Name: Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprende la co-expresión de proteínas en Escherichia coli para ensamblar complejos proteicos in vivo usando plásmidos compatibles. Este método supera problemas de solubilidad y facilita estudios bioquímicos.

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1. Aislamiento de E. coli cotransformantes <ol><li> Preparar las células electro-competente del E. apropiado cepa de E. coli que se transforma. Traslado a 1 ml de medio LB (triptona, extracto de levadura, NaCl a 10, 5, y 10 g / l, respectivamente) de una sola colonia de la cepa de elección, y se incuba a 37 ° C bajo condiciones de agitación de 180 rpm. Diluir el precultivo 1: 500 en 25 ml de medio LB fresco y se incuba el cultivo a 37 ° C. </li><li> En fase logarítmica (0,6 OD) centrifugar la suspensión de células a 5.000 xg durante 20 min), y resuspender el pellet en 10%, v / v de glicerol-agua estéril enfriada con hielo en la mitad del volumen de cultivo original. Repita este paso 4 veces, reducir a la mitad cada vez que el volumen de resuspensión. Por último, volver a suspender el sedimento en glicerol / agua y dividir la suspensión de células en 50 ml de alícuotas. Almacene las alícuotas a -80 ° C hasta 6 meses. </li><li> Disolver el plásmido deseado en agua estéril suplementado con EDTA 0,5 mM. Deshielo en ice una alícuota de células electro-competente y mezclar con una cantidad apropiada (2,5-5 ng) de vector. Dispensar la mezcla en una cubeta de 0,1 cm adecuado para electroporación, y aplicar 1,8 kV. </li><li> Inmediatamente transferir las células a electroporación en 1 ml de medio SOC (medio LB suplementado con 0,2% w / v de glucosa, 10 mM de MgCl 2, KCl 2,5 mM), se incuba durante 1 h bajo agitación, y, finalmente, transferir 100 ml de alícuotas a placas de Petri que contiene agar LB con el antibiótico apropiado. Incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Purifica los transformantes estriando colonias individuales en placas de Petri. </li><li> Preparar las células electro-competentes de los transformantes primarios y repita los pasos 1.1 a 1.5 para transformar con otros plásmidos. </li><li> Preparar las existencias de glicerol de los co-transformantes. Transferencia de una sola colonia en LB suplementado con los antibióticos apropiados, se incuba a 37 ° C bajo agitación, y en fase logarítmica (0,6 OD) Centrifugar la suspensión de células a 5.000 xg durante 20 min. Resuspend el sedimento en LB-antibióticos que contienen medio de 15% v / v de glicerol. Distribuir en alícuotas y almacenar a - 80 ° C. </li></ol> 2. Co-expresión de α y ε Subunidades de E. coli ADN polimerasa III <ol><li> Transferencia con un asa estéril una pequeña cantidad de la glicerol cepa apropiada (por ejemplo, TOP10 / PGOOD-ε243 y TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, véase la Figura 1) en una placa de Petri que contenían medio LB y los antibióticos. Deje que la células suspensión seca en la placa de Petri, y la racha de las células de las gotas. Se incuba a 37 ° CO / N. </li><li> Transfer, usando un palillo de dientes estéril, una sola colonia de 1 ml de medio LB-antibióticos. Incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir el precultivo 1: 500 en medio fresco y se incuba a 30 ° C durante 15 hr. </li><li> Añadir IPTG, arabinosa, o arabinosa y IPTG, 1 mM cada uno. Se incuba a 30 ° C durante 2,5 horas. Recoger las células, y almacenar los pellets a -20 ° C. </li><li> Pellets de descongelación en hielo y se resuspende en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), pH 8). Homogeneizar suavemente la suspensión de células con un alfarero vaso frío. </li><li> Someter a ultrasonidos a 15 W durante 15 segundos, seguido por 15 seg intervalo de refrigeración (4 ciclos). </li><li> Centrifugar los extractos de proteínas totales a 10.000 xg durante 20 min, a 4 ° C para recuperar la fracción soluble. </li><li> Analizar por alícuotas de cada extracto de proteína soluble SDS-PAGE (12,5% de acrilamida). Para este objetivo, transferir 20 l de cada extracto de proteína soluble a tubos Eppendorf que contienen 60 l de H 2 O y 20 l de tampón de carga (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) y hervir durante 5 min. Cargar 18 l de cada muestra y realizar la electroforesis a 140 V durante aproximadamente 1,5 hr. </li></ol> 3. Co-expresión de la subunidad α de Deinococradiodurans CUS ADN polimerasa III y ε Subunidad de E. coli ADN polimerasa III <ol><li> Preparar un cultivo previo de la E. coli cepa TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 en 1 ml de medio LB-ampicilina-tetraciclina e incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir 1: 1000 en medio fresco y se incuba O / N a 37 ° C. </li><li> Diluir 1: 100 en 200 ml de medio fresco, se incuba a 37 ° C durante 3 horas, a continuación, inducir durante 3 horas con arabinosa y IPTG, 1 mM de cada uno. Recoger las células, y almacenar el pellet a -20 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado en 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogeneizar y romper las células como se describe en 2.4 y 2.5. </li><li> Inmediatamente Centrifugar las células lisado a 10.000 xg durante 20 min. Deseche la pastilla. Se filtra el sobrenadante con un embudo Büchner equipado con 3 capas de papel de filtro. Aplicar vacío suave. Para evitar la excesiva formación de espuma, mantenga el matraz Erlenmeyer vacío en hielo durante la filtración. </li><li> Determinar la concentración de proteína de acuerdo con Bradford 14. </li></ol> 4. Cromatografía de filtración en gel <ol><li> Equilibrar la columna de filtración en gel un 16x70 con camisa de agua (200) con 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8. carga sobre la columna del extracto de proteína soluble. Para una resolución óptima, utilice un bucle de muestra de 1 ml. Realizar la cromatografía en 0,6 ml / min. Mantenga temperatura de la columna a 4 ° C en todo. </li><li> Recoger fracciones de 0,9 ml y analizarlas por SDS-PAGE. Transferencia de 20 l de cada fracción correspondiente a tubos Eppendorf que contienen 60 l de H 2 O y 20 l de tampón de carga (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) y hervir durante 5 min. Cargar 18 l de cada muestra y realizar la electroforesis a 140 V durante aproximadamente 1,5 hr. </li><li> Determinar la 3&#39;-5 &#39;exonucleasa y la actividad de la ADN polimerasa de cada fracción en 96-nosll microplacas. Ensayar la actividad exonucleasa usando timidina 5&#39;-monofosfato de éster p-nitrofenil (p NP-TMP) como sustrato 15. Estimar la actividad de la polimerasa de ADN utilizando la PPX (pirofosfatasa, purina nucleósido fosforilasa, la xantina oxidasa) de la enzima de acoplamiento de ensayo de 16 y 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazolio (INT) como aceptor de electrones 16. </li></ol> 5. Mutación análisis de las poblaciones Co-expresan la subunidad ε de tipo silvestre de E. coli ADN polimerasa III y la mutagénico εD12A Variant <ol><li> Transferir una sola colonia de E. coli TOP10 contiene el pBAD-ε y los pGOOD1-εD12A 11 vectores a 1 ml de medio LB-antibióticos. Incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Diluir el precultivo 1: 250 en 3 matraces que contenían medio fresco (10 ml), agregar los inductores apropiados (arabinosa, IPTG, o arabinosa y IPTG, 1 mM cada uno) y se incuba a 37 ° Cdurante 8 horas. Preparar cultivos paralelos no inducidas. </li><li> Recoger alícuotas de 1 ml, luego se diluye 1: 500 en los nuevos matraces que contienen medio fresco (10 ml) suplementado o no con los inductores apropiados. Incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Repita los pasos 5.2 y 5.3 y recoger alícuotas de 1 ml. </li><li> Determinar el número de generaciones se produjo en cada cultura. Traslado en placas de LB, 100 l de diluciones en serie apropiadas de inóculo y la cultura. Incubar O / N a 37 ° C. Contar las colonias en las placas de LB, y calcular el registro del número de células presentes en el inóculo (log I) y en el cultivo al final del crecimiento (log C). Para determinar el número de generaciones, utilice la fórmula: (log C - log I) /0.301. </li><li> Centrifugar a 5000 xg durante 20 min y resuspender las células en 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Para permeabilizar las células, añadir 2-3 gotas de cloroformo y agitar durante 20 segundos. </li><li> Determinar la β-actividad glucosidasa de cada alícuota en una microplaca de 96 pocillos, usando p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNPGluc) como sustrato. Añadir a cada pocillo 100 l de células permeabilizadas y 100 l de sustrato (16 mg / ml solución madre en H 2 O). Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire en los pozos. Leer la absorbancia a 420 nm, usando un lector de microplacas y el filtro apropiado. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las proteínas pueden ser intrínsecamente desordenados, con regiones cuya estructura terciaria no está restringido a un número limitado de conformaciones 25. Estas proteínas desordenadas son generalmente propensos a la agregación 25, y su aislamiento y caracterización pueden representar una tarea difícil. La subunidad ε de E. coli DNA polimerasa III tiene dos dominios distintos 26,27, a saber: i) el dominio N-ter, teniendo la &#39;actividad exonucleasa 3&#39;-5, y competente en l...

La introducción de tecnologías de sobreexpresión impulsado cualquiera de los estudios bioquímicos de las enzimas bajo número de copias y la producción industrial de proteínas farmacológicamente activas (por ejemplo, insulina). Desde la llegada de estas tecnologías, los avances se han logrado importantes para aumentar el rendimiento y la calidad de las proteínas recombinantes. Además, los sistemas de sobreexpresión procariotas y eucariotas 1,2 3 fueron desarrollados en los últimos años, ofreciendo alternativas útiles a la &quot;caballo de batalla&quot; de la biotecnología de proteínas, es decir, la Escherichia coli. En particular, la disponibilidad de plataformas alternativas a E. coli condujo a la producción de péptidos o proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales recombinantes. Sin embargo, se debe mencionar que la E. coli sigue siendo el organismo de elección para la producción de proteínas recombinantes. Esto se debe a varios factores, entre los cuales los más relevantes se puedenconsiderado: i) la disponibilidad de un buen número de sistemas de sobreexpresión (vectores de expresión y cepas) para E. coli 1,2; ii) veces el corto generación y altos rendimientos de biomasa, de E. coli en una variedad de medios ricos y sintético; iii) la fácil manipulación ya sea en la bioquímica y en el nivel genético de este microorganismo; iv) el aislamiento de cepas capaces de la producción de proteínas tóxicas 4; v) la construcción de cepas que ofrecen inducción homogénea a nivel de población 5,6. Además, se ha demostrado recientemente que los sistemas de expresión adecuados para la producción en E. coli de proteínas después de la traducción modificados se puede diseñar y construir 2. En la actualidad, la sobreexpresión de proteínas se utiliza principalmente para obtener proteínas monoméricas o homo-oligómero, cuyos hiperproducción se puede realizar con un solo gen clonado en un plásmido apropiado. Sin embargo, la atención fue recientementepagado a la construcción de E. sistemas de la proteína co-expresión de E. coli, desafiando la producción, in vivo, de complejos hetero-oligoméricos 2. Curiosamente, los primeros experimentos de la proteína co-expresión se dirigieron a la asamblea inter-especies de grandes y pequeñas subunidades de carboxilasa cianobacterias ribulosa-1,5-bisfosfato / oxigenasa 7,8, y la asociación de formas truncadas y de longitud completa de VIH-1 transcriptasa inversa 9. Estos estudios pioneros demostraron que la proteína co-expresión representa una poderosa alternativa a los tradicionales en la reconstitución in vitro. Además, la proteína co-expresión en E. coli se utilizó para producir diferentes proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales 2, para obtener proteínas que contienen aminoácidos no naturales 2, y para aumentar el rendimiento de proteínas de la membrana sobreexpresados ​​2. Por otra parte, el potencial de la proteína co-expresión como una herramienta para confiere a E. coli competirna vez en la secreción de la proteína está bajo investigación activa 2. Dos estrategias principales de proteínas