Name: Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a registrar respuestas a la luz en neuronas retinianas adaptadas a la oscuridad usando técnicas de patch clamp en preparaciones de retina de ratón. Este método permite estudios precisos de electrofisiología visual.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund y RPB.

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne. 1. Preparación de la solución Experimental <ol><li> Prepare la solución de disección 1 día a 1 semana antes del experimento real. Use una solución tampón HEPES para la disección de la retina debido a su gran capacidad de amortiguación a temperaturas más bajas 16. Mezclar todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, CaCl2 2,5, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glucosa. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Conservar la solución en el refrigerador hasta por 1 semana. </li><li> La solución de registro es medio de Ames, que es un líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) diseñado para preparaciones de la retina 17. Por el día del experimento, pesar polvo Ames &#39;(4,4 g por 500 ml de solución) en un tubo. Además, pesar NaHCO3 (0,95 g por 500 ml de solución) y mezclar con la Apolvo mes. </li><li> Prepare la solución de la pipeta intracelular para las grabaciones de patch clamp por el día del experimento. Mezclar todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 111 K-gluconato, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 de NaCl, 1,0 MgCl 2, 5 ATP-Mg y 1,0 GTP-Na. Ajustar el pH a 7,2 con KOH. Se filtra la solución de la pipeta con un filtro de jeringa convencional. Haga ~ 500 ml de alícuotas y almacenarlos en un congelador o un congelador. </li></ol> 2. Preparación para el Día del Experimento <ol><li> La noche antes del experimento, coloca un ratón en una jaula (C57BL / 6J o antecedentes similares, 4-8 semanas de edad, macho) en un espacio oscuro de O / N adaptación a la oscuridad. </li><li> Preparación para la disección: <ol><li> Rellene disección solución (100 - 200 ml) en un vaso de vidrio, colóquelo sobre hielo, y la burbuja de oxígeno durante al menos 10 min. </li><li> Iniciar la oxigenación de la caja oscura para el almacenamiento de preparación de la retina. </li><li> Preparar cubreobjetos de plástico con rieles de engrase para rerebanada preparativos intes- y colocar cada uno de ellos en un plato de plástico de 35 mm. </li><li> Adjunte una nueva hoja de afeitar para un helicóptero (máquina de cortar el tejido). </li><li> Cortar una membrana de filtro en dos mitades. Esto es para el corte en lonchas de la retina. </li><li> Alinear las herramientas de disección y pipetas de transferencia cerca del microscopio de disección. El área de trabajo debe estar bien organizado para que cada herramienta se puede acceder fácilmente en la oscuridad. </li></ol></li><li> Preparación para las grabaciones de patch clamp: <ol><li> Disuelva el polvo de Ames y NaHCO3 en agua destilada (4,4 g Ames y NaHCO 3 0,95 g / 500 ml ddH 2 O). Medio de la burbuja el Ames &#39;con oxígeno mixta (95% O 2 y 5% de CO 2) durante al menos 30 min mientras se calienta a un nivel de temperatura de grabación (~ 35 ° C). Ajustar el pH a 7,4 con NaHCO 3 mientras que todavía burbujeante. </li><li> Descongelar la solución de la pipeta interna durante la disección. Después de que se haya descongelado, añadir 0,01% sulforodamina B para la tinción intracelular. </li></ol></li></ol> 3. Disección de retina <ol><li> En un cuarto oscuro, la eutanasia con el ratón utilizando dióxido de carbono y el neumotórax bilateral. Al cabo de 2 - 3 minutos de usar el dióxido de carbono, el ratón perder el conocimiento. </li><li> Cuando el ratón ya no responde a una pizca de cola, enuclear rápidamente los ojos y colocarlos en una solución de disección fría en un plato de plástico. Realice el neumotórax bilateral para asegurar la muerte del animal. Almacenar rápidamente el ojo en el plato en la caja oscura. Utilice un visor de infrarrojos para llevar a cabo el procedimiento en la oscuridad. NOTA: Como alternativa, isoflurano, la decapitación o dislocación cervical se pueden utilizar para la eutanasia. El método de la eutanasia debe seguir las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH) y / o el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional. </li><li> En una habitación oscura, ajuste el microscopio de