Name: El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Aprenda a codificar células mamíferas con proteínas fluorescentes mediante partículas retrovirales para ensayos multiplexados de alto rendimiento. Este método permite rastrear poblaciones celulares distintas simultáneamente.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Garry Nolan de la Universidad de Stanford para proporcionar la línea celular de empaquetamiento Phoenix GP para la producción de partículas retrovirales. Agradecemos al Dr. Roger Tsien de la Universidad de California en San Diego para proporcionar td tomate. También nos gustaría dar las gracias al Fondo para San Diego de la Universidad Estatal de Citometría de Flujo por su servicio y ayuda.

1. Preparación de células de mamíferos, la producción viral y Transducción de códigos de barras genético <ol><li> Placa de 2,5 x 10 6 células adherentes en una placa de 10 cm (o alrededor de 50-60% de confluencia) un día antes de la transfección en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Para retroviral uso de producción de envases línea celular de elección, como Phoenix-GP (una especie de regalo de Gary Nolan, la Universidad de Stanford). NOTA: La línea celular de empaquetamiento expresa de forma estable las proteínas Gag y Pol para la formación de partículas retrovirales en trans. Hacer que las células estén sanas y adherido a la placa en una monocapa, antes de la transfección. </li><li> 24 horas más tarde, preparar la mezcla de transfección de ADN. <ol><li> Para 125 l de DMEM libre de suero añadir 3 g de la estomatitis vesicular envoltura del virus vector glicoproteína (PCI-VSVG) y 3 g de vector de transferencia que lleva el gen de la proteína fluorescente de interés. Mezclar y añadir 15 l de polietilimina (2 mg / ml). </li><li> Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min y añadir a las células gota a gota. NOTA: polietilimina se añade a la mezcla de ADN homogéneo como reactivo de transfección para la formación de poliplejos. Con el fin de obtener partículas virales que llevan diferentes marcadores de proteínas fluorescentes, realice cada transfección independiente con el marcador de elección. Recuerde que el vector de transferencia retroviral es de alrededor de 7 kb de longitud y no puede ser empaquetado si es superior a 10 kb. </li></ol></li><li> Incubar las placas a 37 ° C. Con el fin de aumentar la producción de placas virales lugar a 30 ° C o 32 ° C en lugar. NOTA: 24 el medio de transfección enviar hr pueden ser reemplazados con 7 ml de medio fresco, y aunque esto puede mejorar la salud de las células que pueden disminuir la carga viral en el sobrenadante. </li><li> Después de la transfección de 48 horas a recoger las partículas virales que contiene sobrenadante y filtrar con un filtro de 0,45 mM politetrafluoroetileno. Utilice sobrenadante viral recién recogida para la transducción. OthDe otro mantener sobrenadante en alícuotas a -80 ° C y evitar la congelación-descongelación. Recuerde que el título viral disminuirá probablemente hasta un 50% con cada ciclo de congelación-descongelación. </li><li> Línea celular Placa de elección 24 horas antes de la transducción si adherente, o inmediatamente antes de la transducción si no adherente. Semillas 2,0 x 10 5 a 3,0 x 10 5 células adherentes (aquí Eh 7.5.1 y HEK 293T) o 5.0 x 10 5 a 1 x 10 6 células no adherentes (aquí SupT1) por pocillo en una placa de 6 pocillos. NOTA: Asegúrese de calibrar el número de células que se sembró antes de la transducción, especialmente para las células adherentes, por lo que las células alcanzan una confluencia del 60% en el momento de la transducción. </li><li> Añadir 5 g / ml polibreno (bromuro de hexadimethrene) a las células sembradas y luego añadir sobrenadante viral recogido previamente para obtener alrededor de 20-40% de infección (en este caso 2 ml). NOTA: El MOI o porcentaje de infección es principalmente arbitraria, como la clasificación permitirá amplificar cualquier subpopulation de las células. Obviamente, una mayor tasa de infección facilita y acelera el proceso de amplificación. </li><li> Transducir células por centrifugación en un rotor de cubo colgante en 1500 xg durante 120 min a 32 ° C. Resuspender las células no adherentes con medio fresco antes de la incubación. Para células adherentes, reemplazar con fresco medios 24 horas después de la transducción. NOTA: Se recomienda sellar las placas antes de la centrifugación con parafilm para evitar que se derrame más. Para aumentar la diversidad de células genéticamente con código de barras, transducir las células con partículas virales que llevan diferentes proteínas fluorescentes (obtenidas de la etapa 1.4). Al elegir los marcadores fluorescentes, asegúrese de que son