La detección de biomarcadores exosomal por inducida por campo eléctrico de lanzamiento y Medición (Efirm)
23 de enero de 2015
Los exosomas son estructuras microvesiculares que se encuentran dentro de los biofluidos y que potencialmente portan importantes biomarcadores discriminatorios de enfermedades. Aquí, se utiliza un método novedoso para extraer específicamente exosomas y probar rápidamente la carga exosomal para ambos objetivos de ARN/proteína después de la interrupción de los exosomas utilizando ondas cuadradas cíclicas eléctricas no uniformes.
El objetivo general de este procedimiento es extraer eficazmente exosomas de biofluidos, liberar el contenido de los exosomas y analizar rápidamente dicho contenido. Esto se logra primero extrayendo exosomas de biofluidos mediante micropartículas magnéticas con anticuerpos que reconocen marcadores de exosomas, y luego cargando los exosomas extraídos sobre una superficie de electrodo. A continuación, se lisan los exosomas mediante un campo eléctrico y el contenido de los exosomas se hibrida con sondas ubicadas en la superficie del electrodo.
Una molécula marcadora también se hibrida al sistema. El paso final consiste en agregar una solución de sustrato a la superficie del electrodo y luego obtener la lectura midiendo la corriente eléctrica. En última instancia, la medición electroquímica de la corriente se utiliza para determinar la cantidad de ácido nucleico o contenido proteico en la muestra de exosomas.
La principal ventaja de esta tecnología frente al método existente, como la ultracentrifugación y el tampón de lisina, es que se trata de un método sencillo y rápido para extraer y analizar el contenido de exosomas. Estamos muy entusiasmados con esta tecnología porque, por primera vez, la tecnología efim nos permite aprovechar la información que los órganos liberan en estado de enfermedad o de normalidad, y que es transportada por el órgano de origen a través de la circulación vascular hasta llegar a nuestra cavidad oral. Esta tecnología nos permite capturar dicha información y liberar el contenido molecular que podemos detectar simultáneamente de forma flexible.
Esta información discriminativa de la enfermedad; por lo general, los usuarios nuevos en este método pueden tener dificultades porque el uso de micropartículas magnéticas puede ser complicado si no se tiene cuidado. Además, el uso de métodos electroquímicos en el análisis de muestras biológicas puede representar un paradigma novedoso para algunos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que las micropartículas magnéticas y la carga electroquímica son difíciles de aprender. Se debe tener especial cuidado al manipular las micropartículas magnéticas y cargarlas sobre los electrodos.
Para comenzar la resuspensión, prepare una solución stock que contenga 10 microgramos por mililitro de micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina y agregue cinco microlitros de esta solución a un tubo de microcentrífuga que contenga 495 microlitros de PBS para lavar las perlas. Primero, coloque el tubo en un soporte magnético durante un minuto y retire cuidadosamente el tampón sin perturbar las perlas.
Luego, transfiera el tubo a una gradilla no magnética. Añada 500 microlitros de PBS y agite suavemente para lavar las perlas. Repita este procedimiento un total de tres veces y, tras el lavado final, reutilice las perlas.
Suspenda las perlas en 490 microlitros de PBS y luego agregue cinco microlitros de anticuerpo Biotinilado de ratón anti-CD63 humano proveniente de una solución stock de un miligramo por mililitro. Mezcle la solución pipeteando y programe un rotador de muestras para rotación recíproca a 90 grados durante cinco segundos y vibración a cinco grados durante un segundo. Coloque los tubos en el rotador y ejecute el programa durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, transfiera los tubos al soporte magnético durante cinco minutos. Lave las perlas tres veces con 500 microlitros de PBS y luego resuspenda las perlas en 490 microlitros de PBS que contenga Caine. Etiquete un tubo con la identificación de la muestra y luego agregue 10 microlitros de la muestra, pipeteando varias veces para mezclar la muestra con las perlas conjugadas con el anticuerpo.
A continuación, transfiera los tubos al rotador de muestras y ejecute el mismo programa durante dos horas a temperatura ambiente. Luego, lave las perlas tres veces con 500 microlitros de un tampón de tris clorhidrato uno molar. Utilizando el soporte magnetizado, los exosomas ahora están unidos a las perlas magnetizadas para precargar el electrodo.
Primero, diluya los reactivos patrón de la sonda, cloruro de potasio y el monómero ole en agua destilada. La sonda de ADN biotinilada en el extremo 5' es específica para el ARNm de GA DH. Mezcle la solución de la sonda monómera mediante vortex.
Utilice una matriz de electrodos de 16 sensores en la que cada electrodo individual conste de electrodos de trabajo, contrarreferencia y referencia compuestos de oro desnudo. Coloque un pocillo de plástico sobre la matriz de electrodos para evitar la contaminación cruzada de los electrodos. Transfiera 60 microlitros de la solución de sonda del monómero a la superficie de un electrodo de oro de manera que los electrodos de trabajo, contrarreferencia y referencia queden cubiertos por el líquido.
