El desarrollo de inhibidores de interacciones proteína-proteína a través REEMPLAZAR: Aplicación al Diseño y Desarrollo para no ATP inhibidores de CDK Competitiva

El objetivo general de la estrategia es generar una molécula pequeña terapéutica eficaz similar a un fármaco mediante la conversión de un péptido inhibidor de la interacción de una proteína-proteína. Esto se logra estableciendo una relación estructura-actividad para la interacción peptídica-proteína deseada para comprender qué partes se pueden reemplazar de manera efectiva como segundo paso. La química computacional se utiliza para identificar alternativas viables de fragmentos para los determinantes peptídicos conocidos, que luego se pueden usar para sintetizar una biblioteca de híbridos de péptidos fragmentados.

A continuación, se sintetiza una biblioteca de híbridos entre estos fragmentos y el péptido truncado con el fin de generar moléculas que se pueden probar en un ensayo in vitro para identificar moléculas que sean más parecidas a un fármaco y que recapitulen la actividad del péptido nativo. Los resultados muestran que se pueden identificar más compuestos similares a fármacos utilizando la metodología, y estos representan puntos de partida efectivos para el descubrimiento de fármacos inhibidores de las interacciones proteína-proteína. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cribado de alto rendimiento, es que la tracción de proteínas es extremadamente difícil desde el punto de vista del descubrimiento de fármacos, y los métodos convencionales no funcionan bien.

La estrategia de reemplazo implica el enfoque iterativo escalonado y, por lo tanto, puede llevar más tiempo o es más probable que sea eficaz a largo plazo. Hoy demostraré la mayoría de los procedimientos yo misma con la ayuda de mi asociada, la Dra. Sandra Craig, quien establecerá algunas de las reacciones y procedimientos. Comience este procedimiento con la validación del protocolo de acoplamiento, seguido de la preparación del sitio de unión al receptor y los ligandos como se describe en el protocolo de texto para acoplar los ligandos en el surco de ciclina.

Primero, seleccione la rutina de ajuste del ligando del protocolo de interacciones de ligando del receptor establecido en el software, use el receptor y los ligandos preparados como entrada para este protocolo. Para estos recorridos, seleccione PLP one como red de energía. La rejilla de energía utilizada por el programa de acoplamiento es el campo de fuerza para generar las interacciones del receptor del ligando y las poses potenciales.

El primer es el potencial lineal de paz, que prioriza específicamente las interacciones de enlace de hidrógeno. Especifique que las poses se minimicen al mínimo y que el número de poses generadas sea 10. Deje todos los demás parámetros en los valores predeterminados en primera instancia.

Visualice las poses en el programa visualizador y, a continuación, clasifíquelas por valores descendentes de la puntuación PLP uno. Utilice funciones de puntuación como plp, una para estimar la afinidad de unión de un ligando acoplado en función de la posición del ligando candidato, la geometría y la interacción no covalente con la estructura del receptor objetivo. Analice visualmente el 25% superior de las poses puntuadas para ver si hay superimposibilidad con el grupo de limitación conocido.

Observe también si la pose ha cumplido con los filtros de interacción, que están configurados para incluir restricciones de átomos que requieren contactos intermoleculares que se sabe que son críticos para la unión y o son necesarios para posicionar el grupo de recubrimiento potencial en la geometría correcta para la formación de enlaces amida. Finalmente, examine las poses para la complementariedad visual, que se define como tener un llenado eficiente del bolsillo de unión de una manera que sea consistente con la actividad de la estructura conocida. Relaciones para la síntesis de grupos de recubrimiento de extremos, utilice todos los materiales de partida comerciales, solventes y reactivos y sintetice mediante química orgánica sintética convencional.

Realice cromatografía en capa fina o TLC en gel de sílice para monitorear las reacciones disolviendo primero el material de partida y la mezcla de reacción en la fase móvil. A continuación, localice el material de partida disuelto y la mezcla de reacción en la placa TLC utilizando tubos capilares. Coloque la placa TLC en la cámara que contiene la fase móvil.

Una vez que la fase móvil alcance el 90% de la placa TLC, retire y seque la placa al aire. Utilice la luz ultravioleta para detectar el material de partida y las mezclas de reacción como puntos visibles. A continuación, calcule la RF de cada punto, que es la relación entre la distancia recorrida por el punto y la fase móvil.