disección y la iluminación infrarroja. Bajo el microscopio, transferir un ojo de su plato en un plato de plástico de 10 cm wITH la solución de disección enfriado. Continuamente burbuja de oxígeno a través de la tubería colocada en la parte inferior del plato de plástico. Ajustar el volumen de flujo por lo que no es demasiado baja, pero asegurarse de que no es lo suficientemente alta como para perturbar la disección. </li><li> Córnea y el cristalino eliminación: <ol><li> Hacer una incisión en la parte superior de la córnea con un cuchillo micro-quirúrgica. Sosteniendo el nervio óptico en el otro extremo del globo ocular evita que el ojo se mueva. Extienda el corte con un par de tijeras quirúrgicas. Recorta la córnea con algunos esclerótica alrededor. </li><li> Coge la lente con una pinza fina y tire lentamente el objetivo. Si el vítreo es demasiado pegajosa para quitar la lente, cortar el vítreo con un par de tijeras. </li><li> Una vez que se hace el ojo-taza, vierta suavemente solución de disección fría y oxigenada en el ocular con una pequeña pipeta de transferencia. NOTA: El globo ocular se desinfla rápidamente después se hace una incisión en la córnea. Es importante para mantener la forma del ojo como deformar el ojo durante este proprocedimiento daña la retina y causar desprendimiento de retina. </li></ol></li><li> La identificación de las partes dorsal y ventral de la retina: NOTA: Debido a la desigual distribución de la verde y la luz ultravioleta (UV) conos 18, la identificación de un área específica de la retina que es importante para las grabaciones de respuesta de luz. <ol><li> Identificar la línea que va a través del ocular de la retina que pasa cerca de la cabeza del nervio óptico. Esta línea pasa sobre todo a través de la parte ventral del nervio óptico; el lado incluyendo el nervio óptico es el lado dorsal, mientras que el otro es ventral 19. Ver este hito claramente bajo espectadores infrarrojos. </li><li> Dependiendo del propósito del experimento, hacer un corte en el lado innecesario. Esto será útil después de aislar la retina de la copa para el ojo. </li></ol></li><li> Eliminación Vítreo: <ol><li> Opcionalmente, se incuba el ojo-taza con hialuronidasa (0,5 mg / ml) durante 15 min. </li><li> Retire el vítreo con pinzas extra-finas. El humor vítreo es principalmenteunido a la parte inferior y el borde exterior del ojo-cup. Retire con cuidado sin tocar o meter la retina. Como el vítreo podría estar estrechamente unida a la ojera, retire con cuidado para evitar el desprendimiento de retina del ojo taza. Continúe tirando hasta que no sienta la tensión. NOTA: Este paso es especialmente importante para la disección de la retina del ratón; Sin embargo, no es un problema para las retinas de otras especies, tales como la rata o salamandra. </li></ol></li><li> Aislar la retina del ojo taza. Coge la esclerótica y pelar suavemente de la retina utilizando la parte trasera de fórceps. NOTA: Todo el montaje preparativos de la retina se puede hacer de la retina aislada. Hacer tres y cincuenta y siete cortes en los bordes y aplanar la retina, o cortar la retina en varios pedazos. </li><li> Recortar la retina y deseche el medio innecesario de la retina (paso 3.5). En el mismo plato de plástico, cortar la retina restante en dos piezas. Por cada pieza de la retina, cortar los bordes para hacer unalosa de la retina, y recortar los bordes plegables. </li><li> Transferir una losa de la retina en una placa de vidrio usando una pipeta de transferencia de gran tamaño (~ 2 ml). Aspirar el exceso de solución con una pequeña pipeta, usar un trozo de papel de filtro para aplanar la losa, y luego colocar rápidamente una pieza de la membrana de filtro en la parte superior del tejido. <ol><li> Utilizando una pequeña pipeta de transferencia, colocar una gota de solución en la disección de la membrana de filtro. Espere ~ 15 seg hasta que la solución se extiende sobre la membrana. Durante este tiempo, el tejido de la retina se adhieren a la membrana de filtro. </li><li> Verter solución de disección más fría debajo y alrededor del filtro. El tejido de la retina con la membrana de filtro flotará. Coge la membrana de filtro con una pinza y colocarla en la cámara de corte. Vierta la disección de solución sobre el tejido, y almacenar la preparación en la caja oscura. NOTA: El procedimiento descrito aquí es fundamental. Es importante para llevar a