Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

El objetivo general de este experimento es obtener registros de la respuesta a la luz de las neuronas retinianas adaptadas a la oscuridad. Esto se logra cosechando primero un ojo de ratón. El segundo paso es aislar la retina y cortarla para la preparación de cortes.

A continuación, se monta la preparación de la retina y se observa en un microscopio para encontrar una célula objetivo para los registros de la pinza del parche. Después de establecer una configuración de pinza de parche de celda completa, se aplica un estímulo ligero en las proximidades de la celda. Por último, como respuesta electrofisiológica simultánea se puede observar a través de software de adquisición.

La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como las imágenes KRC, es que la sensibilidad de registro es alta y que las células de registro se pueden identificar morfológicamente. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque trabajar en total oscuridad puede ser difícil y desorientador para aquellos que no están acostumbrados a hacerlo. Para comenzar un rango, las herramientas de disección y las pipetas de transferencia cerca del microscopio de disección.

El área de trabajo estará bien organizada para que se pueda acceder fácilmente a cada herramienta en la oscuridad. Cuando esté listo, Dawn, un visor infrarrojo para realizar el procedimiento en la oscuridad. Después de la eutanasia, nuclear rápidamente los ojos y colocarlos en un plato de solución diseccionadora fría, guardados en una caja oscura que funciona bajo un microscopio.

Transfiera un ojo a un plato con una solución diseccionadora fría. Burbujeo continuo con oxígeno. Para extraer la córnea y el cristalino, sostenga el nervio óptico en el otro extremo del globo ocular para evitar que se mueva y haga una incisión en la parte superior de la córnea con un bisturí microquirúrgico.

Extiende el corte con unas tijeras quirúrgicas y retira la córnea, dejando algo de esclerótica rodeándola. A continuación, agarre la lente con pinzas finas y sáquela lentamente. Una vez hecho el ocular, vierta suavemente la solución diseccionante oxigenada fría en el ocular con una pequeña pipeta de transferencia.

Trabaje rápidamente para mantener la forma de la retina y ejerza una presión suave para identificar los lados dorsal y ventral de la retina. Utilice visores infrarrojos para identificar la línea que atraviesa la copa ocular de la retina y pasa cerca de la cabeza del nervio óptico. Esta línea pasa principalmente a través del lado ventral del nervio óptico y el lado, incluido el nervio óptico, es el lado dorsal.

Dependiendo del experimento, haz un corte en el lado ventral o dorsal. Esto marca el lado innecesario y es un marcador útil para avanzar. A continuación, retira suavemente el vítreo con pinzas extrafinas sin tocar la retina.

El vítreo se adhiere principalmente a la parte inferior y al borde exterior de la copa del ojo. Dado que el vítreo puede estar firmemente adherido a la copa del ojo, proceda suavemente a eliminar el desprendimiento de retina. Continúe tirando hasta que no se sienta tensión.

Una vez que la retina esté aislada, agarre la esclerótica y despegue suavemente la retina. Con la parte posterior de las pinzas, recorte la retina y deseche la mitad innecesaria en el mismo plato de plástico. Corta la retina restante en dos pedazos para cada trozo.

Corta los bordes para hacer una losa de retina y recorta los bordes plegables. A continuación, utilice una pipeta de transferencia grande para transferir una losa de retina a una placa de vidrio. Aspire el exceso de solución con una pipeta pequeña y use un trozo de papel de filtro para aplanar la losa.

Coloque suavemente un trozo de la membrana filtrante sobre el tejido con una pequeña pipeta de transferencia. Coloque una gota de solución diseccionante en la membrana del filtro. Espere unos 15 segundos mientras la solución se extiende y adhiere el tejido de la retina a la membrana del filtro.

Una vez pegados, vierta más solución de disección fría debajo y alrededor del filtro hasta que la membrana flote. A continuación, coloque la membrana filtrante en la cámara de corte y cúbrala con solución de disección. Trabajando rápidamente para asegurarse de que la membrana no se seque, use el picador para cortar el tejido de la retina en rodajas.

