Name: Síntesis de indoxil-glucósidos para la detección de glucosidasa Actividades (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende una nueva ruta sintética para glicósidos de indoxilo con rendimientos mejorados usando ésteres de ácido indoxílico. Este método facilita la preparación de sustratos cromogénicos para ensayos cualitativos de actividad enzimática.

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Se agradece el apoyo a este trabajo de Glycom A/S, Copenhague, Dinamarca.

Observaciones generales:
Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando una campana extractora y un equipo de protección personal adecuado. Todos los reactivos y disolventes (p.a.; contenido de agua para disolventes secos: MeCN <50 ppm; et2O <0.01%; CH2Cl2 <0,003%; Los THF <0,005%) se compraron de fuentes comerciales y se utilizaron tal como se recibieron. La TLC se realizó en placas de gel de sílice Merck 60 F254. Los compuestos se detectaron por UV y/o por tratamiento con EtOH/H2SO4 (9:1) y posterior calentamiento. La cromatografía en columna se realizó con gel de sílice Merck/Fluka 60 (malla 230-400). Las filtraciones se realizaron con embudo Büchner y bomba aspiradora. Los disolventes se eliminaron empleando un evaporador rotativo (40 °C, ~200 rmp). Los productos se secaron en alto vacío (bomba de paletas rotativas). Las reacciones que requirieron solventes secos se llevaron a cabo bajo atmósfera de argón.
A continuación, se describe la síntesis de X-Gal (16) empleando éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indoxílico (12). Para otros compuestos con patrones de sustitución variados, así como ésteres metílicos preparados de acuerdo con esta secuencia sintética, consulte la ref.17-19.
1. Aceptor: Síntesis de éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-intoxicílico18 (12)
<ol>
	<li>N-acetilación: Síntesis de N-(4-bromo-3-cloro-2-metilfenil)-acetamida (6)
	<ol>
		<li>Disuelva 10,0 g (45,7 mmol) de 4-bromo-3-cloro-2-metilanilina en 30 ml de diclorometano. 
		¡Cautela! El diclorometano es dañino y enfría la solución en un baño de hielo.</li>
		<li>Añade 6,50 ml (68,7 mmol) de anhídrido acético gota a gota y deja que la mezcla se caliente a temperatura ambiente. La mezcla se puede remover durante 8 horas o toda la noche. ¡Cautela! El anhídrido acético es corrosivo e inflamable.</li>
		<li>Retire el disolvente y recristalice el acetato de etilo/metanol 9:1 (rendimiento: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), sólido incoloro) 
		¡Cautela! El acetato de etilo es irritante e inflamable. ¡Cautela! El metanol es tóxico e inflamable.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oxidación: Síntesis de ácido N-acetil-5-bromo-6-cloro-antranílico (7)
	<ol>
		<li>Reflujo una mezcla de 2,30 g (8,76 mmol) de 6 (producto obtenido del paso 1.1) y 2,10 g (8,52 mmol) de MgSO4•7H2O en 40 ml de agua en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos equipado con enfriador y embudo de goteo.</li>
		<li>Añada gota a gota 50 ml de solución saturada de KMnO4 en agua a la mezcla de reacción durante un período de 3 horas. A continuación, calentar durante 2 horas adicionales bajo reflujo, aprox. 135 °C en baño de aceite. ¡Cautela! El permanganato de potasio es perjudicial y oxidante.</li>
		<li>Enfriar a temperatura ambiente y filtrar la pirolusita (MnO2), que se forma durante la reacción. 
		¡Cautela! La pirolusita es dañina.</li>
		<li>Añadir ácido clorhídrico (37%) al filtrado hasta pH 1, luego filtrar el producto y secar al vacío, (rendimiento: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), sólido incoloro) 
		¡Cautela! El ácido clorhídrico es corrosivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Desacetilación: Síntesis de ácido 5-bromo-6-cloro-antranílico (8)
	<ol>
		<li>Disolver 3,90 g (13,3 mmol) de 7 (producto obtenido del paso 1.2) en 70 ml de solución acuosa de hidróxido de sodio 1 N y calentar a aprox. 100 °C (baño de aceite) durante 5 hr. 
		¡Cautela! El hidróxido de sodio es corrosivo.</li>