compatibles con la instrumentación y tienen parámetros fluorescentes distinguibles. </li></ol> 2. Selección y Amplificación de células genéticamente con código de barras <ol><li> Analice las células de mamíferos transducidas por citometría de flujo, al menos, 72 h después de transducción para cuantificar el porcentaje de transducción. Utilice una línea de células no transducidas comparable como control negativo. NOTA: Como clasificación se utiliza para purificar poblaciones celulares con códigos de barras individuales, un alto porcentaje de transducción inicial, aunque no es necesario, debe acelerar el proceso de amplificación. </li><li> Utilizar la célula clasificador de elección para obtener las células que expresan la proteína de interés. <ol><li> Para ello, asegúrese de que las puertas se han establecido correctamente en los canales adecuados. <ol><li> Para ello utilice la misma línea celular ingenuo como control negativo y ajustar la tensión parámetro / canal para que el negativo de la población está por debajo del valor de 10 3 en cada eje fluorescente. Determinar gating para fluorescencia positiva como eventos que aparecen por encima de la del control negativo para cada canal fluorescente. </li></ol></li><li> Tenga en cuenta que cada instrumento puede variar y el voltaje correcto para determinar compuerta debe ajustarse en consecuencia, por lo que los controles positivos y negativos imperativas en cada expconfiguración erimental. <ol><li> Para la detección de fluorescencia en este montaje experimental utilizar el canal FITC (filtro de paso de banda 530/30 procedió por un filtro de paso 502 de largo) para EGFP, el canal de PE (filtro de paso de banda 585/42 procedió por un filtro 556 pase) para td Tomate , y el canal de APC (filtro de paso de banda 660/20) para E2 Crimson. NOTA: El láser de 488 nm excita eGFP y td tomate mientras E2 Carmesí es excitado por el láser de 633 nm. </li></ol></li></ol></li><li> Ordenar en tubos de 15 ml cónicos con 1 ml de 100% de FCS. NOTA: El proceso de clasificación de las poblaciones de células fluorescentes no es obligatorio, según se puede proceder directamente con la especie de clones individuales (véase más adelante). Ordenando las poblaciones ajustados basados ​​en fluorescencia elegido asegura una población de copia de seguridad para la futura selección de clones individuales. Tenga en cuenta que las células individuales son a veces difíciles de cultivar, mientras que una gran población de células puede ser fácilmente congelado, y luego descongelado y se amplifica en una etapa posterior. </li><li> Spen bajar las poblaciones clasificadas en un rotor centrífugo cubo colgado en 524 g en 32 ° C durante 5 min para sedimentar las células. Vuelva a suspender en 1 ml de medio fresco, y volver a la placa de células de modo que la confluencia de células es inferior al 60% para permitir el crecimiento y la división durante al menos dos días. <ol><li> Por ejemplo, las células adherentes placa a alrededor de 3 x 10 5 células en 2 ml de medio por pocillo en una placa de 6 pocillos y 2 x 10 6 células en 2 ml de medio en una placa de 6 cm. Utilice DMEM para las células adherentes y RPMI para las células no adherentes (o cualquier medio especificado si se requiere). Coloque células sembradas en una incubadora a 37 ° C durante varios días para permitir la amplificación. </li></ol></li></ol> 3. Obtener clonales poblaciones de células genéticamente con código de barras en diferentes intensidades <ol><li> Obtener poblaciones clonales de células transducidas originalmente (paso 1.7) o de la población ordenada (paso 2.3). NOTA: Esto asegurará nivel igual o similar de expresión de la proteína fluorescente entre todos la células dentro de la población (una población apretado con una pequeña CV en la intensidad de fluorescencia media de hasta 40%). <ol><li> Para ello, las células tipo individuales en placas de 96 pocillos con una unidad de deposición de células automatizado (ACDU). Establecer puertas para la clasificación de acuerdo con la población de interés. Asegurar puertas se establecen al menos un registro escala aparte para obtener poblaciones distinguibles al elegir las células en diferentes intensidades fluorescentes. Para el procedimiento que se muestra aquí, utilizar la misma citometría de flujo experimental establecido como el descrito en el paso 2.2. </li></ol></li><li> Amplificar clones individuales en una incubadora a 37 ° C durante al menos 2 semanas. A través del proceso de amplificación analizar las células bajo el microscopio para asegurar que las poblaciones en crecimiento originan en las células individuales y no de más de uno. NOTA: Recuerde que el clasificador colocará una célula por pocillo en promedio, y mientras algunos pozos