi5 Kit de reprogramación episomal iPSC</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>MEM sin glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplemento</td><td>Invitrogen 35050061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Human LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto E Merck</td><td>Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>Grado de investigación FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>Para medio de diferenciación de astrocitos</td></tr><tr><td>Definido FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>Para medio neurona primario</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Para medio neuronal primario</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>para cerebros de recolección</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m filtro de células</td><td>BD Biosciences&nbsp; &nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 y micro; unidad de filtro m</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>Para estudios electrofisiológicos</td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Para estudios electrofisiológicos</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>World precision instruments, Inc 1604323</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Frascos Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm cubreobjetos</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA Kit de nucleoefectos de neuronas de rata& nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>Para la electroporación de neuronas corticales primarias Sistema de</td></tr><tr><td>transfección de neón&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Para la electroporación de fibroblastos humanos</td></tr><tr><td>Mini Análisis&nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>Para la medición de PSCs</td></tr><tr><td>Fibroblastos Humanos Dérmicos Normales</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de arco corto de mercurio</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

un enfoque optogenética para evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Aquí describimos un protocolo para generar un co-cultivo formado por 2 poblaciones neuronales diferentes. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se reprograman a partir de fibroblastos humanos utilizando vectores episomales. Las colonias de iPSCs pueden observarse 30 días después del inicio de la reprogramación de fibroblastos. Las colonias pluripotentes se seleccionan manualmente y se cultivan en un medio de inducción neural para permitir la diferenciación en células progenitoras neurales (NPC). Las iPSC se convierten rápidamente en células neuroepiteliales en 1 semana y conservan la capacidad de autorrenovarse cuando se mantienen a una alta densidad de cultivo. Las NPC primarias de ratón se diferencian en astrocitos por exposición a un medio que contiene suero durante 7 días y forman una monocapa sobre la que se añaden neuronas corticales de rata embrionarias de día 18 (E18) (transfectadas con canalrodopsina-2 (ChR2)). Las NPC humanas marcadas con la proteína fluorescente, el dímero en tándem Tomato (tdTomato), se siembran en el cultivo de astrocitos/neuronas corticales al día siguiente y se les permite diferenciarse durante 28 a 35 días. Demostramos que este sistema forma conexiones sinápticas entre las neuronas derivadas de iPSC y las neuronas corticales, evidentes a partir de un aumento en la frecuencia de las corrientes sinápticas tras la fotoestimulación de las neuronas corticales. Este sistema de cocultivo proporciona una plataforma novedosa para evaluar la capacidad de las neuronas derivadas de iPSC para crear conexiones sinápticas con otras poblaciones neuronales.

