La visualización directa de la murino Dorsal coclear Núcleo de optogenética La estimulación de la vía auditiva

El objetivo general de este procedimiento es acceder quirúrgicamente al núcleo coclear en un modelo de ratón para permitir experimentos basados en la optogenética. Esto se logra preparando primero al ratón para la craneotomía y retrayendo la piel, el tejido blando y el músculo que recubre el cuero cabelludo lateralmente. Como segundo paso, se realiza una craneotomía en el hueso interparietal izquierdo, a unos dos milímetros de la línea de sutura lambda.

Esta región se superpone al núcleo coclear. A continuación, con un tubo de succión de cinco franceses, aspire la porción más lateral del cerebelo izquierdo que recubre la DCN. El resultado muestra una vista sin obstrucciones de la DCN.

Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos de asistencia, como la guía estereotáctica, son tanto la obtención de la visualización directa del núcleo coclear como la colocación de un simulador de neuros, como una fuente de luz o una guía de electrodos, en la superficie del tronco encefálico. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave tanto en el campo de la optogenética como en el auditivo. Ninguna prótesis, como la transferencia de genes, permite que el tronco encefálico auditivo sea estimulado por la luz con suficiente resolución facial y temporal.

Después de anestesiar a un ratón con ketamina y xilacina por vía intraperitoneal, verifique el reflejo de retirada del pellizco del dedo del pie y controle su frecuencia cardíaca y respiratoria para confirmar la anestesia adecuada. A continuación, aplica un ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad. A continuación, afeita el vello que recubre el cuero cabelludo para proporcionar un acceso sin obstrucciones al sitio quirúrgico.

Después de eso, coloque el mouse en un soporte estereotáxico para animales pequeños. Ajuste la pinza del hocico para que esté lo suficientemente suelta como para permitir una respiración adecuada, pero lo suficientemente apretada como para inmovilizar completamente la cabeza del ratón. Bajo un microscopio, haga una incisión vertical a través de la piel, comenzando en la línea media directamente entre el pabellón auricular y extendiéndose hasta la parte mimada del occipucio.

A continuación, desplaza la piel lateralmente. Extirpe los músculos que recubren los huesos parietal izquierdo, interparietal y occipital del cráneo con un bisturí o una tijera de iris. Mientras tanto, minimice el sangrado aplicando una presión suave con un aplicador con punta de algodón durante 10 a 15 segundos.

A continuación, identifique las líneas de suturas sagital y lambda. Usando un par de joyas de Ron. Realizar una craneotomía en el hueso interparietal izquierdo a unos dos milímetros de la línea de sutura lambda.

Esta región se superpone a la DCN después de la craneotomía. Se debe observar una fina capa de duramadre que recubre el cerebelo, retírela cuidadosamente con una hoja de bisturí. Retire la sangre coagulada con puntas de algodón o gotee suavemente solución salina sobre el cerebelo para eliminar la sangre.

A continuación, utilice un tubo de succión de cinco French para aspirar la porción más lateral del cerebelo izquierdo, superponiendo la DCN para ayudar. En la aspiración, ajuste el plano focal del microscopio a la profundidad esperada del núcleo coclear para mejorar la visualización y garantizar una imagen nítida. Extirpar aproximadamente de un cuarto a un tercio del cerebelo izquierdo.

El principal hito adyacente a la DCN es la AM del canal semicircular superior. Después de la aspiración, el sangrado adicional, la acumulación de líquido cefalorraquídeo y el desplazamiento del cerebelo en la DCN aparecerán rápidamente con solución salina en la craneotomía para evitar la coagulación de la sangre. Utilice una combinación de frotamiento suave con un punto dental y succión para despejar el camino para la visualización directa de la DCN.

Después de que el DCN esté claramente visible y libre de sangre y líquido cefalorraquídeo suprayacentes, realice una microinyección a presión del vector en él con una jeringa Hamilton hermética al gas de cinco microlitros. Utilice una aguja de calibre 34 con un bisel poco profundo para minimizar el traumatismo cerrado y localizar el volumen de inyección dentro de la DCN. A continuación, introduzca lentamente la aguja con un micromanipulador hasta que la punta ya no sea visible bajo la superficie del DCN.

Empieza a inyectar 1,5 microlitros del vector. Una vez completado esto, retire lentamente la aguja, posteriormente vuelva a aproximar la piel y permita que el ratón se recupere según el procedimiento de recuperación estándar. Después de dos a cuatro semanas de curación e incubación por transferencia génica mediada por virus, vuelva a anestesiar el ratón inyectado por vector, luego retire el tejido cicatricial sobre el sitio de la craneotomía.

Después de eso, identifique una combinación de cerebelo restante y tejido cicatricial que recubre la DCN. Utilice una succión de cinco French para aspirar el cerebelo suprayacente y el tejido cicatricial. Siguiendo la aspiración.

Aplique rápidamente solución salina en la craneotomía. Para prevenir la ululación de la sangre, utilice una combinación de suaves toques dentales y succión para despejar el camino para la visualización directa de la DCN. La DCN ahora es accesible para los experimentos de fisiología basados en la optogenética que se muestran aquí es la colocación de una fibra láser directamente en la superficie de la DCN, lo que permite la estimulación óptica de la serie de pulsos de luz azul de DCNA infectada con opsina en la superficie de la DCN infectada que da como resultado una respuesta auditiva del tronco encefálico impulsada ópticamente.

Mediante un micromanipulador, se coloca una fibra óptica acoplada a un láser de luz azul directamente sobre la superficie del núcleo coclear y se enciende. Aquí podemos identificar la luz azul pulsada en la superficie del núcleo coclear. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la simulación eléctrica del núcleo, que nos permite comparar directamente no solo las respuestas neuronales evocadas acústicamente, sino también las evocadas eléctricamente con la evocada por simulación óptica.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y realizar la craneotomía y la aspiración cerebelosa con el objetivo final de la visualización directa y el acceso al núcleo coclear.