		<li>Enfriar a temperatura ambiente y añadir ácido clorhídrico (37%) hasta pH 1, luego filtrar el producto con un embudo Büchner y secar al vacío, (rendimiento: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), sólido incoloro).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formación de anhídrido: Síntesis de anhídrido 5-bromo-6-cloro-isatoico (9)
	<ol>
		<li>Suspender 8,17 g (32,6 mmol) de 8 (producto obtenido del paso 1.3) en 33 ml de acetonitrilo seco. 
		¡Cautela! El acetonitrilo es dañino e inflamable.</li>
		<li>Remover a temperatura ambiente y añadir 5,3 ml y una solución de 3,22 g (10,8 mmol) de trifosgeno en 18,5 ml de diclorometano seco gota a gota simultáneamente durante un periodo de 30 min. A continuación, se calienta durante 3 horas a 50 °C (baño de aceite). ¡Cautela! La piridina es dañina e inflamable. 
		¡Cautela! El trifosgeno es tóxico y puede liberar fosgeno.</li>
		<li>Elimine aproximadamente el 75% del solvente y apague la reacción agregando 100 ml de agua destilada y filtre su producto. Lavar con una pequeña cantidad de diclorometano frío.</li>
		<li>Secar el producto al vacío, (rendimiento: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), sólido incoloro).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-alquilación: Síntesis de anhídrido 5-bromo-6-cloro-N-[(metoxicarbonil)alilo]-isatoico (10)
	<ol>
		<li>Disolver 25 g (90 mmol) de 9 (producto obtenido del paso 1.4) en 250 ml de dimetilformamida anhidra y enfriar con un baño de hielo. 
		¡Cautela! La dimetilformamida es dañina e inflamable</li>
		<li>Agregue 1.15 equivalentes de hidruro de sodio (60% en parafina) por porción. 
		¡Cautela! El hidruro de sodio es corrosivo e inflamable; Fuerte reacción con agua/hielo.</li>
		<li>Después de 30 minutos de agitación a 0 °C, deje que se caliente a temperatura ambiente y agregue 1,2 equivalentes de bromoacetato de alilo gota a gota.</li>
		<li>Después de agitar durante 5 horas, apague la reacción agregando 500 ml de agua destilada y filtre su producto.</li>
		<li>Lavar con agua (3 veces, 100 ml) y secar el producto al vacío, (rendimiento: 93% (31,5 g, 84,1 mmol), sólido incoloro).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Apertura de anhídrido: Síntesis de éster de alilo de ácido 5-bromo-6-cloro-N-(metoxicarbonilalilo)-antranílico (11)
	<ol>
		<li>Disolver 10 g (27 mmol) de 10 (producto obtenido del paso 1.5) en 100 ml de alcohol alílico. 
		¡Cautela! El alcohol alílico es perjudicial y peligroso para el medio ambiente.</li>
		<li>Agregue 350 mg (8.70 mmol) de hidruro de sodio (60% en parafina) por porción.</li>
		<li>Después de remover durante 6,5 horas o toda la noche, retire el solvente.</li>
		<li>Someter el producto crudo a cromatografía en columna (columna de 30 x 6 cm; 240 g de sílice) éter de petróleo/acetato de etilo 2:1; RF = 0,66), (rendimiento: 80% (8,30 g, 21,3 mmol), aceite amarillo) 
		¡Cautela! El éter de petróleo es inflamable, irritante y peligroso para el medio ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Condensación Dieckmann: Síntesis de éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indoxílico (12)
	<ol>
		<li>Mezclar 3,0 g (7,7 mmol) de 11 (producto obtenido de la etapa 1.6) y 1,75 g (15,6 mmol) de terc-butóxido de potasio en 100 ml de éter dietílico seco. 
		¡Cautela! El terc-butóxido de potasio es corrosivo e inflamable. 
		¡Cautela! El éter dietílico es dañino y extremadamente inflamable.</li>
		<li>Calentar la mezcla bajo reflujo (enfriador) durante 2 horas a 40-45 °C.</li>
		<li>Retire aproximadamente el 75% del solvente y agregue ácido clorhídrico diluido (100 ml, 1 M). 
		¡Cautela! No se seque por completo, puede producirse descomposición.</li>
		<li>Filtrar el producto y secar al vacío, (rendimiento: 84% (5,14 g, 15,5 mmol), sólido incoloro a ligeramente verde).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indoxil-Glucósido: Síntesis de X-Gal17
<ol>
	<li>Glicosilación por transferencia de fase: Síntesis de (5-bromo-4-cloro-indox-3-ácido ílico) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-galactopiranósido (14)
	<ol>