A continuación, coloque la mezcla de reacción en un embudo separador y lávela con ácido acuoso o solución base, según corresponda. Recoja el solvente orgánico y evapore en un evaporador rotativo antes de secarlo. El producto bruto obtenido al vacío disuelve 500 miligramos de producto bruto en tres a cinco mililitros de disolvente adecuado y se añade a una muestra de sílice o RP 18 antes de secarse al aire, se coloca una muestra que contiene el producto bruto en sílice, cartuchos de fase reversa.

Purifique el material bruto mediante cromatografía flash automatizada de alta resolución. Empleando una columna de 100 gramos con un degradado. Ejecute más de 15 volúmenes de columnas.

Seque el producto purificado recogido en el disolvente de la cromatografía flash utilizando un evaporador rotativo evaporando todo el disolvente hasta la sequedad. A continuación, seque el producto al vacío para eliminar todos los disolventes residuales. Realice la caracterización del producto purificado mediante RMN, MS y HPLC analítica como se describe en el protocolo de texto para sintetizar fragmentos con capa final, péptidos inhibidores ligados o ensamblajes de volteos.

Compuestos pépticos de fin de obra mediante métodos estándar de síntesis en fase sólida. Activar cinco equivalentes del aminoácido terminal C en 4,4 equivalentes de HBTU en dos mililitros de DIMETILFORMAMIDA o DMF durante cinco minutos. Cargue la mezcla en resina de pista usando seis equivalentes de diisopropiletil amina durante una hora a temperatura ambiente.

Retire el grupo protector FM del residuo terminal C utilizando 20%INE en tres mililitros de DMF durante 10 minutos. Acopla los aminoácidos subsiguientes paso a paso en cada paso. Acople cinco equivalentes del siguiente aminoácido utilizando seis equivalentes de isopropilo DI, etilamina y 4,4 equivalentes de HBTU en dos mililitros de DMF durante una hora.

A temperatura ambiente, aplique ciclos de lavado después del acoplamiento de aminoácidos y pasos de protección FM D después del ensamblaje de péptidos. Acople grupos de recubrimiento de N utilizando seis equivalentes de isopropilo DI, amina de etilo y 4,4 equivalentes de HBTU en dos mililitros de DMF durante una hora a temperatura ambiente al finalizar el ensamblaje del péptido. Tratar la mezcla de reacción con dos mililitros de la mezcla de escisión durante la noche para eliminar los grupos protectores de la cadena lateral y Cleve voltea de la resina tritratar el producto resultante con éter datílico frío para precipitar y, si es necesario, concentrar en un evaporador rotativo filtrar el sólido resultante y secar al vacío o liofilizar con un liofilizador.

En este punto, proceda con el ensayo de unión a la polarización de fluorescencia como se describe en el protocolo de texto para la determinación de la unión competitiva. Se muestra la estructura del modelo de H-A-K-R-R-L-I-F unido a la ranura de unión ciclónica. El surco de ciclismo consta de dos bolsas hidrofóbicas, una bolsa primaria más grande y una bolsa secundaria más pequeña, que están unidas por residuos ácidos representados en rojo.

Otras interacciones importantes incluyen los contactos de enlace de hidrógeno de la columna vertebral del péptido y las interacciones de emparejamiento de iones de los tres residuos básicos del péptido aquí, se muestra el modo de unión de tres cinco D-C-P-T-R-L-I-F, mostrado con interacciones de enlace de hidrógeno con átomos de cadena lateral de triptófano dos 17 y glutamina 2 54 acoplados. Se muestran las posturas de tres grupos representativos y de tapón, con cada uno de estos compuestos poseyendo enlaces de hidrógeno con los átomos de filtro de interacción de triptófano dos 17 y glutamina 2 54. Como se representa en las líneas discontinuas verdes, el hinojo subsiste haciendo que las interacciones de la pared de Vander con la bolsa hidrofóbica secundaria.

Después de ver este video, tendrá una mejor comprensión de cómo realizar y aplicar la estrategia de reemplazo, convirtiendo un inhibidor de péptidos conocido en una molécula más parecida a un medicamento, que inhibe la tracción de una proteína y es un punto de partida para el desarrollo terapéutico.