co-expresión en E. coli puede perseguirse: i) el uso de un único plásmido para albergar los diferentes genes que se sobreexpresa; ii) el uso de múltiples plásmidos en células individuales para co-expresar las proteínas diana. En el primer caso, los criterios para la elección del plásmido no difieren de las de los experimentos de sobreexpresión de la proteína individuales tradicionales, aunque plásmidos particulares que contienen elementos en tándem promotor / operador se construyeron para la co-expresión 10. Por tanto, esta primera aproximación es bastante simple. Sin embargo, se debe mencionar que el uso de un único plásmido para co-expresar diferentes proteínas se enfrenta a dos dificultades principales: i) la masa molecular de los vectores aumenta con el número de genes alojados, lo que limita el número de proteínas co-expresó; ii) cuando múltiples genes se clonan bajo el control de un único promotor, de polaridad puede decrease la expresión de los genes distales del promotor. El uso de plásmidos dobles o múltiples en una sola E. células de E. coli tiene que lograr la compatibilidad de los vectores de elección, por lo tanto, la imposición de limitaciones a las combinaciones admisibles de plásmidos. Sin embargo, esta segunda estrategia de co-expresión cuenta con la ventaja de contener la masa molecular de los vectores, y limita la polaridad. Recientemente hemos construido un sistema de co-expresión de la proteína diseñada para facilitar el vaivén de genes entre los plásmidos co-expresión 11. En particular, se construyó la serie vectores PGOOD, las características relevantes de los cuales son los siguientes: i) un origen de replicación p15A, para proporcionar compatibilidad de los plásmidos PGOOD con los vectores comerciales que contiene el origen ColE1 (por ejemplo, la serie pBAD 12); ii) un casete de resistencia a tetraciclina; iii) la presencia de lac -derivado elementos reguladores, es decir, el promotor-operador (O 1) par y el lacI </em&gt; q gen. El uso de un par pBAD-PGOOD apropiado, hemos sido capaces de sobreexpresan el núcleo catalítico de E. coli DNA polimerasa III, compuesto de tres subunidades diferentes, es decir, α (la &#39;de la polimerasa, ε (la 3&#39;-5 5&#39;-3)&#39; exonucleasa) y θ (ε estabilización) 13. En particular, hemos demostrado que la co-expresión del complejo αεθ era estrictamente dependiente de la adición a la E. coli medio de cultivo tanto de IPTG y arabinosa, desencadenando la sobreexpresión de PGOOD y pBAD, respectivamente (Figura 1A). En el presente informe, se expone cómo la proteína co-expresión puede resolver eficientemente las dificultades vinculadas a la mala solubilidad de una subunidad de proteína compleja. Además, se muestra cómo en ensayos de complementación de proteínas in vivo se pueden realizar, y finalmente nos informe sobre el uso de la proteína co-expresión de la frecuencia de mutación sintonizar E. columnayo. Para ello, utilizamos parejas PGOOD-PBAD adecuados para ilustrar ejemplos relevantes de cada estudio de caso.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PNP-gluc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7006</td><td></td></tr><tr><td>pNP-TMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fluka</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Solución de acrilamida 30%</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td>Para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Persolfato de amonio</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td>Para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>161-0718</td><td>Para gel electroforesis</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td>Para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td>Para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>161-0719</td><td>Para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Cubetas 0,1 cm</td><td>BioRad</td><td>1652089</td><td>Para electroporación</td></tr><tr><td>centrífuga 5415R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra 21R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparato de cromatografía GradiFrac</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II electroporación</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas 550</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean 3 celdas</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; escherichia coli</em