		<li>Mezclar 400 mg (1,21 mmol) de ácido indoxílico aliléster 12 (producto obtenido en el paso 1.7), 410 mg (1,21 mmol) de hidrogenosulfato de tetrabutilamonio y 500 mg (1,21 mmol) del donante bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-ᴅ-galactopiranosil (α-acetobromogalactosa) en 10 ml de diclorometano. ¡Cautela! El hidrogenosulfato de tetrabutilamonio es perjudicial.</li>
		<li>Añadir 10 ml de una solución acuosa de carbonato potásico (1 M). 
		¡Cautela! El carbonato de potasio es corrosivo.</li>
		<li>Remover a temperatura ambiente hasta el consumo completo del donante (TLC: éter de petróleo/acetato de etilo).</li>
		<li>Separar la fase orgánica (embudo separador), secar sobre Na2SO4 y eliminar el disolvente.</li>
		<li>Someter el producto bruto a cromatografía en columna (éter de petróleo/acetato de etilo 1:1; RF = 0,33). (rendimiento: 86% (690 mg, 1,04 mmol), sólido incoloro).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Escisión y descarboxilación de ésteres: Síntesis de (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-galactopiranósido (15)
	<ol>
		<li>Disolver 600 mg (0,908 mmol) de 14 (producto obtenido del paso 2.1) en 15 ml de tetrahidrofurano seco. 
		¡Cautela! El tetrahidrofurano es dañino e inflamable.</li>
		<li>Añadir 800 μl de morfolina y 105 mg (9,09 μmol) de tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) y remover durante la noche a temperatura ambiente><.
		¡Precaución! La morfolina es inflamable y corrosiva.</li>
		<li>Retire el disolvente.</li>
		<li>Agregue 400 mg (2,40 mmol) de acetato de plata, 800 mg (5,79 mmol) de carbonato de potasio y 10 ml de anhídrido acético. 
		¡Cautela! El acetato de plata es irritante y peligroso para el medio ambiente.</li>
		<li>Calentar a 90-100 °C durante 20 min.</li>
		<li>Después de enfriar a temperatura ambiente, diluir con diclorometano.</li>
		<li>Lave la mezcla dos veces con agua y una vez con una solución diluida de NaHCO3 (10%). 
		¡Cautela! El bicarbonato de sodio es corrosivo.</li>
		<li>Secar la fase orgánica sobre Na2SO4 (filtro) y eliminar el disolvente.</li>
		<li>Someter el producto crudo a cromatografía en columna (PE/EA 1:1; RF = 0,24), (rendimiento: 88% (495 mg, 8,00 mmol), sólido incoloro).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Desacetilación de Zemplén: Síntesis de (5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-β-ᴅ-galactopiranósido (16)
	<ol>
		<li>Disolver 396 mg (0,436 mmol) 15 (producto obtenido del paso 2.2) en 10 ml de metanol.</li>
		<li>Agregue una cantidad catalítica de metanolato de sodio y revuelva durante la noche a temperatura ambiente><.
		¡Cautela! El metanolato de sodio es inflamable y corrosivo.</li>
		<li>Neutralizar con Amberlite IR-120 H+ (filtro) y concentrado. 
		¡Cautela! Amberlite IR-120 H+ es irritante.</li>
		<li>Secar el producto al vacío, (rendimiento: 87% (170 mg, 0,416 mmol), sólido incoloro).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Modelo ilustrativo del experimento: Prueba de actividad de β-galactosidasa empleando X-Gal
<ol>
	<li>Prepare una solución de 0,5 mM de X-Gal en tampón de 500 μl (Tris-HCl 20 mM; pH 7,4; 50 mM de NaCl, 0,1 mM de ácido etilendiaminotetraacético; o cualquier otro tampón adecuado para su enzima) en un tubo de microcentrífuga (X-Gal puede disolverse en unos pocos μl de dimetilsulfóxido).</li>
	<li>Añadir 1 μl β,1-3-galactosidasa (EC 3.2.1.23 10.000 U/ml; o cualquier otra β-galactosidasa adecuada) y agitar (600 rps) a 37 °C.</li>
	<li>Sigue la reacción. El tinte de tipo índigo se forma después de un corto período de tiempo.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Debido a los bajos rendimientos y limitaciones, especialmente para las estructuras de tipo glucosa y los sacáridos más complejos, se desarrolló un nuevo enfoque sintético hacia los glucósidos de indoxilo. Los ésteres de ácido indoxílico demostraron ser valiosos intermediarios clave y se obtuvieron en una vía modular y escalable. Todos los pasos son de alto rendimiento y, debido a los materiales de partida baratos y al fácil trabajo, son posibles las síntesis de varios gramos. La ventaja del enfoque de éster de alilo es e...