cabo estos pasos con rapidez para garantizar que los palos tejido de la retina a los filtros de membrana y no se seque. </li></ol></li><li> El uso de un interruptor, cortar el tejido de la retina en rodajas. Alrededor de 200 micras de espesor es factible para los estudios de patch clamp. </li><li> Coloque un cubreobjetos de plástico con rieles de grasa en la cámara de corte. Transferir una rebanada de la retina en la parte superior de los carriles de grasa en un cubreobjetos de plástico. Girar la rebanada 90 ° de modo que la sección transversal es visible. Presione la membrana de filtro hacia abajo sobre el cubreobjetos, a continuación, cubrir los lados del papel de filtro con grasa. <ol><li> Después de la rebanada se inmoviliza sobre un cubreobjetos de plástico, agarrar el cubreobjetos y la transfiere a un plato de plástico de 35 mm. Vierta la solución de disección fría en la preparación de la retina y sumergir la preparación. Almacenar cada plato en la caja oscura, que debe ser oxigenada continuamente. NOTA: Todo el procedimiento que se debe hacer con cuidado para que la membrana de filtro no se deforma. De lo contrario, la rebanada de la retina se separa fácilmente de la membrana de filtro. </li></ol></li></ol><ol><li> Grabación de preparación: <ol><li> Prime los tubos de perfusión con medio de Ames. Permitir todas las burbujas que atraviesan al llenar el tubo. </li><li> Haga pipetas de registro patch clamp con un extractor. Para llenar una pipeta con la solución de la pipeta, baño en la parte trasera de una pipeta de 1 min hasta que se rellena la punta de la pipeta. A continuación, llenar ~ 1/3 de la pipeta usando una carga micro-pipeta. Guarde cada pipeta en una caja pipeta húmedo. </li><li> Encienda el equipo para patch clamp grabaciones; incluyendo la computadora, un amplificador, cámara CCD, y el microscopio. </li></ol></li><li> Apague la luz de la habitación. Coloque una rebanada preparación de la retina en la cámara de platina del microscopio utilizando un visor de infrarrojos. Después de que se inmoviliza, comenzar la perfusión continua. Ajuste la temperatura de perfusión a 33 a 37 ° C. </li><li> Ver la superficie rebanada con la cámara CCD. Centrarse en la ubicación de destino donde el objetivo cetipos ll residen. Seleccione una celda de aspecto saludable para la grabación de patch clamp (es decir, debe tener la superficie de aspecto suave y una buena forma de la célula). </li><li> Coloque una pipeta de grabación en un soporte de pipetas. Avanzar en la pipeta para la preparación rebanada. Cuando se está cerca de la rebanada preparación (~ 2 mm por encima), encontrar la punta de la pipeta con el microscopio. Una vez que la punta de la pipeta es visible bajo el microscopio, mover la punta hacia abajo, hacia la célula diana. </li><li> Ajuste el amplificador. Ajustar la pipeta a 0 mV / 0 pA (puesta a cero) y comenzar un pulso eléctrico continuo de ~ 5 mV a ~ 10 Hz. Compruebe la resistencia de la pipeta; resistencia ideal está entre 5 y 10 MΩ para la mayoría de las neuronas de la retina. </li><li> Comience soplando desde la punta. Utilice una boquilla, o utilizar una jeringa, para aplicar presión positiva cuando la pipeta se sumerge en la solución del baño. Continuamente soplar la solución interna hasta que la punta está en la superficie de la célula diana. <ol><li> Cuando la presión positiva hace un pequeño hoyuelo en el thsuperficie celular e, avanzar en la punta ligeramente y dejar de soplar. Compruebe la resistencia de la pipeta, que debería aumentar. Si está aumentando continuamente, déjelo y vigilar la resistencia hasta que llegue&gt; 1 GΩ (gigaseal). Si la resistencia no aumenta de forma espontánea, aplicar suavemente presión negativa hasta que se convierte en un gigaseal. </li></ol></li><li> Después de lograr la gigaseal, cambie el potencial de mantenimiento de -70 mV. A continuación, aplicar intermitentemente presión negativa para romper la membrana dentro de la punta de la pipeta. Cuando se realiza la configuración de célula completa, la resistencia de la pipeta puede estar entre 500 MΩ y 1 GΩ, y la corriente capacitiva se ve. A veces las corrientes postsinápticas espontáneas se pueden observar. </li><li> Anote la relación IV -80-40 mV. Los diferentes tipos de canales dependientes de voltaje se activan dependiendo del tipo de célula. </li><li> Evocó luz corrientes o tensiones sinápticas Record. </li></ol>

