Name: Método EPA 1615. La medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y RT-qPCR. II. Ensayo Virus Culturable total (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprende a medir virus infecciosos en agua mediante el método EPA 1615 usando células renales de mono Buffalo Green. Esta técnica estandarizada permite cuantificar partículas virales y evaluar riesgos para la salud pública.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen al Dr. Mark Borchardt, Departamento de Agricultura de EE.UU., Marshfield, WI, por suministrar el serotipo 3 del virus de la poliomielitis Sabin utilizado en este estudio; Mary Jean See, Nancy Schable y Jenifer Jones de Dynamac Corporation para la preparación de cultivos BGM; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar y Larry Wymer por sus contribuciones en la evaluación general del Método 1615 de la USEPA; Gretchen Sullivan por asistencia técnica; y a los propietarios de pozos privados y servicios públicos locales por permitirnos recolectar muestras de agua. Aunque este trabajo fue revisado por la USEPA y aprobado para su publicación, es posible que no refleje necesariamente la política oficial de la Agencia. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye un respaldo o recomendación de uso.

NOTA: Por favor, véase la sección Materiales suplementarios S1 para obtener una lista de definiciones. Los procedimientos de control de calidad asociados con el método USEPA 1615 se describen en la sección S2 materiales suplementarios. 1. Filtro Procedimiento elución <ol><li> Primera elución <ol><li> Colocar 500 ml de extracto de carne 1,5% tamponada, pH 9,0, se calentó a temperatura ambiente en un cilindro graduado. Abra la carcasa del cartucho de filtro y añadir una cantidad suficiente de extracto de carne para cubrir el filtro electropositivo completamente. Vuelva a colocar la tapa de la carcasa del filtro y vierta el extracto de carne que queda en un vaso estéril. </li><li> Después de 1 minuto de tiempo de contacto, pasar la solución de extracto de carne de vacuno en la carcasa junto con la restante en el vaso de precipitados estéril lentamente a través del filtro utilizando un recipiente de presión o una bomba peristáltica. Recoger el eluido en un vaso de precipitados de vidrio de 2 L. </li></ol></li><li> En segundo lugar elución <ol><li> Repita los pasos 1.1 utilizando otros 500 ml adicionales de extracto de carne 1,5% tamponada, Pero aumentar el tiempo de contacto en el paso 1.1.2 a 15 min. </li><li> Añadir el extracto de carne de la segunda elución al vaso de precipitados que contiene 2 L que a partir de la primera elución. Añadir una barra de agitación estéril al vaso de precipitados. </li></ol></li></ol> Procedimiento 2. Concentración orgánica floculación <ol><li> Esterilizar un electrodo de pH de tipo combinado con hipoclorito de sodio 0,525% durante al menos 5 min. Enjuagar el electrodo con estéril dH 2 O y luego eliminar el cloro con tiosulfato de sodio 0,05 M. Calibrar el medidor de pH con pH 4 y 7 estándares. </li><li> Colocar el vaso que contiene el eluato en una placa de agitación. Encienda la placa y aumentar la velocidad de agitación hasta que se forma un vórtice. </li><li> Ajustar el pH del eluato a 3,5 ± 0,1 lentamente por adición gota a gota de HCl 1,2 M al eluido. Añadir el HCl gota a gota, porque además de la rápida será inactivar virus. Durante este tiempo el eluato se convertirá nublado como un precipitado comienza a formarse. </li><li> Reducir la mezcla speed a un revuelo lento y luego continuar a controlar y mantener el pH del eluato a 3,5 ± 0,1 a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Se vierte la suspensión extracto de carne precipitado en una o más botellas de centrífuga y centrifugar durante 15 min a 2500 xg a 4 ° C. Retire las botellas de la centrífuga y, o bien aspirar o lentamente decantar el sobrenadante para evitar la pérdida del precipitado sedimentado. Descartar el sobrenadante. NOTA: No puede haber una considerable variación entre lotes de extracto de carne de vacuno en la cantidad y calidad del precipitado. El precipitado producido a partir de algunos lotes se disolverá rápidamente mientras que a partir de otros lotes se disuelve con dificultad. </li><li> Añadir 30 ml de fosfato de sodio 0,15 M a la botella de centrífuga que contiene el precipitado. <ol><li> Utilizar fosfato de sodio 0,15 M, pH 9,0, para precipita a partir de lotes extracto de carne que se disuelven en 5 minutos. Se agita durante 10 minutos después de que el precipitado se haya disuelto completamente, y luego ir inmediatamente al paso 2.7. </li><li> Utilice fosfato de sodio 0,15 M, pH 7,0 a 7,5 para todos los otros precipitados. Se agita durante 10 a 15 min para disolver, o por precipitados más difíciles, romper con una espátula estéril, mediante la elaboración de la solución varias veces arriba y abajo durante la agitación con una pipeta, agitando el precipitado a 160 rpm en un agitador orbital, o por una combinación de estos procedimientos. NOTA: Cuando se utiliza más de una botella de centrífuga, se combinan los precipitados utilizando menos de 30 ml de fosfato de sodio y luego utilizar la parte restante de los 30 ml para enjuagar las botellas después de combinar los precipitados en una botella o vaso de precipitados. </li><li> Si el precipitado combinado es en una botella de centrífuga de fondo plano, añadir una barra de agitación a la botella. Ir al paso 2.6.5. </li><li> Si el precipitado combinado está en una botella de centrífuga con un fondo cónico, la transfiere en una pequeña cubeta de vidrio y añadir una barra de agitación al vaso de precipitados. </li><li> Coloque la botella o vaso de precipitados sobre un agitador magnético, y se agita hasta que el precipitate se haya disuelto completamente. </li><li> Re-esterilizar un electrodo de pH tipo combinación con hipoclorito de sodio 0,525% y eliminar el cloro con tiosulfato de sodio 0,05 M como se describe en el paso 2.1. Calibrar el medidor de pH con un pH de 7 y 10 estándares. ajustar lentamente el pH del precipitado completamente disuelto a 9,0 con NaOH 1 M y luego se agita durante 10 min. </li></ol></li><li> Retire la barra de agitación y centrifugar el precipitado disuelto durante 