Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos Caenorhabditis elegans

El objetivo general de este procedimiento es evaluar de manera integral la toxicidad química de la línea germinal utilizando el nematodo C No Haitis elgan. Esto se logra sincronizando primero los gusanos mediante la adición de una solución de lejía diluida a una población de gusanos de etapa mixta de la cepa C Elgan PXOL one GFP. Este paso genera una gran cantidad de embriones protegidos de la lejía por su cáscara de huevo.

El segundo paso es generar una población sincronizada de larvas L one dejando que los embriones eclosionen en líquido sin alimento. A continuación, los gusanos crecen hasta su cuarta etapa larvaria o L 4, momento en el que se exponen a los productos químicos de interés en líquido durante 65 horas. El paso final es la visualización mediante microscopía de fluorescencia de la expresión de los reporteros de GFP en embriones dentro del útero de los gusanos.

En última instancia, la proporción de embriones positivos para GFP en comparación con el control de DMSO refleja la antigenicidad de los compuestos analizados. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los modelos de Rodin o los ensayos de cultivo celular, es que podemos evaluar la genicidad y la toxicidad de la línea germinal de los productos químicos en un modelo animal completo y, al mismo tiempo, realizar un ensayo de alto rendimiento durante el procedimiento. Hoy será la becaria postdoctoral Dra. Daniella Perotti.

Los gusanos gráficos para este procedimiento se prepararon previamente como se describe en el texto del protocolo adjunto, recoja los gusanos GR del medio de crecimiento de nematodos o placas NGM lavándolos con uno a dos mililitros de M nueve y transfiriéndolos a un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que la lombriz GR se sedimente hasta el fondo del tubo cónico de 15 mililitros durante aproximadamente cinco a 10 minutos. A continuación, retire el sobrenadante sin alterar la pelletza de gusano.

Transfiera el gránulo de gusano a dos a cuatro tubos de microcentrífuga y agregue un mililitro de solución de lejía diluida a cada tubo. Incubar durante dos o tres minutos a temperatura ambiente. Monitoree el progreso de la reacción bajo el microscopio estereoscópico para confirmar que todos los gusanos están muertos.

No lejía por más de cinco minutos, ya que los embriones podrían morir. Recoja los gusanos por centrifusión durante un minuto. A 3000 RPM.

Retirar el supernat y añadir un mililitro de M nine estéril para neutralizar la reacción. Asegúrese de que todos los materiales que entren en contacto con las lombrices después del tratamiento con lejía sean estériles. Lave los gusanos dos veces con medios M nine.

Retire el sobrenadante y agregue M nueve a 100 a 200 microlitros. Con una pipeta de vidrio para pastos, agregue una gota de la mezcla de lombrices M nine para limpiar las placas de NGM e incube durante al menos 24 horas a 20 grados centígrados para permitir que los embriones eclosionen sin comida. El crecimiento de las larvas se detendrá en la etapa L uno Dos pasos de sincronización.

El blanqueamiento y la inanición de la palabra L se utilizan porque es crucial lograr una población cálida altamente sincrónica para maximizar el número de larvas L 4 que se utilizarán para la exposición. Un día después del establecimiento de una población sincronizada de larvas L uno, recoja las larvas L one de las placas NGM claras. Lave las placas con uno o dos mililitros de M nueve y transfiera las larvas L one a un tubo cónico de 15 mililitros.

Deje que los gusanos adultos muertos se sedimenten hasta el fondo del tubo cónico de 15 mililitros durante aproximadamente cinco minutos. Recoja el sobrenadante donde están los gusanos L one en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Precipitar los gusanos por centrifusión durante dos minutos a 2.600 RPM.

Retirar el sobrenadante dejando aproximadamente 500 microlitros. Determine la concentración de gusanos en la solución M nine contando el número de gusanos en gotas de 10 microlitros. Con un microscopio estereoscópico, cuente al menos cinco gotas.

Ajuste la concentración de los gusanos a 20 a 25 gusanos por microlitro en M nine, y luego agregue 50 microlitros de la mezcla de gusanos M nine a las placas NGM. Sentados con OP 50, las bacterias alimentadoras incuban durante 65 horas a 15 grados centígrados para permitir que la población sincronizada de L uno crezca hasta alcanzar la etapa L cuatro. Este cribado utiliza un CL contra una cepa que contiene un reportero transcripcional fluorescente para detectar la alteración de la línea germinal y la inducción de aneuploidía embrionaria.