<ol><li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy%2C+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li>
<li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li>
<li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li>
<li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li>
<li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells%2C+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+558+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li>
<li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li>
<li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+524+Pt%22%5BJournal%5D)">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li>
<li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+for+a+binary+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li>
<li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li>
<li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li>
<li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29%2C+GABA%28C%29+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li>
<li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li>
<li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primordial%2C+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las buenas grabaciones solo se pueden lograr con buenas preparaciones retinianas y configuraciones de pinzas de parche bien diseñadas. Aunque todos los pasos descritos anteriormente son importantes, la discusión destaca algunos pasos críticos tanto para la disección como para las grabaciones. 
Para la disección, dos cosas son especialmente importantes: enfriamiento y oxigenación. Después de enuclear el ojo, retire rápidamente la parte frontal del ojo en una cámara de disección con una solución...

La retina es una de las partes únicas del sistema nervioso. Como parte accesible del cerebro, su arquitectura sináptica ha sido bien caracterizada. Además, se pueden examinar las funciones de esta red neuronal con un estímulo fisiológico: la luz. Si el tejido de la retina se aísla en una habitación oscura con los procedimientos adecuados, las neuronas del tejido responderán a la luz. Esta preparación se ha utilizado para estudiar el procesamiento de señales visuales y dilucidar varios mecanismos sinápticos y funciones de la red neuronal, así como mecanismos de enfermedades. 
Las respuestas a la luz en las neuronas de la retina se han registrado durante décadas. Los primeros estudios utilizaron electrodos afilados para hacer registros intracelularesde neuronas retinianas de cachorro de barro. En la década de 1980, se inventó la técnica de pinza de parche2, y pronto se convirtió en un método popular entre los investigadores de la visión3,4. Las grabaciones de células individuales de vertebrados inferiores, incluidas las neuronas retinianas de cachorros de barro y peces, fueron métodos populares que contribuyeron a la elucidación de los mecanismos de procesamiento de señales visuales5,6. 
Después de que se desarrollaron las técnicas de mutación genética, la retina del ratón se convirtió en un modelo más popular para los investigadores de la visión7-9. La retina de los mamíferos es más atractiva que la de los vertebrados inferiores porque está evolutivamente más cerca de la retina humana, y existe la oportunidad de utilizar modelos de enfermedades. Sin embargo, las células de la retina del ratón son pequeñas y frágiles10, y hacer preparaciones de la retina y realizar grabaciones de pinzas de parche en una habitación oscura es un desafío. A medida que la tecnología ha mejorado, se han puesto a disposición diversos enfoques para estudiar los mecanismos de señalización visual, como los estudios de imagen11 y el electrorretinograma (ERG)12. Sin embargo, el registro de una sola célula con el método de fijación de parche sigue siendo importante porque es muy sensible temporal y espacialmente en comparación con otros métodos. Por lo tanto, hemos realizado continuamente registros de pinzas de parche y hemos mejorado nuestros métodos para investigar el procesamiento de señales visuales en preparaciones de cortes de retina de ratón13-15.
En este video tutorial, se presentan los protocolos con consejos importantes. Las buenas grabaciones solo se pueden lograr con una buena preparación. La práctica de la disección de animales y la construcción de un equipo de sujeción de parche resistente permitirá a la mayoría de los investigadores lograr grabaciones exitosas.