10 minutos a 4,000-10,000 xgy 4 ° C. </li><li> Con cuidado, verter el sobrenadante en un vaso de vidrio sin perturbar el sedimento. Añadir una barra de agitación al vaso de precipitados y desechar el sedimento. </li><li> Colocar el vaso de precipitados sobre un agitador magnético, y se agita la solución. Añadir gota 1,2 M HCl aconsejable ajustar el pH a 7,0-7,5. </li><li> Filtro de esterilizar el sobrenadante mediante paso a través de un filtro esterilizante que contiene un filtro previo que se había pretratado con 15 ml de extracto de carne 1,5%, 0,05 M de glicina, pH 7,0 a 7,5. </li><li> Volum de la muestra de ensayoe (S) de los cálculos: <ol><li> Utilizar la ecuación 1 para calcular S para todas las muestras de prueba, excepto el Laboratorio fortificada en blanco y el reactivo de laboratorio en blanco, <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> Ecuación 1 donde D (Volumen de la muestra original de agua ensayada) es de 500 l para las aguas subterráneas, TSV (volumen total de muestra) es el volumen de la muestra de campo pasa a través del filtro de cartucho electropositivo 5 pulgadas recibido en el laboratorio, y FCSV (Final Concentrado Volumen de la muestra) es el volumen después de la filtración en el Paso 2.10. Un ejemplo se muestra en la sección materiales suplementarios S4.1. </li><li> Calcular S para la fortificada laboratorio en blanco (LFB; es decir, un control positivo de la calidad del agua mediante sembrado de grado reactivo) y el reactivo de laboratorio en blanco (LRB, es decir, un control negativo calidad utilizando agua de grado reactivo) multiplicando el FCSV por 0,3. </li></ol></li><li> Divida la FCSV en three submuestras. <ol><li> Preparar submuestras 1 y 2 con un volumen igual a 1,04 veces el volumen de muestra de ensayo. Congelar estas submuestras en o por debajo de -70 ° C si no pueden ser analizados usando el ensayo de virus cultivables totales (Submuestra 1, Paso 4) o tratados a los ensayos moleculares (no mostrados) dentro de las 24 horas; de lo contrario, mantener a 4 ° C. </li><li> Congelar el volumen restante (submuestra 3) en o por debajo de -70 ° C. </li></ol></li><li> Calcular el volumen del inóculo dividiendo el S por 10. </li></ol> 3. Virus Total Culturable quantal Ensayo NOTA: Para todas las medidas siempre se agregan soluciones con cuidado para no perturbar la monocapa de células. <ol><li> Decantar o aspirar el contenido de los medios recipientes de ensayo que contenían una monocapa de células BGM a los 3-6 días después de la división y luego añadir un volumen de solución salina equilibrada igual a los medios de comunicación eliminado. </li><li> Decantar o aspirar la solución salina equilibrada de la te de cultivo celularvasos st usadas, y se inoculan los recipientes de ensayo de cultivo de células <ol><li> Inocular 10 recipientes de ensayo para cada muestra de ensayo con un volumen de submuestra 1 igual al volumen del inóculo junto con el total de los controles de ensayo cuánticos de virus cultivables (materiales suplementarios sección S2.4). </li><li> Para la LFB y el Laboratorio fortificada matriz de la muestra (LFSM, es decir, cabeza de serie de la muestra de matriz de agua), preparar 5-, 25-, y diluciones de 125 veces utilizando submuestra 3 y fosfato de sodio 0,15 M, pH 7,0 a 7,5 como diluyente. Un ejemplo de un procedimiento para hacer las diluciones se da en la sección de materiales suplementario S3. Inocular 10 recipientes de ensayo de cultivo de células lavadas para cada serie de dilución utilizando un volumen de inóculo en cada recipiente de ensayo además de los vasos inoculados con Submuestra no diluido 1 en el paso 3.2.1. </li><li> Para cualquier muestra de prueba de la etapa 3.2.1 (excepto los inoculado en el paso 3.2.2) que tiene CPE en las 10 repeticiones después de 14 días de incubación (véase el paso 3.3), prepare diluciones 5-, 25- y 125-, y 625 veces de submuestra 3. Inocular 10 lava recipientes de ensayo de cultivo de células para cada serie de dilución utilizando un volumen de inóculo en cada recipiente de ensayo junto con un nuevo conjunto de la quantal total de virus cultivables controles del ensayo (materiales suplementarios sección S2.4). </li><li> Distribuir el inóculo sobre la superficie de las monocapas de células por la inclinación de los vasos de ida y vuelta. Incubar los recipientes de ensayo a temperatura ambiente durante 80-120 min en una plataforma oscilante mecánica en 1-5 oscilaciones / min o con balanceo de los vasos cada 15-20 minutos para permitir que cualquier virus presente para adsorber a las células. </li><li> Añadir medio de mantenimiento precalentado, y luego se incuban los recipientes de ensayo a 36,5 ± 1 ° C. </li></ol></li><li> Buscar la aparición de CPE en cada recipiente de ensayo utilizando un microscopio al día durante los primeros 3 d y luego examinarlas cada 2-3 días hasta el día 14. Transferencia ningún recipientes de ensayo que muestran ≥75% de CPE a un congelador fijado en opor debajo de -70 ° C. Congelar todas las culturas restantes y el total de los controles de análisis de virus cultivables cuánticos igual o inferior a -70 ° C después de examinar los vasos en el último día. </li><li> Descongelar todas las culturas y filtrar ≥15% de la media de cada recipiente de ensayo CPE-positivo a través de un filtro de esterilización de 0,2 micras. Si el volumen especificado no se puede pasar a través del filtro debido a la obstrucción, se centrifuga el medio durante 10 minutos a 1,500-18,000 xg y 4 ° C antes de la filtración. </li><li> Realizar un segundo paso de los 1 st recipientes de ensayo pasaje utilizando recipientes de ensayo BGM lavadas. <ol><li> Inocular los nuevos recipientes de ensayo con un volumen de inoculación que representa el 10% del medio descongelado de todos los recipientes de ensayo y negativos del medio filtrado de los vasos positivos. </li><li> Repita los pasos 3.2.4-3.4.3, pero congelar cualquier recipiente de ensayo que fue negativo en el paso 1 st y positivo en el 2º como se describe en el paso 3.3. Realizar un pase 3ªedad tal como se describe para el paso 2 nd utilizando sólo los controles de ensayo negativos y cultivos celulares que fueron negativos durante el paso 1 st y positivo en el paso 