Recoja las larvas L four de las placas NGM transparentes lavando las placas con uno o dos mililitros de M nine y transfiriéndolas a un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que el lombriz L se sedimente hasta el fondo del tubo cónico de 15 mililitros durante aproximadamente cinco a 10 minutos. Luego retire el sobrenadante sin alterar la pelletza de gusano.

Agregue de tres a cinco mililitros de M nine y determine la concentración de gusanos en la solución de M nine contando el número de gusanos en gotas de 10 microlitros. Usando un microscopio estereoscópico, cuente al menos cinco gotas para cada muestra. Vuelva a suspender los gusanos a una concentración de un lombriz por mililitro en M nueve.

Diluya diez veces las bacterias OP 50 previamente preparadas con M nine. Asegúrese de que las bacterias resuspendidas alcancen la temperatura ambiente porque las temperaturas más bajas afectan el desarrollo de la lombriz usando una pipeta multicanal primero, agregue 100 microlitros de la mezcla de lombrices M nine a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo de dos mililitros de profundidad. A continuación, agregue 400 microlitros de la bacteria OP 50 diluida a cada pocillo al final.

Cada pozo tendrá 100 lombrices en 500 microlitros. Añada 0,5 microlitros de la sustancia problema a los pocillos deseados para lograr una concentración final de 100 micromolares. Una concentración comúnmente utilizada en cribados químicos en CL elgan exponer controles de etanol o solventes DMSO a una concentración final de 0.1% como control positivo.

Utilizar 100 micromolares sin cosol. Selle la placa con una película adhesiva. Asegúrese de sellar bien la placa para evitar la contaminación cruzada entre pocillos.

Envuelva el plato con papel de aluminio. Transfiera la placa a un agitador de la temperatura adecuada durante un período de tiempo adecuado. Mantenga la temperatura de la habitación alrededor de 20 grados centígrados, ya que la temperatura afecta el crecimiento de los gusanos al finalizar la exposición química en el agitador.

Deje reposar las placas de 96 pocillos durante 10 a 15 minutos para permitir que los gusanos adultos se sedimenten hasta el fondo de la placa con una pipeta multicanal. Retire 350 microlitros del M nueve de cada pocillo, teniendo cuidado de no molestar a los gusanos en el fondo del plato. Lave las lombrices con un mililitro de M nine y deje reposar nuevamente el plato durante 10 a 15 minutos para permitir que las lombrices adultas se sedimenten hasta el fondo.

Retire un mililitro del M nueve de cada pocillo, teniendo mucho cuidado de no molestar a los gusanos en el fondo del plato. Resus, suspende los gusanos en los M nueve restantes. Recoja 100 microlitros de la mezcla de gusano M nine de la placa de 96 pocillos y cárguela en los pocillos de una placa de 384 pocillos inferior transparente de pared negra.

Repita el proceso usando gusanos de 4 placas de 96 pocillos hasta que se hayan cargado todos los pocillos de la placa de 384 pocillos. Es importante que todos los pocillos tengan el mismo volumen para aumentar la eficiencia y la velocidad del enfoque automático durante el proceso de adquisición de imágenes. A continuación, añade un microlitro de lale a cada pocillo y deja que las lombrices incuben durante aproximadamente 30 minutos.

Lale actúa como un agonista del receptor de acetilcolina e inmoviliza los gusanos, transfiere la placa a un microscopio de alto contenido de campo amplio capaz de proporcionar imágenes automatizadas. Utilice un software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido de acuerdo con las directrices del fabricante. Seleccione el objetivo cuatro x para adquirir una imagen por.

Ajuste los parámetros de imagen GFP a 45 milisegundos de exposición y la resolución de imagen a 2160 por 2160. Comenzar la adquisición de imágenes: Los gusanos expuestos se visualizan directamente en placas de 384 pocillos. El número de gusanos que contienen al menos un embrión positivo para GFP se cuenta para cada pocillo y se normaliza por el número total de gusanos en ese pocillo, como se muestra aquí.

La exposición a agentes químicos como el veneno de microtúbulos sin código AOL conduce a la inducción de una alta proporción de embriones que expresan GFP en comparación con el control de DMSO. Los embriones GFP positivos son significativamente más brillantes que la débil fluorescencia de fondo observada en otros embriones, así como la autofluorescencia observada en el intestino de los animales. La flecha roja indica embriones positivos para GFP claramente visibles dentro del útero de un gusano tratado con AOL sin código.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de ADN de los gusanos, para obtener una visión más detallada del efecto de los productos químicos en la línea germinal. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la toxicología evaluar rápidamente la toxicidad reproductiva y la toxicidad de la línea germinal de los productos químicos.