<table><tbody><tr><td>Ratones (28-60 días de edad, macho)</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>C57BL/6J cepa</td><td></td></tr><tr><td>Polvo medio de Ames</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Herramienta de disección: pinzas</td><td>Dumont</td> <td># 4, # 5, # 55</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Herramienta de disección: tijeras</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Herramienta de disección: bisturí de cirugía</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>excelente</td></tr><tr><td>hoja de afeitar (para picador)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Chopper</td><td>hecho a mano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visor infrarrojo</td> Night <td>Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>Muestra una vista brillante. Enfocar objetos pequeños es un problema.</td></tr><tr><td>Extractor</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>excelente; hace pipetas de tamaño consistente.</td></tr><tr><td>Caja oscura</td><td>Pelican</td><td>caja oscura</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Sistema de sujeción de parche</td><td>Scientifica</td><td>Visor de corte 2000</td><td>Excelente configuración. La mayoría de los componentes clave están incluidos en un paquete. Los micromanipuladores son excelentes.</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Excelente y fácil control.</td></tr><tr><td>Adquisición de software</td><td>Molecular Devices</td><td>software pClamp</td><td>Excelente y fácil control.</td></tr><tr><td>Fuente de luz (LED)</td><td>Cool LED</td><td>pE-2 Sistema de 4 canales</td><td>Excelente</td></tr><tr><td>cámara CCD</td><td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Excelente</td></tr><tr><td>jaula de Faraday</td><td>hecha</td><td></td><td></td> a mano</tr></tbody></table>

grabación luz evocó-respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, preparaciones ratón retina slice uso de técnicas patch clamp

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

La retina es la puerta de entrada al sistema visual. Para entender los mecanismos de procesamiento de señales visuales, investigamos las funciones de redes neuronales de la retina. Neuronas de la retina en la red forman parte de numerosos subtipos. Más de 10 subtipos de células bipolares, células ganglionares, células amacrinas y han sido identificados por los estudios morfológicos. Múltiples subtipos de neuronas de la retina se cree que codificar distintas características de señalización visual, tales como el movimiento y el color, y formar múltiples vías neurales. Sin embargo, los papeles funcionales de cada neurona en el procesamiento de señal visual no se entienden completamente. El método de patch clamp es útil para abordar esta cuestión fundamental. Aquí, un protocolo para registrar las respuestas sinápticas luz evocadas en las neuronas de la retina de ratón utilizando grabaciones de patch clamp en condiciones adaptadas a la oscuridad se proporciona. Los ojos del ratón son adaptado a la oscuridad O / N, y el tramo preparativos de la retina son disecados en un cuarto oscuro utilizando iluminación infrarroja y los espectadores. La luz infrarroja noactivar fotorreceptores de ratón y así preserva su capacidad de respuesta luz. Patch clamp se utiliza para registrar las respuestas de luz evocadas en las neuronas de la retina. Se inyecta un tinte fluorescente durante las grabaciones para caracterizar los subtipos morfológicos neuronales. Este procedimiento nos permite determinar las funciones fisiológicas de cada neurona en la retina del ratón.

Una rodaja de preparación representativo se muestra en la Figura 1. La preparación rebanada está en una posición recta, mostrando fotorreceptores a las células ganglionares en una superficie plana, y no hay desprendimiento del papel de filtro. Si se inclina una rebanada, sólo una parte de la preparación está en foco, lo que hace difícil identificar una célula apropiada para la sujeción del parche. Para las grabaciones, es importante seleccionar una buena soma, que generalmente tiene una superficie brill...

Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.

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The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