2 nd. </li></ol></li><li> Identificar los recipientes de ensayo individuales como el virus positivo cuando muestran CPE tanto en el 1 ° y 2 pasajes nd o, en el caso en que el CPE no se produce hasta el paso 2º, tanto en los pasajes 2 ª y 3 ª. </li><li> Utilice la calculadora de número más probable de la EPA con los ajustes por defecto del programa establecidos como se muestra en la Tabla S2 para calcular los títulos de virus de todas las muestras de ensayo. <ol><li> Introducir el número de virus positivos vasos de ensayo en paralelo desde el paso 3.6 para cada muestra de ensayo en la calculadora para determinar el valor NMP / ml (M ml) y la superior (CL UML) y el 95% límites de confianza / valores ml más bajos (CL LML) . </li><li> Obtain el valor NMP / L (M L) de la muestra de ensayo correspondiente usando la ecuación 2. <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> Ecuación 2 M ml es el valor / ml NMP en el paso 3.7, S es el volumen de la muestra de ensayo, y D es el volumen de la muestra original de agua ensayada. </li><li> Calcular el límite de confianza superior / L sustituyendo el valor CL UML para el valor M ml. Calcular la menor confianza límite / L sustituyendo el valor CL LML para el valor M mL. Un ejemplo de cálculo se muestra en la sección materiales suplementarios S4.2. </li><li> Informe valores M mL de 0 como ≤ 1 / D. Por ejemplo, ≤ 0,002 NMP / L (≤ 1/500 L) para las muestras de agua subterránea. </li><li> Calcular los valores de límite de confianza del MPN y el 95% para cada laboratorio fortificada en blanco y Re Labagente en blanco multiplicando primero los valores / ml obtenidos en la calculadora S y dividiendo el resultado por 0,3. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li>
<li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li>
<li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlass%2C+RI+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+surveillance--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Surveill.+Summ%22%5BJournal%5D)">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li>
<li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+infections%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Pediatr.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li>
<li>Abzug, M. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbzug%2C+MJ+%22Hot+Topics+in+Infection+and+Immunity+in+Children%22">Hot Topics in Infection and Immunity in Children</a>. Finn, A., Pollard, A. J. , Springer. (2008).</li>
<li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths+from+norovirus+among+the+elderly%2C+England+and+Wales%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li>
<li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+J.+Med%22%5BJournal%5D)">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li>
<li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+murine+norovirus%2C+feline+calicivirus%2C+poliovirus%2C+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li>
<li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li>
<li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus%2C+Coxsackievirus%2C+Echovirus%2C+and+Murine+Norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li>
<li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W. 3rd, Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , U.S. Environmental Protection Agency, I. (1996).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li>
<li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+S+%22Information+Collection+Rule+Data+Analysis%22">Information Collection Rule Data Analysis</a>. McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).</li>
<li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+RJ+%22Microbial+monitoring+of+vulnerable+public+groundwater+supplies%22">Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies</a>. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).</li>
<li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee%2C+wisconsin%2C+collected+august+1994%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Método USEPA 1615 fue desarrollado para su uso durante el tercer ciclo de monitorización del Reglamento los contaminantes no regulados (UCMR3) 17 y diseñado fundamentalmente para medir la ocurrencia del virus en el agua subterránea. Se comparte una serie de pasos comunes con el método de información de regla de colección (ICR), 15,18 pero tiene dos diferencias menores. Tanto el uso de ensayos para medir cuánticos virus que producen CPE sobre monocapas de células BGM con cuantificación de ser en base a mayoría de los cálculos del número más probable (NMP). Método 1615 permite el uso de un filtro de electropositivo más reciente para la concentración de virus a partir de varias matrices de agua y reduce el número de recipiente de ensayo de cultivo de células réplicas por dilución de 20 a 10. Tanto los cambios de menor importancia reducir los costos generales del método. La reducción en el número de repeticiones reduce la mano de obra, pero da lugar a un límite de detección ligeramente inferior. Aunque se espera que las aguas subterráneas a tener menores concentraciones de virus que las aguas superficiales, 19,20 ºe cantidad de muestra ensayada es cinco veces mayor que la de las aguas superficiales, compensando en parte las diferencias. El uso de un menor número de repeticiones será adecuado para la mayoría de las aguas de superficie, pero algunos requieren dilución de la muestra. Método 1615 tiene varios pasos críticos y limitaciones. extractos de carne de res varían de lote a lote. Cada lote debe ser probado para la eficacia de la elución del virus y la capacidad de concentración del virus a través de las etapas de concentración secundaria es como se describe materiales suplementarios sección S2.3. El método utiliza fórmulas precisas para el cálculo de la cantidad de muestra para inocular en cultivos celulares de música ambiental y determinar los títulos de virus. Los resultados inexactos se generarán si estas fórmulas no se siguen rigurosamente. una técnica aséptica apropiada debe ser utilizado para el mantenimiento de cultivos de células. No infectadas control de cultivos celulares de música ambiental que muestran angustia durante el período