Aquí, un protocolo que describe los varios pasos implicados en la generación de un co-cultivo que consiste en astrocitos, neuronas corticales y neuronas humanas se ilustra. CMPI humanas se obtuvieron mediante la reprogramación de fibroblastos usando vectores episomales de 10 y especificados en un linaje neuronal con un cóctel de inhibidores de molécula pequeña, por lo que NPC 11 que se mantuvieron a alta densidad (Figura 1A). Se requieren varios pasos para generar el co-cultivo: diferenciación de los NPCs de ratón en los astrocitos, chapado de neuronas corticales de rata que expresan ChR2, y la siembra de NPCs humanos etiquetados con tdTomato (Figura 1B). En el día 2 de diferenciación, glial fibrilar ácida de la proteína (GFAP) + astrocitos pueden ser fácilmente observados en nuestros cultivos (Figura 1C). Ratón NPC se les permitió diferenciarse por lo menos una semana antes de chapado neuronas corticales que expresan ChR2 sobre la monocapa de astrocitos (Figura 1D). Después de 34 semanas de diferenciación NPC humana, se detectaron las neuronas tdTomato + en las culturas (Figura 1E). Este sistema de co-cultivo permite la detección coherente de las corrientes postsinápticas de neuronas derivadas de IPSC individuales en respuesta a la estimulación de luz (Figura 2). Cuando son estimulados por la luz, los potenciales de acción se generaron en las neuronas corticales que expresan ChR2 (Figura 2B). IPSC derivado de las neuronas también son excitables (Figura 2C), que muestra el aumento de potencial de acción disparando como la amplitud de la despolarización de pulsos de corriente se incrementó (Figura 2D). Por lo tanto, estas células exhiben propiedades neuronales maduros. En la ausencia de luz, neuronas derivadas de IPSC recibieron entradas sinápticas espontáneas (Figura 2E). Estas corrientes hacia el interior postsinápticos se mediada principalmente por los receptores AMPA, porque las corrientes a través de los receptores GABA serían hacia fuera y los receptores NMDA no llevan una corrientet el potencial de mantenimiento de -70 mV. Al menos algunas de estas entradas eran de neuronas corticales presinápticos que expresan ChR2, debido a la estimulación de luz se incrementó en gran medida la frecuencia de las corrientes postsinápticas (Figura 2E). El curso temporal de este aumento de la entrada sináptica se muestra en la Figura 2F: fotoestimulación de las neuronas corticales se mantuvo a lo largo del 30 seg destello de luz larga. Si bien la frecuencia de PSC fue elevado cuando ChR2 que expresan las neuronas corticales fueron fotoestimuladas (Figura 2G), su amplitud no fue afectado (Figura 2H). En resumen, estos resultados indican que las neuronas derivadas de IPSC exhiben propiedades neuronales maduros y podrían formar conexiones sinápticas con las neuronas corticales presinápticas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Figura 1: Diagramas esquemáticos para la generación de co-cultivosistema. (A) Línea de tiempo para reprogramar fibroblastos humanos en células iPS y la inducción neural a los NPCs. (B) Plazo para la diferenciación terminal de NPCs humanos en neuronas maduras en cultivos de neuronas y astrocitos corticales. (C) Ratón NPCs diferenciar rápidamente en GFAP + astrocitos después de 2 días in vitro. (D) Después de una semana, las neuronas corticales que expresan ChR2 se sembraron en GFAP + astrocitos. (E) A las 4 a 5 semanas después de la diferenciación de los NPCs humanos, registros electrofisiológicos se realizaron en tdTomato + neuronas. Las barras de escala representan 100 micras. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Figura 2: Análisis optogenética de conectividad sináptica funcional. derivados de IPSC (A) células etiquetadas con tdTomato (rojo) fueron co-cultivadas con neuronas corticales que expresa la luz-activadocanal, ChR2 (verde). Las grabaciones de neuronas derivadas de IPSC revelaron actuales (PSC) respuestas postsinápticas, que podrían provenir de cualquiera de las neuronas corticales u otras neuronas derivadas de IPSC. (B) Iluminación (barra azul) evoca una serie de potenciales de acción en las neuronas corticales que expresan ChR2. ( derivados de las células IPSC C) son evocados por inyección de corriente. (D) La cocción frente a la curva actual de las células derivadas de IPSC. (E) Fotoestimulación de las neuronas corticales ChR2 expresan (barra azul) aumentaron la frecuencia de las ventanillas únicas en las neuronas derivadas de IPSC . Por supuesto (F) Tiempo del aumento en la frecuencia PSC producido por fotoestimulación. Barra azul indica el tiempo de fotoestimulación. (G, H) mientras que la frecuencia PSC se incrementó por la fotoestimulación (G), la amplitud PSC no se vio afectada (H). * Indica p &lt;0,05 en comparación con el control con la prueba t de Student.