Durante mucho tiempo, la producción de índigo fue un proceso económicamente muy importante. Antes de que las síntesis químicas a gran escala permitieran obtener índigo de forma económica, los precursores se obtenían de fuentes naturales desde épocas anteriores al cristianismo. El cultivo de plantas productoras de índigo (índigo natural) en Europa dejó de ser rentable en el siglo XVIIth siglo, ya que la cantidad de precursores de índigo de la planta de índigo india (0,2-0,8 %) es aproximadamente 30 veces mayor. A finales del siglo XIX, la síntesis química del índigo suprimió el cultivo convencional1,2.
Los precursores del índigo que ocurren naturalmente en las plantas incluyen el índican (1), la insatán A (2) y la isatán B (3) (Figura 1). Todos ellos consisten en un grupo indoxilo unido a un residuo glucosídico. La escisión del enlace glucosídico, por ejemplo mediante hidrólisis enzimática, conduce a la liberación de indoxilo (4). El indoxilo en sí es casi incoloro, pero puede oxidarse rápidamente para formar un tinte de índigo (5). Esta reacción sensible se ha adaptado en bioquímica, histoquímica, bacteriología y biología molecular para monitorear actividades enzimáticas. Es posible realizar cribados de actividad in vivo sin aislamiento ni purificación de enzimas, así como pruebas rápidas en placas de agar o en solución (por ejemplo, cribado azul-blanco, micropozos). Dependiendo del residuo (por ejemplo, ésteres, glucósidos, sulfatos) unido al grupo indoxilo, se han desarrollado sustratos adecuados para diferentes clases de enzimas (por ejemplo, esterasas, glucosidasas, sulfatasas)3. A continuación, se centrará la atención en la formación y aplicación de los glucósidos de indoxilo.
<img alt="Diagrama del proceso de hidrólisis de indicano mostrando derivados del indol y la formación del tinte índigo." src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Precursores naturales de índigo y formación del tinte índigo mediante hidrólisis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El patrón de sustitución de la fracción indoxilo determina el color y las propiedades físicas del tinte de índigo resultante. Los patrones de sustitución más comunes son 5-bromo-4-cloro (abreviado como X; azul verdoso), 5-bromo (azul) y 5-bromo-6-cloro (magenta), ya que forman las partículas de tinte más pequeñas, no forman gránulos y tienen la menor difusión desde los sitios de hidrólisis. Esta última propiedad es especialmente importante para experimentos in vivo3.
El primer informe sobre un método indigénico para la detección de actividad esterasa fue publicado en 1951 por Barrnett y Seligman, quienes utilizaron acetato e hidroxibutirato de indoxilo4. Aproximadamente una década después, el principio indigénico se adaptó para la localización de glucosidasas de mamíferos5. Hasta la fecha se han desarrollado varios glicósidos de indoxilo, aunque su síntesis resultó ser difícil. La mayoría de las síntesis se basan en el uso de un indoxilo N-acetilado como aceptor y el correspondiente donador de haluro de glicósido6-14. La glicosilación se lleva a cabo en acetona con hidróxido de sodio. Bajo estas condiciones ocurren varias reacciones secundarias, lo que reduce considerablemente el rendimiento. Especialmente para estructuras tipo glucosa se han reportado rendimientos de glicosilación muy bajos (por ejemplo, 15 % para (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-glucopiranosido6 y 26 % para (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetil-β-ᴅ-xilobiosido14 en un ejemplo más reciente). Mediante un enfoque novedoso, que emplea ésteres de ácido indoquílico, se prepararon varios glicósidos de indoxilo en buenos rendimientos (por ejemplo, (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-glucopiranosido con un 57 % de rendimiento).
El siguiente protocolo describe la síntesis sencilla del éster alilo del ácido indoílico (5-bromo-4-cloro) y, a partir de este, la síntesis de una glucósido indóxil (X-Gal). Un experimento modelo simple muestra la reactividad enzimática de la β-galactosidasa empleando X-Gal.