de incubación de 14 días probable que indican problemas con el mantenimiento del cultivo celular. El gran cuidado debe ser también taken durante el pipeteo pasos a seguir para la inoculación del medio y adición a matraces de cultivo de células para evitar la contaminación cruzada. Los controles de calidad que se describen en la Sección S2 suplementaria materiales deben seguirse rigurosamente. Sección S2 también proporciona consejos para la solución de problemas problemas de calidad. El principal mecanismo de la adsorción del virus a electropositivo filtros es una interacción de carga relacionada con la fuerza de la carga positiva en el filtro y la fuerza de carga negativa del virus relacionado con su punto isoeléctrico y el pH del agua que se está probando 21. La elución de los filtros también se ve afectada por la fuerza de estas interacciones. Debido a que varían entre los tipos de virus, e incluso entre las cepas dentro del mismo tipo, la elución de los filtros no es uniforme. Esto significa que cualquier resultado puede subestimar el nivel real de virus presente en las aguas ambientales. El uso de la línea celular BGM única también subestima la aparición de virus. El rangode virus entérico que puede producir CPE en esta línea celular principalmente está limitada a los poliovirus y serotipos especies Enterovirus B, así como algunos reovirus 14,15,22. No se detectaron otros tipos de virus infeccioso. Recuperaciones de poliovirus de las aguas subterráneas y de grado reactivo cumplan las 1615 criterios de aceptación de rendimiento método USEPA tanto para la Evaluación del Desempeño (PE; es decir, las muestras de agua sin semillas de grado reactivo con títulos desconocidos a un analista que se utilizan para evaluar el desempeño del analista antes del inicio de un estudio) y muestras (LFB materiales suplementarios Tabla S1). La recuperación del 58% de las aguas subterráneas mediante el procedimiento de cultivo es similar a la reportada por otros que usan el agua del grifo 23,24. La recuperación media de las muestras de la LFB 111% con un coeficiente de variación (CV) de 100% también se reunió con los criterios de aceptación de rendimiento del método a pesar de ser mayor que la observada para las muestras de PE during del ICR. ICR recuperación media entre laboratorios era 56% con un coeficiente de variación (CV) de 92%, mientras que las recuperaciones medias intralaboratorio variaron desde 36 hasta 85% (CV 58 a 131%; datos no publicados de la base de datos ICR PE). Se observaron mayores recuperaciones en este estudio para la baja de semillas muestras LFB que para las muestras de semillas más altas (122 frente a 42%). En el momento en que el ICR se estaba planeando, se esperaba que las muestras de PE que reciben valores bajos de semillas tendrían la recuperación de un menor que aquellos que recibieron semillas de alto. Similar a la observada aquí por las muestras de la LFB, la recuperación de poliovirus para muestras ICR PE eran 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), y el 44% (CV 71%) para los valores de semilla ≤300 MPN, 300- 1.500 RPM, y&gt; 1.500 RPM, respectivamente. Hay muchos métodos para la medición de virus infeccioso en muestras de agua 25. Este método es significativa con respecto a otros métodos en el grado de estandarización. La normalización no sólo incluye los controles de calidad y rendimiento,pero también utiliza volúmenes y fórmulas definidas para garantizar que todos los laboratorios analíticos realizar el método de forma idéntica. Sin la normalización, es difícil comparar los resultados entre laboratorios, y por lo tanto la normalización es esencial cuando se realizan estudios a gran escala en varios laboratorios de análisis. Con la estandarización incorporado en este método podría ampliarse en el futuro para incluir tipos adicionales del virus y líneas celulares. La investigación está en marcha para proporcionar datos para la inclusión de adenovirus en el método.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Los virus entéricos son un grupo diverso de virus que infectan el sistema intestinal humano y que se transmiten a través de la vía fecal-oral. Estos virus entran en las aguas superficiales y subterráneas a través de la planta de tratamiento de aguas residuales y efluentes de fosas sépticas, pozos sépticos incorrectamente diseñados o rotas, líneas de alcantarillado rotos, derrames de aguas negras combinadas, y otras fuentes puntuales y no puntuales 1-4. Las infecciones humanas y las enfermedades transmitidas por el agua de los virus se producen a través del consumo de agua contaminada o no adecuadamente desinfectada o por contacto de las aguas recreativas. síntomas de la enfermedad pueden implicar leve a severa; gastroenteritis conjuntivitis; fiebre; distrés respiratorio superior; la mano, la fiebre aftosa; miocarditis; meningitis aséptica; encefalitis; parálisis; sepsis 5-8, y la muerte 9,10. Método USEPA 1615 proporciona un procedimiento para medir partículas de virus entéricos infecciosas en aguas ambientales y de agua potable. Estas aguas pueden contener unamezcla de viriones infecciosos y no infecciosos, pero sólo las partículas infecciosas representan un peligro potencial para la salud. Partículas de virus infecciosas pierden infectividad con el tiempo en las aguas ambientales y beber de pérdida de la integridad de la cápside de proteínas, daños a los ácidos nucleicos debido a la radiación UV de la luz solar, y el daño debido a desinfectantes que pueden estar presentes 11 a 13. El procedimiento de virus cultivables total proporcionada en el método se basa en la producción de efectos citopáticos (CPE) en la línea celular de riñón de mono verde de Buffalo (BGM). Esta línea celular fue elegido debido a su amplio uso en el campo de la virología ambiental 14,15, a pesar de que la gama de tipos de virus infecciosos detectados se limita principalmente a ciertos enterovirus 15. El propósito de este trabajo es describir los procedimientos del Método 1615 para la elución de los filtros de cartucho electropositivo de cinco pulgadas, la concentración secundaria, y la medición de los virus cultivables totales. Una evaluación de lamétodo global se describe en Cashdollar et al. 16.