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

El objetivo general del siguiente experimento es establecer un sistema de co-cultivo para evaluar la capacidad de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas de formar conexiones funcionales mediante un enfoque genético basado en la fotoestimulación de neuronas en cultivo a través de channel RUSIN dos o CR dos. Esto se logra primero aislado células progenitoras neurales primarias de ratón, o NPCs, y permitiendo que se diferencien en astrocitos. A continuación, neuronas corticales primarias de rata se transfectan con CH R dos y se siembran sobre la capa de astrocitos, que sirve como la población neuronal existente.Luego, las NPC humanas derivadas de cultivos de células madre pluripotentes inducidas o cultivos de IPSC se transducen con el virus de tomate sinapsina uno 2D, y después se siembran sobre el cultivo de neuronas astrocíticas e inducidas a diferenciarse, formando posteriormente conexiones sinápticas. Los resultados muestran que las neuronas derivadas de IPSC forman conexiones sinápticas con neuronas corticales de rata, según grabaciones electrofisiológicas de corrientes postsinápticas en las neuronas derivadas de IPSC tras la estimulación foto génica de las neuronas corticales que expresan CHR dos. La ventaja principal de este método frente a los existentes, como los que consisten en cocultivos de solo astrocitos con neuronas humanas derivadas de IPSC, es que el tiempo de maduración de estas neuronas humanas es más corto.Esto se debe a que la presencia de neuronas primarias puede acelerar la maduración de estas neuronas humanas. Quien demuestre el procedimiento será Uni Chin, estudiante de posgrado de mi laboratorio, y Y usando del laboratorio de George Augustine. Después de extraer los cerebros embrionarios de rata y aislar el tejido cortical según el protocolo descrito, transfiera los tejidos corticales a una placa que contenga la solución de digestión de tejido cortical precalentada. Pique los tejidos corticales lo más finamente posible antes de incubarlos a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Tras la incubación, transfiera los tejidos corticales a un tubo cónico de 50 mililitros, disocie los tejidos utilizando una pipeta serológica hasta obtener una solución homogénea sin fragmentos de tejido.Pase la solución de tejido a través de un filtro celular de 70 micrones para eliminar cualquier grumo de tejido restante. Aliquote tres mililitros de solución en tubos cónicos de 15 mililitros.Añada 800 microlitros de BSA al 7,5% en un XPBS en la parte inferior de cada tubo, formando una capa debajo de la capa de tejido. Centrifugue a 200 Gs durante cinco minutos. Luego, elimine el sobrenadante aspirando desde la interfase de las dos capas. Evite perturbar el pellet de selp en el fondo del tubo.Después de usar un mililitro de medio neuronal primario para resuspender cada paleta celular, combínelos todos en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, utilice un hemocitómetro para determinar la densidad celular. Centrifugue 6 millones de neuronas corticales de rata a 200 G durante cinco minutos y retire el sobrenadante.Se requieren al menos 6 millones de neuronas corticales para la electroforesis. Para asegurar la formación de una red neuronal por parte de las neuronas sobrevivientes, agregue 100 microlitros de solución de electroforesis al sedimento celular y resuspenda suavemente. Luego combine 100 microlitros de la suspensión celular con seis microgramos del plásmido CR dos y transfiera la mezcla a un vial certificado.Seleccione y aplique el programa adecuado para la electroforesis según las instrucciones del fabricante. Tras la electroforesis, añada 500 microlitros de MEM al vial. Transfiera las células a 11,5 mililitros de medio para neuronas primarias y resuspenda suavemente.Luego, agregue 500 microlitros en cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga astrocitos de ratón. Incube la placa a 37 grados Celsius y 5 %CO2. Después de generar células madre pluripotentes inducidas o CMI, induzca y mantenga las células como una cultura de células progenitoras neurales humanas o CPN según el protocolo descrito en el texto.En este ejemplo, las CNP se marcan utilizando el vector lentiviral synapse en un tomate TD al día siguiente de añadir neuronas primarias a un cultivo de astrocitos. Utilice un XPBS para lavar una vez las CNP humanas, luego añada la solución de desprendimiento celular e incube durante cinco minutos a 30 grados Celsius. Asegúrese de que todas las células