Aplique un perfil de campo eléctrico cuadrado cíclico conocido como campo A-C-S-W-E para electro polimerizar una sonda monómera. Esto crea una capa de polímero conductor sobre la superficie del electrodo. Enjuague el sensor tres veces con agua destilada y luego séquelo con gas nitrógeno para eliminar el líquido de la superficie del electrodo.
Después de preincubar el electrodo con la sonda de captura, agregue cinco microlitros de una solución de un micromolar de la sonda detectora a 495 microlitros de la solución compleja de exosomas con perlas, y luego mezcle mediante pipeteo. Aquí, la sonda es un cebador de ADN conjugado con fluoresceína en el extremo tres prima, específico para GA dh. Coloque una matriz de electrodos pre-codificados sobre una matriz de imanes compuesta por 16 imanes alineados con los electrodos de trabajo del sensor.
Luego, transfiera 60 microlitros de la solución de exosomas con perlas a la superficie del electrodo. Aplique el campo A-C-S-W-E durante 20 ciclos. La carga exosomal liberada se hibridará con la sonda en la superficie del electrodo.
Lave la superficie del electrodo tres veces con agua destilada para eliminar cualquier analito no unido, y luego seque el electrodo con gas nitrógeno. A continuación, prepare una dilución de uno a 1000 de anticuerpo conjugado con HRP antifluoresceína en PBS que contenga Caine. Luego, agregue 60 microlitros de la dilución de anticuerpo a la superficie del electrodo.
Aplique el campo A-C-S-W-E sobre la superficie del electrodo para conjugar el anticuerpo anti-fluoresceína HRP con la sonda detectora. Enjuague la superficie del sensor tres veces con agua destilada para eliminar el anticuerpo en exceso y luego seque el electrodo con gas nitrógeno. A continuación, cargue 60 microlitros de sustrato TMB sobre cada superficie sensora mediante una pipeta multicanal y utilice un potenciostato para medir la corriente del electrodo a -200 milivoltios durante 60 segundos.
Para obtener la lectura tric, se utilizó microscopía electrónica de transmisión para determinar si los exosomas estaban unidos a las perlas magnéticas. Los gránulos de tamaño entre 70 y 100 nanómetros adheridos a las perlas son consistentes con el tamaño conocido de los exosomas tras la lisis provocada por el campo eléctrico o el detergente. No se observan exosomas cerca de las perlas.
El ARNm de GA DH en exosomas se detectó mediante lectura atric. La cantidad de GA DH presente disminuye con el tiempo, tal como se esperaba tras la lisis de los exosomas por medio del campo eléctrico o del detergente, lo que indica exposición al entorno extravescicular de la saliva. Se utilizó Efim para medir el contenido exosómico del suero y de la saliva de ratones que recibieron inyecciones de células humanas de cáncer de pulmón que producían un marcador exosómico humano CD 63 GFP.
Después de 20 días, se encontraron niveles más altos de CD63 GFP tanto en el suero como en la saliva de los ratones inyectados con las células cancerosas, pero no en los ratones inyectados con solución salina. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se debe evitar tocar las perlas para extraer una cantidad adecuada de líquido durante el lavado de las perlas, lavar uniformemente la superficie del electrodo y cargar correctamente las regiones del electrodo. Esta tecnología, esta tecnología efim, proporcionó la capacidad crítica y no satisfecha de cómo una enfermedad sistémica, un órgano distal, puede liberar su información y calcularla en esta entidad llamada exosomas.
Cómo llegan a la saliva, a nuestra cavidad oral, y cómo es posible capturar los exosomas, liberar estos blancos moleculares y permitir su detección simultánea en enfermedades potencialmente graves, como la diabetes, el cáncer de páncreas u otros trastornos amenazantes para la vida. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo extraer rápidamente exosomas de un fluido biológico, cómo liberar la carga de los exosomas y cómo analizar rápidamente el contenido de los exosomas mediante un sistema integrado de electrodos.
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Resumen
Este estudio presenta un método novedoso para la extracción y análisis eficientes de exosomas a partir de biofluidos. Al utilizar micropartículas magnéticas y un campo eléctrico, se puede analizar rápidamente la carga exosómica en cuanto a su contenido de ARN y proteínas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Descubrimiento de biomarcadores
- Análisis electroquímico
Antecedentes
- Los exosomas son estructuras microvesiculares que transportan biomarcadores potenciales para enfermedades.
- Los métodos actuales para la extracción y análisis de exosomas pueden ser ineficaces.
- Se necesitan técnicas mejoradas para la detección rápida y precisa de biomarcadores.
- Este estudio explora un método que utiliza campos eléctricos para lisar exosomas y analizar su contenido.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la extracción eficiente de exosomas a partir de biofluidos.
- Permitir el análisis rápido de la carga de ARN y proteínas exosomales.
- Mostrar el uso de mediciones electroquímicas para cuantificar el contenido exosomal.
Métodos Utilizados
- Extracción de exosomas utilizando micropartículas magnéticas con anticuerpos de reconocimiento.