<table><tbody><tr><td>Extracto de carne de vacuno, polvo desecado</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Tubos criogénicos</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solución salina equilibrada</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma mecedora mecánica</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>Filtro esterilizante con prefiltro</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa esterilizante</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Estándares</td> <td>de pHSigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 o M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio, 7.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

método epa 1615. la medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y rt-qpcr. ii. ensayo virus culturable total

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Se requiere un método estandarizado cuando los estudios nacionales sobre la presencia de virus en aguas ambientales y potables utilizan múltiples laboratorios analíticos. El Método 1615 de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA, por sus siglas en inglés) se desarrolló con el objetivo de proporcionar un estándar para medir el enterovirus y el norovirus en estas aguas. El virus se concentra a partir del agua utilizando un filtro electropositivo, se eluye de la superficie del filtro con extracto de carne de vacuno y luego se concentra aún más mediante floculación orgánica. En este trabajo se presenta el protocolo del Método 1615 para la elución del filtro, la concentración secundaria y la medición del total de virus cultivables. Una porción del eluido concentrado de cada muestra se inicula en diez frascos replicados de células de riñón de Buffalo Green Monkey. El número de matraces que muestran efectos citopáticos se utiliza para cuantificar el número más probable (NMP) de unidades infecciosas por litro. El método utiliza una serie de controles de calidad para aumentar la calidad de los datos y reducir la variación entre laboratorios e intralaboratorios. Los laboratorios deben cumplir con estándares de desempeño definidos. El método 1615 se evaluó examinando la recuperación del virus de aguas subterráneas y de grado reactivo sembradas con el poliovirus Sabin tipo 3. Las recuperaciones medias de poliovirus con el ensayo total cultivable fueron del 111% en agua de grado reactivo y del 58% en aguas subterráneas.