pueden no tener ninguna célula en absoluto, otros pueden tener más de uno. <ol><li> Para asegurar que una población surge de una célula única, extremadamente suave con la placa y nunca molestar a los pozos con la pipeta. Observar la placa, así por así, bajo el microscopio. NOTA: Mientras que las células individuales pueden ser difíciles de identificar, una vez que comience a dividirse serán fácilmente reconocibles a veces. </li><li> Tenga en cuenta que a menudo las células &#39;mata&#39; a lo largo de los bordes. Deseche los pozos donde se pueden observar múltiples poblaciones clonales y mantener los que tienen una población ajustada. NOTA: Es recomendable transferir aquellos en los platos más grandes para la amplificación. </li></ol></li><li> Se tamizan los poblaciones clonales putativos mediante el análisis de ellos por citometría de flujo. Comparación de ellos con un control negativo utilizando la misma configuración experimental citometría de flujo. <ol><li> Analizar sólo un porcentaje de la muestra y mantener el resto como reserva. Elija las poblaciones más claramente separados basados ​​en la intensidad media y opresión de la población. Amplificar según sea necesario o congelar las existencias enmedio de congelación con 20% de glicerol a -80 ° C durante períodos cortos de tiempo o nitrógeno líquido durante más tiempo. NOTA: Recuerde que una &quot;verdadera&quot; población clonal debe tener un patrón de fluorescencia muy apretado. </li></ol></li></ol> 4. Asegúrese de Capacidades de multiplexación para selección de alto rendimiento (HTS) <ol><li> Combinar tantos poblaciones clonales distintas según sea necesario que puede ser utilizado adicionalmente en un formato multiplexado. Elige clones con la absorción / espectros de emisión distinguible y / o diferentes intensidades. Si se utiliza un formato de placa de 96 pocillos, que es adecuado para HTS, semilla de 50.000 células en 200 l por pocillo. NOTA: Tenga en cuenta que el número de células es sólo una estimación y puede cambiar en función del tipo de célula y si es adherente o no. </li><li> Analizar la muestra utilizando citometría de flujo para garantizar que cada una de las líneas de células fluorescentes establecidas independientes se pueden distinguir unos de otros. Antes de preparar el análisis negativoy los controles de un solo color para ajustar los parámetros y los valores de compensación. NOTA: Ajuste de los parámetros para distinguir claramente las poblaciones mixtas les permita ser utilizada además en un formato multiplexado. </li></ol> 5. Adaptar líneas celulares genéticamente con código de barras a la aplicación biológica de Elección <ol><li> Transducir líneas celulares establecidas con códigos de barras genéticamente con partículas virales que contienen los elementos de ensayo de elección, como se describe aquí en Stolp et al., 2013 59. Recuerde que el ensayo de elección debe ocupar un canal fluorescente adicional y distinguibles y por lo tanto se va a transferir a la línea celular con código de barras apropiado. NOTA: Cada línea celular con código de barras puede soportar un ensayo diferente. </li><li> Células con código de barras Ordenar genéticamente fluorescentes para aquellos que contienen elementos de ensayo. NOTA: elementos de ensayo pueden ser diseñados junto a una etiqueta o proteína fluorescente (como una fusión o a través de un sitio interno de entrada al ribosoma) fo detección directa a través de Western Blot, citometría de flujo o microscopía. El sistema utilizado en este protocolo se basa en la expresión de superficie HA epítopo solo, o con la expresión epítopo FLAG adicional. <ol><li> Manchar las poblaciones clonales que contienen el ensayo con anticuerpos acoplados HA y APC con fluorescencia. Luego de analizar las poblaciones clonales con anti-FLAG y la tinción de anticuerpos conjugados con FITC. </li><li> Para rastrear el ensayo, analizar o &quot;descifrar&quot; las poblaciones en el canal adecuado, donde las líneas de células genéticamente distintas con códigos de barras se pueden distinguir. Aquí, decodificar la naturaleza del sustrato mediante el análisis en el canal de PE para la detección de tomate td. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí dos procedimientos bien establecidos se han combinado; la ingeniería genética a través de la tecnología retroviral y la detección de proteínas fluorescentes utilizando citometría de flujo. Los códigos de barras genético basado en una proteína fluorescente para la producción de líneas celulares únicos proporciona una manera simple y robusta para aplicaciones multiplexados. La generación de células con código de barras de ingeniería genética a través de la tecnología retroviral, es un principio de un largo proceso, p...