Coloque un cubreobjetos de plástico con rieles de grasa en la cámara de corte. Transfiera un corte de retina encima de los rieles de engrase y gire el corte 90 grados para que la sección transversal sea visible. Presione la membrana del filtro hacia abajo sobre el cubreobjetos antes de cubrir los lados del papel de filtro con grasa.

Después de inmovilizar las rodajas en un cubreobjetos de plástico, transfiéralo a un plato de plástico de 33 milímetros. Sumerja la preparación con una solución diseccionadora de carbón y guarde cada plato en una caja oscura que esté continuamente oxigenada. Para grabaciones de abrazaderas de parche.

Prepare los tubos de profusión con el medio de apuntado y permita que todas las burbujas pasen del tubo. Después de hacer pipetas de grabación con un polar de vidrio, rellene la punta con solución de pipeta. A continuación, utilice un micro llenador de pipetas para llenar aproximadamente un tercio de la pipeta una vez llena, guarde cada pipeta en una caja de pipetas húmeda.

A continuación, encienda el equipo para las grabaciones de la planta de parches, incluido el amplificador de computadora, la cámara CCD y el microscopio que funcionan en condiciones de oscuridad. Coloque una preparación de corte de retina en la platina del microscopio con la ayuda de un visor infrarrojo. Una vez inmovilizado, comience la perfusión continua.

Ajuste la temperatura de perfusión a 33 a 37 grados centígrados. Visualice la superficie de corte con una cámara CCD. Concéntrese en la ubicación de destino.

Con los tipos de células objetivo residen, seleccione una célula de aspecto saludable para una grabación de clatazos parche. Una vez identificada una célula sana, coloque una pipeta registradora en un soporte de pipetas y avance la pipeta hasta la preparación de la rebanada. Cuando esté cerca de la preparación de la loncha, busque la punta de la pipeta con un microscopio.

Una vez que la punta de la pipeta sea visible bajo el microscopio, muévala hacia abajo, hacia la célula objetivo. A continuación, configure el amplificador y ajuste la pipeta en el amplificador pika. Cinco voltios por amperio Nana.

Inicie un pulso eléctrico continuo de aproximadamente cinco milivoltios y aproximadamente 10 hercios y verifique la resistencia de la pipeta. Una resistencia ideal está entre cinco y 12 mega ohmios. Para la mayoría de las neuronas de la retina.

Cuando esté listo, utilice una boquilla o jeringa para soplar la solución interna hasta que la punta de la pipeta esté en la superficie de la célula objetivo. Cuando la presión positiva haga un pequeño hoyuelo en la superficie de la celda, avance ligeramente la punta y deje de soplar. Si la resistencia de la pipeta aumenta continuamente, déjela y controle la resistencia hasta que alcance más de un giga ohmio.

Si la resistencia no aumenta espontáneamente, aplique suavemente presión negativa hasta que se convierta en un sello giga. Una vez logrado el giga sellado, cambie el potencial de retención a menos 70 milivoltios y, a continuación, aplique presión negativa de forma intermitente para romper la membrana dentro de la punta de la pipeta. Cuando se realiza la configuración completa de la celda, la resistencia de la pipeta puede estar entre 500 mega ohmios y un giga ohmio, y la corriente capacitiva es observable.

Registre la relación IV de menos 80 a 40 milivoltios. Se activarán diferentes tipos de canales con compuerta de voltaje según el tipo de celda. Por último, registre las corrientes sinápticas o voltajes evocados por la luz.

Esta preparación de corte vista a 10 x muestra tanto los fotorreceptores como las células ganglionares sin desprenderse del papel de filtro. Cuando esta preparación se ve con un objetivo de 60x, cada capa celular se observa claramente. Los potenciales postsinápticos excitatorios evocados por la luz de las neuronas de la retina se evocaron en respuesta a una luz escalonada.

La amplitud máxima y el tiempo de decaimiento varían según el tipo y subtipo de célula. El tipo de célula y su subtipo morfológico se revelaron mediante el marcaje de azufre después de los registros fisiológicos posteriores a su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los científicos en el campo de la investigación de la retina estudiaran las funciones de la señalización visual natural, así como las contribuciones de los mecanismos sinápticos.