El virus se concentra a partir de la fuente de agua subterránea tres plantas de tratamiento de agua potable y una privada, así que utilizan filtros electropositivos. Dos conjuntos de la muestra, que consta de una muestra de campo y control LFSM, se recogieron de las plantas de tratamiento en ocasiones separadas, y un conjunto de muestras se recogieron desde el pozo privado. La recuperación total del virus se determinó utilizando muestras LFSM de dos de las plantas y el pozo privado (dos muestras de una planta y una muestra de otro fueron excluidos del cálculo porque el valor de la MPN de la semilla utilizada con cada muestra no se pudo determinar con precisión debido a los resultados de CPE anormales entre matraces replicados). La media de recuperación de poliovirus a partir de muestras de aguas subterráneas promedio de 58% con un coeficiente de variación del 79% (Figura 2) 16. No virus cultivables se detectó en ninguna de las muestras de campo de aguas subterráneas cabeza de serie duplicados. el funcionamiento del método también se midió utilizando LFB sejemplos modificados mediante el uso de dos niveles de semillas diferentes. Se utilizó un título de &quot;baja&quot; de 300 NMP de poliovirus para evaluar el rendimiento en niveles inferiores al nivel 500 &quot;estándar&quot; NPF LFB utilizado en el método USEPA 1615. Un &quot;alto&quot; título de 1,000 NMP de poliovirus se utilizó para probar el rendimiento en el nivel del control LFSM. Estos controles a cabo de manera similar con una recuperación media del 111% y un coeficiente de variación de 100% (Figura 2). Todas las muestras fueron negativas LRB y todas las muestras LFB realizan dentro del rango de aceptación (material complementario el cuadro S1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> Se muestra la Figura 1. La elución de filtro. Un esquema para el uso de un recipiente a presión para la elución filtro de cartucho. presión de aire positiva se utiliza para empujar solución de extracto de carne en el recipiente de presión a través del con alojamiento de cartuchocontiene el filtro de cartucho electropositivo. Una bomba peristáltica puede ser sustituido por el recipiente de presión, con la entrada de la bomba se coloca en el recipiente que contiene la solución de extracto de carne de vacuno. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Figura 2. Media Poliovirus Recuperación (%) del suelo y el agua de grado reactivo. La recuperación media por ciento se muestra para el poliovirus de suelo ( <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) y de grado reactivo agua ( <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) muestras. Las doce muestras de agua de grado reactivo incluyen seis sembró con 300 MPN y se sembró con seis 1,000 NMP de poliovirus. Las barras de error representan el error estándar.

Aquí presentamos un procedimiento para medir el total de virus cultivables utilizando la línea celular de riñón Buffalo Green Monkey. El procedimiento proporciona una herramienta estandarizada para medir la presencia de virus infecciosos en aguas ambientales y potables.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y RT-qPCR. II. Ensayo Virus Culturable total

