Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos

El objetivo general de este procedimiento es evaluar exhaustivamente la toxicidad química en la línea germinal utilizando el nematodo C No Haitis elgan. Esto se logra primero sincronizando los gusanos mediante la adición de una solución diluida de lejía a una población mixta de gusanos en distintas etapas del cepa C Elgan PXOL uno GFP. Este paso genera un gran número de embriones protegidos de la lejía por su cáscara de huevo.

El segundo paso consiste en generar una población sincronizada de larvas L1 haciendo eclosionar los embriones en medio líquido sin alimento. A continuación, los gusanos crecen hasta su cuarto estadio larval o L4, momento en el cual se exponen a los compuestos de interés en medio líquido durante 65 horas. El paso final es la visualización mediante microscopía de fluorescencia de la expresión de los reporteros GFP en los embriones dentro del útero de los gusanos.

En última instancia, la proporción de embriones positivos para GFP en comparación con el control de DMSO refleja la antigenicidad de los compuestos analizados. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los modelos de Rodin o los ensayos en cultivo celular, es que podemos evaluar la genotoxicidad y la toxicidad para la línea germinal de productos químicos en un modelo de animal completo, al mismo tiempo que realizamos un ensayo de alto rendimiento durante la ejecución del procedimiento. Hoy será la investigadora posdoctoral la Dra. Daniella Perotti.

Los gusanos gráficos para este procedimiento se prepararon previamente como se describió en el texto del protocolo adjunto; recolecte los gusanos GR del medio de crecimiento para nematodos o placas NGM lavándolos con uno a dos mililitros de M nueve y transfiriéndolos a un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que los gusanos GR se sedimenten en el fondo del tubo cónico de 15 mililitros durante aproximadamente cinco a 10 minutos. A continuación, retire el sobrenadante sin perturbar el botón de gusanos.

Transfiera el pellet de gusanos a dos o cuatro tubos de microcentrífuga y agregue un mililitro de solución de lejía diluida a cada tubo. Incube durante dos o tres minutos a temperatura ambiente. Monitoree el progreso de la reacción bajo el microscopio estereoscópico para confirmar que todos los gusanos estén muertos.

No blanquee durante más de cinco minutos, ya que los embriones podrían morir. Recolecte los gusanos mediante centrifugación durante un minuto. A 3000 RPM.

Elimine el sobrenadante y agregue un mililitro de M nueve estéril para neutralizar la reacción. Asegúrese de que todos los materiales que entren en contacto con los gusanos después del tratamiento con lejía sean estériles. Lave los gusanos dos veces con medio M nueve.

Elimine el sobrenadante y agregue de 100 a 200 microlitros de medio M nueve. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, agregue una gota de la mezcla de gusanos en medio M nueve a placas NGM claras e incube durante al menos 24 horas a 20 grados Celsius para permitir que los embriones eclosionen sin alimento. El crecimiento de las larvas se detendrá en la etapa L1. Dos pasos de sincronización.

El blanqueo y la privación de alimento L son utilizados porque es fundamental obtener una población altamente sincronizada de larvas para maximizar el número de larvas L4 que se utilizarán en la exposición. Un día después de establecer una población sincronizada de larvas L1, recolecte las larvas L1 de las placas NGM claras. Lave las placas con uno a dos mililitros de M9 y transfiera las larvas L1 a un tubo cónico de 15 mililitros.

Deje que los gusanos adultos muertos se sedimenten en el fondo del tubo cónico de 15 mililitros durante aproximadamente cinco minutos. Recoga el sobrenadante donde se encuentran los gusanos L1 en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Precipite los gusanos mediante centrifugación durante dos minutos a 2.600 RPM.

Retire el sobrenadante dejando aproximadamente 500 microlitros. Determine la concentración de gusanos en la solución M nueve contando el número de gusanos en gotas de 10 microlitros. Utilizando un microscopio estereoscópico, cuente al menos cinco gotas.

Ajuste la concentración de los gusanos a entre 20 y 25 gusanos por microlitro en medio M nueve, y luego agregue 50 microlitros de la mezcla de gusanos en M nueve a placas NGM. Incube durante 65 horas a 15 grados Celsius en presencia de la cepa OP50, bacteria utilizada como alimento, para permitir que la población sincronizada en estadio L1 crezca hasta alcanzar el estadio L4. Esta prueba utiliza una cepa con un marcador fluorescente transcripcional para detectar alteraciones en la línea germinal e inducción de aneuploidía embrionaria.