El objetivo general de este experimento es obtener grabaciones de la respuesta a la luz de neuronas retinianas adaptadas a la oscuridad. Esto se logra primero extrayendo el ojo de un ratón. El segundo paso consiste en aislar la retina y cortarla para preparar secciones en rodajas.A continuación, se monta la preparación retiniana y se observa bajo un microscopio para localizar una célula diana para los registros mediante parche. Tras establecer una configuración de parche en modo célula íntegra, se aplica un estímulo luminoso en las inmediaciones de la célula. Finalmente, se puede observar simultáneamente la respuesta electrofisiológica mediante un software de adquisición.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la imagenología KRC es que la sensibilidad de grabación es alta y que las células grabadas pueden identificarse morfológicamente. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque trabajar en completa oscuridad puede resultar difícil y desorientador para quienes no están acostumbrados a hacerlo. Para comenzar un rango, coloque las herramientas de disección y las pipetas de transferencia cerca del microscopio de disección.El área de trabajo estará bien organizada para que cada herramienta pueda accederse fácilmente en la oscuridad. Cuando esté listo, utilice un visor infrarrojo para realizar el procedimiento en la oscuridad. Tras la eutanasia, enuclee rápidamente los ojos y colóquelos en un recipiente con solución fría de disección, mantenido en una caja oscura, trabajando bajo un microscopio.Transfiera un ojo a una placa con solución de disección fría, continuamente burbujeada con oxígeno. Para eliminar la córnea y el cristalino, sujete el nervio óptico en el extremo opuesto del globo ocular para evitar que se mueva, y realice una incisión en la parte superior de la córnea con un bisturí microquirúrgico.Amplíe el corte utilizando un par de tijeras quirúrgicas y retire la córnea, dejando algo de esclerótica alrededor de ella. A continuación, sujete el cristalino con pinzas finas y extráigalo lentamente. Una vez formada la copa ocular, vierta suavemente solución de disección fría y oxigenada dentro de la copa ocular usando una pipeta de transferencia pequeña.Trabaje rápidamente para mantener la forma de la retina y use presión suave para identificar los lados dorsal y ventral de la retina. Utilice visores de infrarrojos para identificar la línea que atraviesa la copa ocular de la retina, pasando cerca del disco del nervio óptico. Esta línea pasa principalmente por el lado ventral del nervio óptico, y el lado que incluye el nervio óptico es el lado dorsal.Dependiendo del experimento, realice un corte en el lado ventral o dorsal. Esto marca el lado innecesario y sirve como un marcador útil en los pasos siguientes. A continuación, retire suavemente el humor vítreo con pinzas extrafinas sin tocar la retina.El vítreo se adhiere principalmente a la parte inferior y al borde externo de la copa ocular. Dado que el vítreo podría estar firmemente adherido a la copa ocular, proceda con suavidad para evitar el desprendimiento de la retina. Continúe tirando hasta que no se sienta ninguna tensión.Una vez aislada la retina, tome la esclerótica y desprenda suavemente la retina. Utilizando el reverso de la pinza, recorte la retina y deseche la mitad innecesaria en el mismo recipiente de plástico. Corte la retina restante en dos piezas, una para cada fragmento.Corte los bordes para formar un fragmento retiniano y recorte los bordes plegados. A continuación, utilice una pipeta de transferencia grande para colocar un fragmento retiniano sobre una placa de vidrio. Aspire la solución en exceso con una pipeta pequeña y use un trozo de papel de filtro para aplanar el fragmento.Coloque suavemente un trozo de la membrana de filtro encima del tejido utilizando una pipeta de transferencia pequeña. Coloque una gota de solución de disección sobre la membrana de filtro. Espere aproximadamente 15 segundos mientras la solución se extiende y adhiere el tejido retinal a la membrana de filtro.Una vez unidos, vierta más solución de disección fría debajo y alrededor del filtro hasta que la membrana flote. A continuación, coloque la membrana del filtro en la cámara de corte y cúbrala con solución de disección. Trabajando rápidamente para asegurar que la membrana no se seque, use el cortador para seccionar el tejido retiniano en láminas.Coloque una cubierta de plástico con rieles de grasa en la cámara de corte. Transfiera una sección retinal encima de los rieles de grasa y gire la sección 90 grados para que la sección transversal quede visible. Presione la membrana de filtro contra la cubierta antes de cubrir los bordes del papel filtro con grasa.Después de inmovilizar los cortes sobre una cubierta de plástico, transfiérala a un recipiente plástico de 33 milímetros. Sumerja la preparación en solución de disección con carbón y almacene cada recipiente en una caja oscura que esté continuamente oxigenada. Para grabaciones mediante parche adherido.Prefusione los tubos con medio aims y deje que todos los burbujas salgan de la tubería. Después de fabricar las pipetas de registro con un micropipeteador de vidrio, rellene la punta con la solución para pipeta. A continuación, utilice un pipeteador micrométrico para