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

El objetivo general del siguiente protocolo es medir el nivel de partículas virales infecciosas en una muestra de agua. Esto se logra utilizando una solución extractora basada en álcali para eluir partículas virales con carga negativa de un filtro electro-positivo que ha sido concentrado con virus proveniente de agua potable o ambiental. La recogida de virus en un filtro cartucho electro-positivo se aborda en la Primera Parte de esta serie.Como segundo paso, se reduce lentamente el pH del eluido, lo que provoca la formación de un coprecipitado de estas proteínas extraídas y del virus presente en la muestra. Luego, el coprecipitado se recoge mediante centrifugación, se disuelve en un tampón de fosfato de sodio y se filtra para esterilizarlo y eliminar bacterias y moho. A continuación, el eluido concentrado final se inocula en células renales de mono verde de Buffalo, y se observan las células durante 14 días en busca de efecto citopático, o CPE, con el fin de detectar la replicación viral.Para liberar cualquier partícula viral asociada a células, todos los frascos con células se congelan al final de los 14 días, o cuando el efecto citopático (CPE) en cualquier frasco sea del 75 % o mayor. Después de un segundo y tercer pase para confirmar que el CPE se debe a la replicación viral, se utiliza un programa calculador del número más probable, o MPN, para determinar el número más probable por litro de cada muestra analizada. En última instancia, el componente ácido viral culturable total del Método EPA 1615 proporciona una medida del nivel de partículas virales infecciosas en la muestra de agua.Este ensayo total de virus es solo un componente del Método 1615 de la EPA. El método completo mide la presencia de enterovirus y norovirus en aguas potables y ambientales. Cualquier hallazgo de virus puede utilizarse entonces como dato de entrada para medir el riesgo derivado de la exposición a estos virus en el agua potable y recreacional.La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un enfoque estandarizado único para medir virus en el agua. Este enfoque se basa en realidad en el método de la Norma de Recolección de Información publicado en 1996. El principal problema que tienen las personas nuevas con este método es mantener la línea celular BGM libre de contaminación e interpretar los EPC, o efectos citopáticos.Shay Fout y yo demostraremos los procedimientos de elución y floculación orgánica, seguidos de la técnica de cultivo celular. Para realizar la primera elución, coloque 500 mililitros de extracto de carne tamponado al 1,5% a temperatura ambiente, pH 9,0, en un cilindro graduado. Luego, abra el alojamiento del cartucho del filtro y agregue una cantidad suficiente de extracto de carne para cubrir completamente el filtro electropositivo.Coloque el resto del extracto de carne en un vaso de precipitados. Vuelva a colocar la tapa del alojamiento del filtro. Después de un minuto de tiempo de contacto, utilice una bomba peristáltica y tubos estériles para pasar lentamente la solución de extracto de carne del alojamiento, junto con la que queda en el vaso de precipitados, a través del filtro.Recolecte el eluyente en un vaso de precipitados de vidrio estéril de 2 litros. Repita estos pasos con 500 mililitros adicionales de extracto de carne tamponado al 1,5 %, excepto utilizando un tiempo de contacto de 15 minutos. Añada el extracto de carne de la segunda elución al vaso de precipitados de 2 litros que contiene el de la primera elución y agregue una barra de agitación estéril al vaso.Coloque el vaso de precipitados que contiene el eluato sobre una placa agitadora. Encienda la placa y aumente la velocidad de agitación hasta formar un vórtice. Ajuste lentamente el pH del eluato a 3,5 más o menos 0,1 mediante la adición gota a gota de ácido clorhídrico 1,2 molar, o HCL.Añada el ácido gota a gota, ya que una adición rápida inactivará el virus. Durante este tiempo, el eluido se volverá turbio, ya que comenzará a formarse un precipitado. Reduzca la velocidad de mezcla a una agitación lenta y continúe monitoreando y manteniendo el pH del eluido en 3,5 ± 0,1 a temperatura ambiente durante 30 minutos.Luego, vierta la suspensión precipitada del extracto de carne en una o más botellas para centrífuga y centrifugue durante 15 minutos a 2.500 × g a cuatro grados Celsius. Retire las botellas de la centrífuga y deseche lentamente el sobrenadante con cuidado de no perder el precipitado sedimentado. El sobrenad游戏副本 puede descartarse.Para los lotes de extracto de carne que se disuelven en menos de 5 minutos, agregue 30 mililitros de fosfato de sodio 0,15 molar, pH 9,0, al frasco de centrífuga que contiene el precipitado. Consulte el protocolo escrito para obtener instrucciones sobre cómo disolver precipitados que no se disuelven en cinco minutos. Agite durante 10 minutos después de que el precipitado se haya disuelto completamente.A continuación, retire la barra de agitación e incube el precipitante disuelto en centrífuga durante 10 minutos a 4.000-10.000 ×g y 4 grados Celsius. Vierta cuidadosamente el sobrenadante en un vaso de precipitados de vidrio sin perturbar el sedimento. Añada una barra de agitación al vaso de precipitados y deseche el sedimento.Coloque el vaso de precipitados sobre un agitador magnético y agite la solución. Añada HCl 1,2 molar gota a gota para ajustar el pH entre 7,0 y 7,5. Filtre y esterilice el sobrenadante haciéndolo pasar a través de un filtro esterilizante que contenga un prefiltro previamente tratado con 15 mililitros de extracto de carne tamponado al 1,5%, pH 7,0 a 7,5.Consulte el protocolo escrito para calcular el Volumen de Muestra del Ensayo, o S, para todas las muestras de prueba. Luego, calcule el Volumen de Inóculo dividiendo la S entre 10. Con base en estos cálculos, divida el volumen final concentrado de la muestra, que es la muestra obtenida tras la esterilización por filtración, en tres submuestras, como se describe en el protocolo escrito.Inocule 10 recipientes de ensayo que contienen una monocapa de células BGM para cada muestra de prueba, con el volumen del submuestra uno, igual al volumen de inóculo, junto con los controles del ensayo cuantitativo de virus cultivables. Para el blanco aforado en el laboratorio y la matriz de muestra aforada en el laboratorio, prepare diluciones de 5, 25 y 125 veces utilizando el submuestra tres y fosfato de sodio 0,15 molar, pH 7,0 a 7,5, como diluyente. Además de los recipientes inoculados con el submuestra uno sin diluir, inocule 10 recipientes de cultivo celular lavados para cada serie de diluciones, utilizando un volumen de inóculo en cada recipiente de ensayo.Distribuya el inóculo sobre la superficie de las monocapas celulares inclinando los recipientes hacia adelante y hacia atrás. Incube los recipientes de prueba a temperatura ambiente durante 80-120 minutos en una plataforma mecánica balanceante con una frecuencia de una a cinco oscilaciones por minuto, o agitando los recipientes cada 15 a 20 minutos para permitir que cualquier virus presente se adhiera a las células. Luego, añada medio de mantenimiento previamente calentado a los recipientes de prueba antes de incubarlos a 36,5 ± 1 °C.Busque la aparición de efectos citopáticos en cada recipiente de prueba utilizando un microscopio durante los primeros tres días, y luego examínelos cada dos o tres días hasta el día 14. Transfiera cualquier recipiente de prueba que muestre más del 75 % de efectos citopáticos a un congelador ajustado a menos 70 grados Celsius o inferior. Después de examinar los recipientes en el último día, congele todas las culturas restantes y los controles del ensayo cuantitativo de virus culturable a menos 70 grados Celsius o inferior.Luego, descongele todas las culturas y filtre más del 15 % del medio de cada recipiente de ensayo positivo para CPE mediante un filtro esterilizante de 0,2 micrones. El siguiente paso consiste en realizar un segundo pase de todos los recipientes de ensayo del primer pase, utilizando recipientes de células renales BGM lavados. Para ello, inocule los nuevos recipientes de ensayo con un volumen de inóculo que represente el 10 % del medio descongelado procedente de todos los recipientes negativos, así como del medio filtrado de los recipientes positivos.Repita los pasos realizados para el primer pase, congelando cualquier recipiente de ensayo que fue negativo en el primer pase y positivo en el segundo. Luego, realice un tercer pase como se describió para el segundo pase, utilizando únicamente los controles negativos del ensayo y los cultivos celulares que fueron negativos durante el primer pase y positivos en el segundo pase. Identifique los recipientes de ensayo individuales como positivos para el virus cuando presenten efectos citopáticos tanto en el primer como en el segundo pase, o, en el caso en que el efecto citopático no ocurra hasta el segundo pase, tanto en el segundo como en el tercer pase.Utilice la Calculadora del Número Más Probable de la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. con la configuración predeterminada del programa establecida según se indica en el protocolo del texto, para calcular las titulaciones virales de todas las muestras de prueba. Luego, utilice los valores obtenidos para el Número Más Probable de unidades infecciosas por mililitro, junto con los límites de confianza superior e inferior por mililitro, para calcular el Número Más Probable de unidades infecciosas por litro y los límites de confianza correspondientes, como se describe en el protocolo del texto. Se muestra el porcentaje medio de recuperación para el poliovirus a partir de muestras de agua subterránea y de grado reactivo.La recuperación media del virus de la poliomielitis a partir de muestras de agua subterránea fue en promedio del 58 %, con un coeficiente de variación del 79 %. No se detectó ningún virus cultivable en ninguna de las muestras de campo duplicadas de agua subterránea no inoculadas. El rendimiento del método también se evaluó utilizando muestras de blanco fortificadas en laboratorio, modificadas mediante el uso de dos niveles diferentes de inóculo. Las doce muestras de agua grado reactivo incluyeron seis inoculadas con 300 NMP de unidades infecciosas y seis inoculadas con 1 000 NMP de unidades infecciosas de poliovirus.Estos controles mostraron un comportamiento similar, con una recuperación media del 111 % y un coeficiente de variación del 100 %. Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar técnicas asépticas y buenas prácticas de laboratorio para prevenir la contaminación de las muestras. También es importante recordar que al trabajar con patógenos virales, se deben tomar precauciones como el uso de guantes cada vez que se realice este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo diluir virus, utilizar filtros electropositivos y realizar ensayos de floculación orgánica y de cultivo celular.Además de este procedimiento, también puede realizar ensayos moleculares para identificar y detectar otros tipos de virus.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