- Carga de exosomas extraídos sobre la superficie de un electrodo.
- Lisis de exosomas mediante un campo eléctrico.
- Hibridación del contenido exosomal con sondas en la superficie del electrodo.
Resultados principales
- Extracción exitosa de exosomas a partir de biofluidos.
- Lisis eficaz de exosomas y liberación de su carga.
- Cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas mediante mediciones electroquímicas.
- Demuestra el potencial del método para el análisis de biomarcadores.
Conclusiones
- El método desarrollado permite la extracción y análisis eficientes de exosomas.
- Las técnicas electroquímicas proporcionan un medio rápido para cuantificar el contenido exosomal.
- Este enfoque podría mejorar el descubrimiento de biomarcadores para diversas enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
EFIRM permite la extracción y cuantificación rápida y sin marcado de biomarcadores exosomales a partir de biofluidos sin el uso de tampones de lisis, lo que favorece la detección temprana de enfermedades distales mediante muestreo no invasivo. El método proporciona lecturas electroquímicas de ARN y proteínas transportadas, ofreciendo una plataforma escalable para la validación de biomarcadores en flujos de trabajo de descubrimiento. Al capturar información liberada por órganos mediante exosomas en saliva y suero, EFIRM satisface la necesidad de enfoques de biopsia líquida mínimamente invasivos en la investigación oncológica y de enfermedades metabólicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la detección de biomarcadores específicos de enfermedades en ARN y proteínas exosomales en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas mediante la captura específica de exosomas a través de marcadores de superficie como CD63, reduciendo la dependencia de aislamientos basados en tamaño.
- Valor predictivo: Proporciona mediciones cuantitativas de carga útil que ayudan a priorizar biomarcadores y seleccionar carteras según su relevancia para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera señales electroquímicas estandarizadas y reproducibles proporcionales al contenido de exosomas, lo que permite un cribado fiable de compuestos.
- Escalabilidad: Utiliza una matriz de electrodos de 16 sensores para procesamiento paralelo, facilitando el análisis de biomarcadores de alto rendimiento.
- Reutilización de la plataforma: Permite la detección de objetivos de ARN y proteínas en el mismo sistema, aumentando la flexibilidad del ensayo entre diferentes clases de objetivos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Demuestra la detección de biomarcadores en suero y saliva, lo que apoya la validación cruzada entre fluidos en modelos de enfermedad.
- Relevancia para la Enfermedad: Muestra niveles elevados de GAPDH exosomal y CD63-GFP en modelos de cáncer de pulmón, vinculando la liberación de tumores distales con señales detectables en fluidos orales.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite el monitoreo longitudinal de los cambios en la carga exosomal, aportando información para decisiones de avance o interrupción en la progresión preclínica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
EFIRM se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando análisis cuantitativos de exosomas que orientan la selección temprana de biomarcadores y la preparación de ensayos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de exosomas mediante captura inmunomagnética y liberación de su carga para análisis molecular.
- Detección: Proporciona lecturas electroquímicas con linealidad demostrada (R=0.79), lo que permite comparaciones cuantitativas entre distintas condiciones de muestra.
- Análisis: Mide el contenido de ácidos nucleicos y proteínas mediante hibridación y lectura de corriente, aportando datos multiparamétricos para la evaluación de dianas.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al mostrar un aumento consistente de biomarcadores en suero y saliva de modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma electroquímica reutilizable para el análisis de exosomas aplicable en múltiples programas de biomarcadores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al permitir la medición directa de biomarcadores de ARN y proteínas exosomales sin artefactos de lisis.
- Valor Operacional: Ofrece un procedimiento rápido y sin tampón para la extracción y detección de exosomas, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor Estratégico: Mejora la eficiencia del capital al posibilitar muestreos no invasivos y la detección paralela de biomarcadores en saliva y suero.
- Impacto en el Portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante señales exosomales cuantificables y vinculadas a enfermedades en modelos preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de perlas magnéticas y en el montaje de ensayos electroquímicos para garantizar una captura consistente de exosomas y una carga adecuada del electrodo.
- Depende del acceso a un potenciostato, un rotador magnético y una matriz de electrodos de oro con 16 sensores para la adquisición de señales.
- Necesita la estandarización de la conjugación de anticuerpos y de los parámetros del campo eléctrico (AC-SWE) entre diferentes usuarios y tipos de muestras.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes biofluidos u orígenes de exosomas distintos a modelos murinos.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de manejar cuidadosamente las perlas para evitar pérdidas durante los pasos de lavado y la posible variabilidad de la señal debida a analitos no unidos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
2:34
Magnetic Bead-based Exosome Extraction
4:55
Precoating of the Electrode with a Specific Capture Probe
6:16
Electric Field-induced Release of Exosome Cargo
7:22
Exosome Cargo Detection and Readout
8:25
Results: Validation of EFIRM and Detection of the Human CD63-GFP in Mouse Serum and Saliva
9:41
Conclusion
