Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

El objetivo general de este procedimiento es producir grandes cantidades de un virus de la influenza de alto título, en un sistema rentable. Esto se logra obteniendo primero huevos de gallina recién fertilizados y libres de patógenos en suero. En el segundo paso, los huevos se infectan con el virus de la influenza a través de la raíz de Alan Toic.

Durante 48 horas, el fluido Alan Toic, que contiene el virus, se recolecta y el virus se congela en nitrógeno líquido. En última instancia, se pueden realizar ensayos de placa y hemaglutinina para determinar la influencia del título del virus del Alan Toic recolectado. La demostración visual fluida de este método es fundamental, ya que los pasos de recolección son muy sensibles y requieren un manejo cuidadoso de los huevos y un buen conocimiento de su anatomía.

Antes de comenzar el procedimiento, obtenga óvulos de davian recién fertilizados y libres de patógenos en suero de un proveedor adecuado. Inmediatamente después de su llegada, coloque los huevos en una incubadora de huevos humidificada con un volteador automático de huevos para rotar los huevos regularmente a 37 grados centígrados y 55 a 60% de humedad durante 10 a 11 días. Después de siete a ocho días de incubación, usar guantes desinfectados con etanol al 70%.

Limpie un candelabro de huevos con el etanol y transfiera los huevos de la incubadora a los cartones de huevos vacíos. Luego apague las luces y sostenga el extremo grande de los huevos, uno a la vez, contra el candelabro. Si un óvulo es fértil, los vasos sanguíneos delgados que conducen a un embrión en forma de frijol deben ser claramente visibles.

Si el huevo no está fertilizado, se observará una pequeña mancha de sangre con una yema de huevo visible. A continuación, desecha los óvulos no fertilizados y devuelve el viable a la incubadora. Si no se puede confirmar el estado de un huevo, márquelo para su observación posterior el día 10 u 11 después de la fertilización e inmediatamente antes de su uso, diluya una reserva de virus de la influenza A a una vez 10 a la tercera a 10 a 10 a la cuarta UFP por mililitro en PBS estéril suplementado con hippies y colóquelo en hielo.

A continuación, vuelve a velar cada huevo y elimina los embriones muertos e inmóviles. A continuación, retire tres huevos de la incubadora y colóquelos en un soporte separado. Con los sacos de aire levantados, marque el espacio aéreo de los huevos con un marcador permanente.

A continuación, lave la zona por encima del espacio aéreo con etanol al 70% y transfiera el espacio aéreo de los huevos a un cartón de huevos dentro de una campana de bioseguridad BSL dos. Ahora use una aguja estéril de calibre 18 para perforar un pequeño agujero en la cáscara sobre el saco de aire de cada huevo. Tenga cuidado de no insertar la aguja demasiado profundamente para evitar apuñalar el embrión o la yema.

Luego, extraiga el virus de la influenza diluido en una jeringa estéril de un mililitro. Coloque una aguja de calibre 22 y avance cuidadosamente la aguja en un ángulo de 45 grados en la cavidad Alan Toic del primer huevo. Inyecte 0,2 mililitros del virus diluido en el huevo y luego, después de inyectar los otros dos huevos, deseche la jeringa y selle cada agujero con una gota de pegamento de una pistola de pegamento.

Cuidado de que el pegamento no se filtre dentro del huevo y luego vuelva a colocar los huevos en la incubadora. Después de que todos los huevos hayan sido inoculados, incube los huevos infectados a 37 grados centígrados y 60% de humedad sin voltearlos para obtener el tiempo óptimo de incubación. Dependiendo del tipo de virus de la gripe.

Al final del período de incubación, enfríe los huevos durante un mínimo de cuatro horas a cuatro grados centígrados para matar el embrión y constreñir los vasos sanguíneos. Cuando los huevos se hayan enfriado lo suficiente. Transfiéralos a una campana de bioseguridad y a un soporte firme y limpie las superficies de los huevos con etanol al 70%.

Luego use tijeras estériles para abrir la cáscara del huevo por encima del saco de aire del primer huevo. Retire la carcasa alrededor de la bolsa de aire. Teniendo cuidado de no dañar la membrana del corio Alan Toico.

A continuación, utilice pinzas romas estériles para abrir la membrana del corio Alan Toic y separe suavemente el embrión y el saco vitelino con una pequeña espátula o cuchara, teniendo cuidado de no romper la yema. A continuación, con una pipeta einor de un mililitro, recoja cuidadosamente el líquido Alan Toic, inclinando el huevo hacia un lado para recoger la mayor cantidad de líquido posible según sea necesario. Cada huevo debe producir entre cinco y 10 mililitros de líquido ligeramente amarillento a medida que se cosecha cada huevo.

Agrupa el líquido Alan Toic en tubos cónicos de plástico de 50 mililitros sobre hielo. Cuando se haya recogido todo el líquido, centrifuga el virus y transfiere el líquido transparente a un nuevo tubo de 50 mililitros con hielo. Por último, deseche los huevos en un contenedor de residuos BSL dos y Eloqua inmediatamente a LAN toico clarificado.

A continuación, congele el virus en nitrógeno líquido y coloque los tallos congelados en un congelador a 80 grados centígrados negativos. Para el almacenamiento a largo plazo, la infección por el virus de la influenza causa un efecto citopático que da como resultado zonas circulares de células entrelazadas o placas que se forman en una monocapa de células. En este experimento, las placas se visualizaron tiñendo las células con violeta cristalino y se contaron 65 placas en el pocillo con una dilución de 10 a menos 12 del virus porque se cultivaron 500 microlitros de caldo viral diluido en las células.

En este experimento, el título final fue de 1,3 por 10 a la 14ª UFP por mililitro. El ensayo de la nación de hemaglutinina es un método para determinar la titulación del virus de la influenza en función de la capacidad del virus para adherirse a la superficie de los glóbulos rojos. Como se ha observado, la suspensión viral aglutina los glóbulos rojos evitando que los glóbulos rojos se asienten fuera de la suspensión.

Se observó un resultado claramente negativo con una dilución de dos a menos 10 del virus en 50 microlitros. Por lo tanto, el título final es de 2,1 por 10 elevado al cuarto HAU por mililitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo propagar el virus de la influenza inoculando huevos de gallina y recolectando el líquido del Atlántico que contiene el virus.