El Método EPA 1615 utiliza un filtro electropositivo para concentrar enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables. Este manuscrito describe el procedimiento para recolectar muestras para los análisis del Método 1615.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus

Aquí presentamos un procedimiento para cuantificar enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables utilizando PCR cuantitativa con transcripción inversa. La recuperación media del virus de las aguas subterráneas con este procedimiento estandarizado del Método 1615 de la EPA fue del 20% para el poliovirus y del 30% para el norovirus murino.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. Parte III. Detección de virus por RT-qPCR

Se desarrolló y evaluó una metodología de muestreo basada en macroespuma para la detección y cuantificación de norovirus en superficies duras ambientales.

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

Se desarrolló un enfoque para identificar las condiciones óptimas de concentración viral para muestras de agua de pequeño volumen utilizando picos de adenovirus humano. Las técnicas descritas aquí se utilizan para identificar parámetros de concentración para otros objetivos virales y se aplican a la experimentación de concentración viral a gran escala.

Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua

Este manuscrito describe un ensayo de teléfono digital de dos PCR que se puede utilizar para cuantificar simultáneamente Enterococcus spp. Y los marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminación fecal general y asociada a humanos en aguas de recreo.

Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

Presentamos el VacuSIP, un método simple, no intrusivo y confiable para el muestreo puntual limpio y preciso de agua. El sistema fue desarrollado y evaluado para la recolección simultánea del agua inhalada y exhalada por alimentadores de suspensión bentónica in situ, para medir limpiamente la remoción y excreción de partículas y compuestos disueltos.

VacuSIP, un método mejorado para InEx<em&gt; In Situ</em&gt; Medición de las partículas y compuestos disueltos procesada por Alimentadores Active Suspension

Este papel divulga el protocolo para un ensayo de identificación rápida para Bemisia tabaci basado en tecnología de amplificación isotérmica mediada lazo (lámpara). El protocolo requiere laboratorio mínimo entrenamiento y puede, por tanto, aplicarse in situ en los puntos de entrada para las importaciones de planta como los puertos marítimos y aeropuertos.

Un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de Bemisia tabaci

Este protocolo diagnóstico de Virus de lago de Tilapia (TiLV) en tejidos de tilapia utilizando metodologías de RT-PCR. El método completo se describe de la disección del tejido para extracción de RNA total, seguida de la síntesis de cDNA y detección de TiLV por PCR convencional o PCR cuantitativa utilizando dsDNA vinculante un tinte fluorescente vinculante.

Detección de Tilapia lago Virus usando RT-PCR convencional y SYBR Green RT-qPCR

Se describe un diseño de microplot para la investigación de trazador de 15N para dar cabida a múltiples eventos de muestreo de plantas y suelos en temporada. Se presentan procedimientos de recolección y procesamiento de muestras de suelos y plantas, incluidos los protocolos de molienda y pesaje, para análisis de 15N.

Diseño de microparplots y preparación de muestras de plantas y suelos para 15 análisisde nitrógeno

Aprende a medir virus infecciosos en agua mediante el método EPA 1615 usando células renales de mono Buffalo Green. Esta técnica estandarizada permite cuantificar partículas virales y evaluar riesgos para la salud pública.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y RT-qPCR. II. Ensayo Virus Culturable total (Video) | JoVE Journal

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y RT-qPCR. II. Ensayo Virus Culturable total

Explorar más videos