llenar aproximadamente un tercio de la pipeta; una vez llenada, guarde cada pipeta en una caja de pipetas húmeda.A continuación, encienda el equipo para grabaciones de parche en plantas, incluyendo el amplificador, la cámara CCD y el microscopio que funcionan en condiciones de oscuridad. Coloque una preparación de corte retiniano sobre la platina del microscopio con la ayuda de un visor infrarrojo. Una vez que esté inmovilizada, inicie la perfusión continua.Establezca la temperatura de perfusión entre 33 y 37 grados Celsius. Observe la superficie del corte con una cámara CCD. Enfóquese en la ubicación objetivo.Una vez que se identifiquen los tipos celulares diana, seleccione una célula con aspecto saludable para realizar un registro de parche. Tras identificar una célula saludable, coloque una pipeta de registro en un porta-pipetas y avance la pipeta hacia la preparación del corte. Cuando esté cerca de la preparación del corte, localice la punta de la pipeta mediante un microscopio.Una vez que la punta de la pipeta sea visible bajo el microscopio, mueva la punta hacia abajo en dirección a la célula objetivo. A continuación, configure el amplificador y ajuste la pipeta en pika amp. Cinco voltios por nanoamp.Inicie un pulso eléctrico continuo de aproximadamente cinco milivoltios y aproximadamente 10 hercios y verifique la resistencia de la pipeta. Una resistencia ideal está entre cinco y doce megaohmios. Para la mayoría de las neuronas retinianas.Cuando esté listo, utilice una boquilla o una jeringa para expulsar la solución interna hasta que la punta de la pipeta esté sobre la superficie de la célula diana. Cuando la presión positiva forme un pequeño hoyuelo en la superficie celular, avance ligeramente la punta y deje de expulsar. Si la resistencia de la pipeta aumenta continuamente, déjela así y monitoree la resistencia hasta que alcance más de un gigaohmio.Si la resistencia no aumenta espontáneamente, aplique suavemente presión negativa hasta que se forme un sello giga. Una vez alcanzado el sello giga, cambie el potencial de mantenimiento a menos 70 milivoltios y luego aplique intermitentemente presión negativa para romper la membrana dentro de la punta de la pipeta. Cuando se logra la configuración de célula íntegra, la resistencia de la pipeta puede oscilar entre 500 megaohmios y un gigaohmio, y se puede observar la corriente capacitiva.Registre la relación intensidad-voltaje desde -80 hasta 40 milivoltios. Se activarán diferentes tipos de canales activados por voltaje según el tipo celular. Por último, registre las corrientes o voltajes sinápticos evocados por la luz.Esta preparación de corte observada a 10 x muestra tanto fotorreceptores como células ganglionares sin desprendimiento del papel filtro. Cuando esta preparación se observa con un objetivo de 60 x, cada capa celular se observa claramente. Los potenciales postsinápticos excitatorios evocados por la luz en neuronas retinianas fueron inducidos en respuesta a un estímulo luminoso escalonado.La amplitud máxima y el tiempo de decaimiento varían según el tipo y subtipo celular. El tipo celular y su subtipo morfológico se revelaron mediante etiquetado con azufre tras las grabaciones fisiológicas después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los científicos en el campo de la investigación de la retina estudiaran las funciones de la señalización visual natural, así como las contribuciones de los mecanismos sinápticos.

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Investigación

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Neurociencia

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De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

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Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

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Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

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Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de una retina de ratón de montaje plano

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Fotoestimulación y registros de pinza de parche de células enteras de neuronas en cortes de hipocampo de ratón

Este video muestra el registro de respuestas postsinápticas evocadas por la luz en una preparación de corte de tejido retiniano de ratón adaptado a la oscuridad. El corte de retina se coloca en una cámara de registro y se utiliza una pipeta de registro para establecer la continuidad eléctrica con una célula ganglionar de la retina. Se aplican pulsos de luz para generar potenciales postsinápticos excitatorios en las células ganglionares, que son registrados por la pipeta.

Respuestas postsinápticas evocadas por la luz en neuronas de cortes de retina de ratón

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre...

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

Este protocolo muestra cómo realizar la grabación de células enteras patch clamp en neuronas de la retina de una preparación plana de montaje.

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Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp (Video) | JoVE Journal

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

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