Recolecte las larvas L4 de las placas NGM claras lavando las placas con uno a dos mililitros de M nueve y transfiriéndolas a un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que el gusano L4 se sedimente en el fondo del tubo cónico de 15 mililitros durante aproximadamente cinco a 10 minutos. Luego, retire el sobrenadante sin perturbar el pellet de gusanos.

Añada de tres a cinco mililitros de M nueve y determine la concentración de gusanos en la solución de M nueve contando el número de gusanos en gotas de 10 microlitros. Utilizando un microscopio estereoscópico, cuente al menos cinco gotas para cada muestra. Resuspenda los gusanos a una concentración de un gusano por mililitro en M nueve.

Diluya diez veces las bacterias OP 50 previamente preparadas con M nueve. Asegúrese de que las bacterias resuspendidas alcancen la temperatura ambiente, ya que temperaturas más bajas afectan el desarrollo de los gusanos. Utilizando una pipeta multicanal, primero agregue 100 microlitros de la mezcla de gusanos en M nueve a cada pocillo de una placa de 96 pocillos redondos profundos de dos mililitros. A continuación, agregue 400 microlitros de las bacterias OP 50 diluidas a cada pocillo al final.

Cada pocillo contendrá 100 gusanos en 500 microlitros. Añada 0,5 microlitros del compuesto de prueba a los pocillos deseados para obtener una concentración final de 100 micromolar. Una concentración comúnmente utilizada en ensayos químicos en CL elgan expone controles del disolvente etanol o DMSO a una concentración final de 0,1% como control positivo.

Utilice 100 micromolar sin cosolvente. Selle la placa utilizando una película adhesiva. Asegúrese de sellar bien la placa para evitar la contaminación cruzada entre pozos.

Envuelva la placa con papel de aluminio. Transfiera la placa a un agitador a la temperatura adecuada durante un tiempo apropiado. Mantenga la temperatura del ambiente alrededor de 20 grados Celsius, ya que la temperatura afecta el crecimiento de los gusanos al finalizar la exposición química en el agitador.

Deje reposar las placas de 96 pocillos durante 10 a 15 minutos para permitir que los gusanos adultos se sedimenten en el fondo de la placa utilizando una pipeta multicanal. Retire 350 microlitros del medio M nueve de cada pocillo, teniendo cuidado de no perturbar los gusanos en el fondo de la placa. Lave los gusanos con un mililitro de medio M nueve y deje reposar la placa nuevamente durante 10 a 15 minutos para permitir que los gusanos adultos se sedimenten en el fondo.

Retire un mililitro del M nueve de cada pocillo teniendo mucho cuidado de no perturbar los gusanos en el fondo de la placa. Resuspenda los gusanos en el M nueve restante. Recoja 100 microlitros de la mezcla de gusanos en M nueve de la placa de 96 pocillos y dispénselos en los pocillos de una placa de 384 pocillos con paredes negras y fondo transparente.

Repita el proceso utilizando gusanos de 4 placas de 96 pocillos hasta que se hayan cargado todos los pocillos de la placa de 384 pocillos. Es importante que todos los pocillos tengan el mismo volumen para aumentar la eficiencia y la velocidad del enfoque automático durante el proceso de adquisición de imágenes. A continuación, agregue un microlitro de lale a cada pocillo y deje que los gusanos incuben durante aproximadamente 30 minutos.

Lale actúa como un agonista del receptor de acetilcolina e inmoviliza los gusanos; transfiera la placa a un microscopio de campo amplio de alto contenido que sea capaz de proporcionar imágenes automatizadas. Utilice un software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido según las instrucciones del fabricante. Seleccione el objetivo de cuatro aumentos para adquirir una imagen por cada campo.

Ajuste los parámetros de imagen GFP a 45 milisegundos de exposición y resolución de imagen a 2160 por 2160. Comience la adquisición de imágenes: los gusanos expuestos se imaginan directamente en placas de 384 pocillos. Se cuenta el número de gusanos que contienen al menos un embrión positivo para GFP por cada pocillo y se normaliza según el número total de gusanos en ese pocillo, como se muestra aquí.

La exposición a agentes químicos como el veneno de microtúbulos no-code AOL induce una alta proporción de embriones que expresan GFP en comparación con el control de DMSO. Los embriones positivos para GFP son significativamente más brillantes que la débil fluorescencia de fondo observada en otros embriones, así como la autofluorescencia observada en el intestino de los animales. La flecha roja indica embriones positivos para GFP claramente visibles dentro del útero de un gusano tratado con no-code AOL.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de ADN de los gusanos para obtener una visión más detallada del efecto de los productos químicos sobre la línea germinal. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la toxicología evaluar rápidamente la toxicidad reproductiva y la toxicidad para la línea germinal de los productos químicos.