<table><tbody><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10298</td><td>Corrosivo, inflamable</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td> Alcohol alílico <td>nocivo e inflamable</td></tr><tr><td></td><td>Aldrich</td><td>453021</td><td>Nocivo, peligroso para el medio ambiente</td></tr><tr><td>Amberlite IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bromoacético</td> irritante <td>Merck</td><td>802260</td><td>Corrosivo, tóxico, peligroso para el medio ambiente</td></tr><tr><td>4-Bromo-3-cloro-2-metilanilina</td><td>ABCR</td><td>AB 171687</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>ACROS</td><td>326850010</td><td>Éter dietílico nocivo</td></tr><tr><td></td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10274</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>ACROS</td><td>348430010</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido dañino</td> e inflamable <td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>Irritante, inflamable</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>y beta; 1,3-galactosidasa, recombinante, E. coli</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td>Corrosivo</td></tr><tr><td>Hidrato de sulfato de magnesio</td><td>Merck</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>Tóxico, inflamable</td></tr><tr><td>Morfolina</td><td>Janssen Chimica</td><td>15.868.57</td><td>Corrosivo, inflamable</td></tr><tr><td>Éter de peroleo</td><td>Azelis 111053</td><td></td><td>Inflamable, irritante, peligroso para el medio ambiente</td></tr><tr><td>Carbonato de potasio</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12005</td><td></td></tr><tr><td>Permanganato de potasio</td> corrosivo <td>Gr&uuml; ssing</td><td>12056</td><td>Nocivo, oxidante</td></tr><tr><td>Terc-butóxido de potasio</td><td>Merck</td><td>804918</td><td>Corrosivo, inflamable</td></tr><tr><td>Piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>Nocivo, inflamable</td></tr><tr><td>Acetato de plata</td><td>Fluka</td><td>85140</td><td>Irritante, peligroso para el medio ambiente</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12144</td><td></td></tr><tr><td>Hidruro de sodio</td> corrosivo <td>Merck</td><td>814552</td> Hidróxido de sodio <td>corrosivo e inflamable</td></tr><tr><td></td><td>Riedel-de H&auml; es</td><td>S181200</td><td></td></tr><tr><td>Metanolato de sodio</td> corrosivo <td>Merck</td><td>806538</td> Sulfato de sodio <td>corrosivo e inflamable</td></tr><tr><td></td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenosulfato de tetrabutilamonio</td><td>Lancaster</td><td>5438</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td> nocivo <td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>Nocivo, inflamable</td></tr><tr><td>Tetrakis (trifenilfosfina)paladio(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Trifosgeno</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil)aminometano clorhidrato</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>Irritante</td></tr></tbody></table>