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Informamos aquí que la expresión de complejos proteicos in vivo en Escherichia coli puede ser más conveniente que los experimentos tradicionales de reconstitución in vitro. En particular, demostramos que la escasa solubilidad de la subunidad ε de la ADN polimerasa III de Escherichia coli (con actividad exonucleasa 3'-5') mejora mucho cuando la misma proteína se coexpresa con las subunidades α y θ (con actividad ADN polimerasa y ε estabilizadora, respectivamente). También demostramos que la coexpresión de proteínas en E. coli se puede utilizar para probar de manera eficiente la competencia de subunidades de diferentes especies bacterianas para asociarse en un complejo proteico funcional. De hecho, demostramos que la subunidad α de la ADN polimerasa III de Deinococcus radiodurans puede coexpresarse in vivo con la subunidad ε de E. coli. Además, informamos sobre el uso de la coexpresión de proteínas para modular la frecuencia de mutaciones en E. coli. Al expresar la subunidad ε de tipo salvaje bajo el control del promotor araBAD (inducible por arabinosa) y coexpresar la variante mutagénica D12A de la misma proteína, bajo el control del promotor lac (inducible por isopropil-tio-β-D-galactopiranósido, IPTG), pudimos alterar la frecuencia de mutación de E. coli utilizando concentraciones adecuadas de los inductores arabinosa e IPTG. Finalmente, discutimos los avances recientes y los desafíos futuros de la coexpresión de proteínas en E. coli.

La subunidad ε de E. coli ADN polimerasa III consta de 243 aminoácidos y tiene poca solubilidad 17,18, a menos que se eliminan los residuos 187-243 17. Sin embargo, hemos demostrado que el 11 co-expresión de α de longitud completa, ε y θ subunidades produce ADN polimerasa III soluble núcleo catalítico (Figura 1). En particular, utilizando el sistema de pBAD-PGOOD co-expresión, hemos demostrado que: i) la sobreexpresión de α y ε subunidades puede ser controlado i...

La coexpresión de proteínas es una poderosa alternativa a la reconstitución in vitro de complejos proteicos, y es de ayuda en la realización de pruebas bioquímicas y genéticas in vivo. En este trabajo se informa sobre el uso de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli para obtener complejos proteicos y ajustar la frecuencia de mutación de las células.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

El objetivo general del siguiente experimento es coexpresar diferentes proteínas en Escherichia coli y evaluar su ensamblaje in vivo. Esto se logra utilizando dos plásmidos compatibles, pBAD y pGOOD, para cotransformar E. coli TOP10. Como segundo paso, la cepa cotransformada se cultiva a 30 grados Celsius y luego se induce para sobrexpresar las proteínas.A continuación, se extraen las proteínas solubles y se someten a filtración en gel para analizar la asociación de las proteínas sobreexpresadas. Los resultados muestran que la coexpresión en *E. coli* es una herramienta eficiente para la producción de complejos proteicos ensamblados *in vivo* y resulta conveniente para evitar la baja solubilidad de las subunidades libres de proteína. La coexpresión es una herramienta poderosa en bioquímica, ya que permite la sobreexpresión en una sola célula de diferentes proteínas en sentido inverso.Puede reconocerse que la sobreexpresión de genes individuales fue esencial para el estudio de las proteínas del número Lopi. Sin embargo, cuando el desafío consistía en el estudio de complejos proteicos, era necesario sobreexpresar, aislar y reconstituir in vitro proteínas individuales por separado. Es

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Aprende la co-expresión de proteínas en Escherichia coli para ensamblar complejos proteicos in vivo usando plásmidos compatibles. Este método supera problemas de solubilidad y facilita estudios bioquímicos.

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