se hayan desprendido.Luego transfiera las células a un tubo de 15 mililitros que contenga el doble de la cantidad de D-M-E-M-F 12 y centrifugue a 200 ×g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y utilice medio de diferenciación neuronal para resuspender suavemente el sedimento en células individuales. Use un hemocitómetro para contar las células.A continuación, aspire cuidadosamente el medio de la placa de cultivo de neuronas corticales y astrocitos. Las NPCs humanas a 5.000 células por centímetro cuadrado por pocillo en medio de diferenciación neuronal. Incube a 37 grados Celsius y 5 %CO2, y sustituya el medio cada dos o tres días durante al menos 28 días.Para confirmar si los IPC humanos se comportan como neuronas maduras, utilice un microscopio confocal equipado con un objetivo de inmersión en agua de 60 x para localizar células diferenciadas a partir de IPC humanos. Visualizando TD tomate. Prepare una pipeta de registro con una resistencia de cuatro a seis ohmios y perfunda.Las células a temperatura ambiente en una solución externa burbujeada constantemente con 95%oxígeno, 5%dióxido de carbono. Utilice una solución interna para llenar la micropipeta de registro y realice un parche en una célula positiva para TD tomate en modo de célula completa, y registre la generación de potenciales de acción en respuesta a la inyección de corriente en el clamp de corriente. Para confirmar que el potencial de acción de las células corticales que expresan CHR dos es evocado de manera confiable mediante estimulación luminosa.Primero, localice células corticales que expresen CR dos mediante la visualización de GFP a través de la iluminación con una lámpara de arco de mercurio, utilizando un filtro de excitación con una longitud de onda de 480 sobre 40 nanómetros. Verifique que un potencial de acción sea evocado de manera confiable mediante la grabación en modo de clamp de corriente en el modo de célula completa. Para realizar la estimulación génica, realice un parche en una célula positiva para TD tomate en modo de célula completa y establezca el clamp de voltaje en menos 70 milivoltios con la lámpara de mercurio de campo completo y un filtro de excitación de 480 sobre 40.Estimule todo el campo durante 30 segundos. Registre las corrientes postsinápticas o PSC de una célula parcheada inducidas por la estimulación fotónica de neuronas corticales presinápticas que expresan CHR2. Establezca el umbral para la amplitud y el área de las corrientes en cinco picoamperios aquí y PICO respectivamente, e inspeccione manualmente estos eventos para descartar cualquier traza que no corresponda a PSC.Como se demuestra en este video, se requieren varios pasos para generar el cultivo conjunto de neuronas derivadas de neuronas corticales primarias de IPC y astrocitos. Esta imagen muestra que al segundo día de diferenciación de NPC de ratón en astrocitos, pueden observarse fácilmente astrocitos positivos para la proteína ácida fibrilar glial o GFAP. Se permitió que los NPC de ratón se diferenciaran durante al menos una semana antes de sembrar las neuronas corticales, expresando CR dos sobre la monocapa de astrocitos, y ambos se identifican en este cultivo conjunto mediante tinción inmunofluorescente de GFAP y CHR dos.Después de tres a cuatro semanas de diferenciación de NPC humanas, se detectaron neuronas positivas para tomate TD en los cultivos, como se muestra aquí. Cuando se estimulan con luz, se generan potenciales de acción en neuronas corticales que expresan CHR dos IPSC. Las neuronas derivadas también son excitables, mostrando un aumento en la actividad eléctrica.Disparos potenciales a medida que se incrementaba la amplitud de los pulsos de corriente despolarizantes. En ausencia de luz, las neuronas derivadas de IPSC recibieron entradas sinápticas espontáneas. Estas corrientes postsinápticas entrantes fueron predominantemente mediadas por receptores AMPA.La estimulación luminosa de las neuronas corticales se mantuvo durante todo el 32.º destello luminoso prolongado, mientras que la frecuencia de las PSC aumentó. Cuando las neuronas corticales que expresaban CHR dos fueron estimuladas con luz, su amplitud no se vio afectada. Tras este procedimiento, podemos utilizar otros sistemas de cultivo conjunto con diferentes tipos celulares específicos de pacientes para responder preguntas adicionales, como el efecto de compuestos farmacéuticos candidatos sobre enfermedades específicas de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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