síntesis de indoxil-glucósidos para la detección de glucosidasa actividades

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Los glucósidos de indoxilo demostraron ser herramientas valiosas y versátiles para monitorear las actividades de la glucosidasa. Los indoxililos se liberan por hidrólisis enzimática y se oxidan rápidamente, por ejemplo, por el oxígeno atmosférico, a colorantes de tipo índigo. Esta reacción permite un cribado rápido y sencillo in vivo sin aislamiento ni purificación de enzimas, así como pruebas rápidas en placas de agar o en solución (por ejemplo, cribado azul-blanco, micropocillos) y se utiliza en bioquímica, histoquímica, bacteriología y biología molecular. Desafortunadamente, la síntesis de tales sustratos resultó ser difícil, debido a varias reacciones secundarias y a la baja reactividad de la función del indoxihidroxilo. Especialmente para las estructuras de tipo glucosa se observaron bajos rendimientos. Nuestro novedoso enfoque emplea éster de ácido indoxílico como intermediarios clave. Se prepararon ésteres de ácido indoxilico con patrones de sustitución variados en vías escalables. Las glicosilaciones de transferencia de fase con esos aceptores y haluros de glicosilo peracetilados se pueden realizar en condiciones comunes con altos rendimientos. La escisión de ésteres y la posterior glicosilación leve mediada por plata producen los glucósidos de indoxilo peracetilados con altos rendimientos. Por último, la desprotección se realiza según Zemplén.

Las primeras síntesis de indicano y 5-bromo-indicano fueron publicadas por Robertson ya en 1927 y 192915,16. Al emplear el éster metílico del ácido indoxílico como aceptor, se bloqueó la posición reactiva 2 y, por tanto, se suprimieron parcialmente las reacciones secundarias. La glicosilación en acetona/hidróxido de sodio, tras la desprotección y la descarboxilación (160 °C, anhídrido acético, 1 h) y finalmente desacetilación produjeron indicano e indicano-5-bromo. Basándonos en este concepto, desarrollamos un...

Los glucósidos de indoxilo son herramientas bien establecidas y ampliamente utilizadas para el cribado y la monitorización de la actividad enzimática. Especialmente para las estructuras de tipo glucosa, las síntesis anteriores demostraron ser desafiantes y de bajo rendimiento. Nuestro novedoso enfoque emplea ésteres de ácido indoxílico como intermediarios preciosos para producir un número considerable de glucósidos de indoxilo con buenos rendimientos.

Síntesis de indoxil-glucósidos para la detección de glucosidasa Actividades

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

El objetivo general de este procedimiento es presentar un nuevo enfoque sintético para glicósidos endo, incluidos aquellos con estructuras de carbohidratos complejas, obtenidos en buenos rendimientos. Esto se logra primero sintetizando un éster aceptor de ácido inico alo, a partir de metileno. El segundo paso implica la glicosilación de este aceptor con un donador de halogenuro de glicosilo acetilado.A continuación, el éster del alelo se escinde mediante un catalizador de paladio y se aplica una descarboxilación mediada por plata para crear el glicósido de inox acetilado. El último paso es la desacetilación con zeplan para obtener el glicósido de inox no protegido. En última instancia, el sustrato cromogénico preparado se utiliza para una prueba cualitativa de actividad enzimática.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que se pueden producir fácilmente glicósidos de estructuras carbohidratadas complejas e inestables. Tuvimos por primera vez la idea de este método al leer una publicación de Alexander Robertson de 1927, quien desarrolló la primera síntesis del éster metílico del ácido incaínico. Métodos posteriores utilizaron aceptores de cianoacetato debido a su mayor accesibilidad, pero presentaron bajos rendimientos y problemas de purificación. Para comenzar la síntesis, un satélite, un alqueno sustituido con halógeno como se describe en el protocolo del texto.Luego, en un matraz redondo de tres cuellos, refluja 2,3 gramos del acetamida metílica halogenada resultante en 40 mililitros de agua con 2,1 gramos de sulfato de magnesio heptahidratado durante tres horas. Añada gota a gota 50 mililitros de una solución acuosa saturada de permanganato de potasio y, a continuación, refluje la mezcla durante dos horas adicionales a aproximadamente 135 grados Celsius con un baño de aceite. Enfríe la mezcla a temperatura ambiente y luego filtre para eliminar el subproducto pirocita; ajuste el pH de la solución a uno con ácido clorhídrico al 37 %.A continuación, filtre el producto del disolvente y séquelo al vacío. Después de secar el deci, aísle el producto según se describe en el protocolo del texto y luego suspenda 8,17 gramos del producto deci resultante en 33 mililitros de trial de acetónido seco; simultáneamente, agregue gota a gota 5,3 mililitros de piridina y una solución de 3,22 gramos de tristina en 18,5 mililitros de diclorometano seco a la mezcla. Luego caliente la reacción a 50 grados Celsius en un baño de aceite.Después de tres horas, retire aproximadamente el 75 % del disolvente y agregue 100 mililitros de agua destilada para detener la reacción. Filtre el producto y luego lave el filtro con cinco a 10 mililitros de clorometano frío. Después del lavado, seque al vacío el producto, alquile este intermedio y luego abra el anhídrido resultante según se describe en el protocolo del texto.Aísle el producto resultante mediante cromatografía en columna. Inicie la condensación de Dickman mezclando tres gramos del producto con 1,75 gramos de óxido de potasio en 100 mililitros de éter dathyl seco, sometiendo la mezcla a reflujo durante dos horas a 40-45 grados Celsius. A continuación, elimine aproximadamente el 75 % del disolvente al vacío y precipite el producto con 100 mililitros de ácido clorhídrico uno molar.Filtre el producto y luego séquelo al vacío. Para comenzar la síntesis de XG, mezcle 400 miligramos del éster alilo del ácido indoc lílico con 410 miligramos de TBAs y 500 miligramos de alfa xto bromo galactosa en 10 mililitros de clorometano. Luego agregue 10 mililitros de carbonato de potasio acuoso 1 molar a la reacción.Agite la reacción a temperatura ambiente durante aproximadamente tres horas y controle el consumo de alfa acetobromogalactosa mediante cromatografía en capa fina en una solución uno a uno de éter de petróleo y acetato de etilo. Una vez que la alfa acetobromogalactosa se haya consumido completamente, aísle la fase orgánica de la solución con un embudo de separación. A continuación, seque la fase orgánica sobre sulfato de sodio para eliminar el agua residual y luego utilice cromatografía en columna para purificar el producto según se describe en el protocolo del texto, para escindir el éster alo, disuelva 600 miligramos del derivado galactopurico en 15 mililitros de tetrahidrofuran seco.Evapore el disolvente al vacío, agregue 400 miligramos de acetato de plata, 800 miligramos de carbonato de potasio y 10 mililitros de anhídrido acético al producto, y luego caliente la reacción a aproximadamente 95 grados Celsius durante 20 minutos. Deje enfriar la reacción a temperatura ambiente y diluya entonces la reacción con 50 mililitros de diclorometano. Para el trabajo posterior de esta reacción, lave la mezcla dos veces con agua y una vez con una solución al 10% de bicarbonato de sodio.Seque la fase orgánica sobre sulfato de sodio y luego concentre la solución. Utilice cromatografía en columna para purificar el subproducto acilado de galacto purina. A continuación, disuelva 396 miligramos del material purificado en 10 mililitros de metanol.Añada una cantidad equivalente a la punta de una espátula de metilato de sodio y luego agite la reacción durante la noche. Utilice una resina de intercambio catiónico para neutralizar la reacción y luego concentre la solución al vacío. Finalmente, seque el producto bajo vacío para obtener xal y comprobar la validez de la ruta sintética.Primero, disuelva el xal en unos pocos microlitros de óxido de dimetilsulfuro. Luego, prepare una solución stock de 0,5 milimolar de xal en un tampón adecuado. A continuación, agregue un microlitro de beta galacto y agite la mezcla a 600 revoluciones por segundo.A 37 grados Celsius, monitoree visualmente la reacción para detectar la formación de un tinte índigo vibrante. La formación de un tinte azul en la solución indica claramente la actividad enzimática en doxil. Los glucósidos son importantes para monitorear la actividad de la enzima glucosidasa, aunque son difíciles de sintetizar.El enfoque sintético presentado aquí proporciona el producto final de galacto purina endo con un rendimiento global del 66 %. Una mejora significativa frente a la metodología anterior, que daba como resultado solo un 28 % de rendimiento. Los glicósidos de doxil resultantes pueden utilizarse para probar la actividad de soluciones enzimáticas puras o impuras.En este ejemplo, el color índigo se observó únicamente en los pocillos que contenían beta galacto y se produjo con tan solo 0,1 milimolar de XG. Una vez que el aceptor de células indoc está preparado, esta ruta sintética para obtener glicósidos de células indoc puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la síntesis y la utilización de glicósidos iniciales. Esta ruta sintética produce estos compuestos con buen rendimiento a pesar de sus estructuras complejas.

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Research

Investigación

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Chemistry

Química

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