Tecnologías como la espectroscopia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, todos se basan en la fluorescencia, una propiedad ampliamente explotado en aplicaciones bioquímicas, biomédicas y químicas. Fluorescencia, ya sea intrínseco o mediante el etiquetado, se ha explotado para el análisis de patrones de expresión de la proteína y perfiles, el destino celular, interacciones de proteínas y funciones biológicas 1-9, y por medio de la fluorescencia / Förster de transferencia de energía de resonancia para la detección de interacciones de biomoléculas y los cambios conformacionales 10-13. Desde el aislamiento de la proteína fluorescente verde victoria Aequorea (GFP) 14, el descubrimiento de que ocurren naturalmente proteínas fluorescentes adicionales de otros cnidarios, en particular los corales, ha aumentado en gran medida el número de proteínas fluorescentes distinguibles existentes con espectros de excitación / emisión. Estos, junto con la introducción de mutaciones en sus genes 15-19, have amplió aún más las posibilidades, la obtención de una verdadera paleta de proteínas fluorescentes disponibles para los científicos que explotan la microscopía, citometría de flujo y otras tecnologías basadas en fluorescencia para su investigación. En paralelo, aunque de forma independiente, el desarrollo de la tecnología retroviral ha facilitado drásticamente la expresión estable de la información genética en células de mamíferos ectópico 20-23. Por lo tanto, no es sorprendente que esta tecnología ha sido utilizada para transferir genes de proteínas fluorescentes en un amplio número de tipos de células y tejidos 24-28 o para la producción de animales transgénicos 29-31. Después de la naturaleza de los retrovirus, la información genética de la proteína fluorescente ectópico se introduce dentro del genoma de la célula 32 y la célula se vuelve fluorescente `para ever&#39;. Esta propiedad ha permitido el seguimiento del destino de las células, o de una sola célula dentro de una población de células. La célula ahora fluorescente tiene así adquiel rojo su propio biofirma y puede definirse como códigos de barras. Su biofirma único identifica de otras células, y esto es importante, lo distingue de células manipuladas genéticamente para expresar diferentes proteínas fluorescentes distinguibles con espectros de absorción / emisión. Las aplicaciones biológicas, tales como el seguimiento de los factores de reprogramación hacia la pluripotencia 33, el análisis de los factores subnuclear para el esclarecimiento de localización nucleolar 34, la construcción de plásmidos indicadores fluorescentes para estudios transcripcionales 35 o el etiquetado genética de las neuronas para el estudio de arquitectura de red neuronal 36 , son sólo cuatro ejemplos de los muchos que han explotado diferentes genes de proteínas fluorescentes para la misma configuración experimental. La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para el análisis de los procesos biológicos a nivel de células individuales, tales como la expresión génica, el ciclo celular, la apoptosis y la señalización a través de fosforiloación 37-43 .La expresión estable de los genes de proteínas fluorescentes en células de mamífero ha mejorado aún más la utilidad de la citometría de flujo para el análisis celular 38,44 y las interacciones ligando-receptor 45. Reforzar la capacidad han permitido que la citometría de flujo para convertirse en una metodología ampliamente utilizada para alto rendimiento y alto contenido de cribado 46. A pesar del número ahora ampliada de fluorómetros y robótica tecnologías que pueden sistemas de lectura de placas pareja, imágenes y citometría de flujo, parece que hay una falta en el diseño experimental que puede explotar y adaptarse a estas capacidades tecnológicas mejoradas. Metodologías basadas en células rápidas, confiables, simples y robustas están drásticamente necesarios para aplicaciones multiplexados que mejoran aún más la capacidad de alto rendimiento. Esto es especialmente cierto en el campo del descubrimiento de fármacos en ensayos basados ​​en células de ingeniería en un formato multiplexado pueden mejorar el poder de cribado de alto rendimiento 39,47-50 </sup&gt;. Multiplexación, ya que permite analizar simultáneamente en una muestra, mejora aún más las capacidades de alto rendimiento 51-54. Los códigos de barras genético fluorescente no sólo permite la multiplexación elegante, sino también, una vez diseñada, evita la necesidad de protocolos que consumen tiempo, reduce los costes acompañados con anticuerpos, los granos y las manchas 39,52,55, y puede reducir el número de pantallas de alta requeridas para aplicaciones de rendimiento. Recientemente hemos descrito cómo la tecnología puede mejorar retroviral multiplexación mediante código de barras genético fluorescente para aplicaciones biológicas, mediante la expresión de un ensayo desarrollado previamente para controlar el VIH-1 actividad de la proteasa 56,57 con diferentes variantes clínicamente prevalentes 58. La metodología se explica de una manera más descriptiva se centra en la forma de seleccionar y amplificar las células genéticamente con código de barras fluorescentes y cómo producir paneles de poblaciones clonales que expresan proteínas fluorescentes distintas y / o diferente intensit fluorescenciaies. Los paneles de las poblaciones de células diferenciadas en función de sus características fluorescentes mejorar las capacidades multiplexados, que pueden ser más explotado en combinación con ensayos basados ​​en células que abordan diferentes cuestiones biológicas. El protocolo también se describe cómo diseñar un grupo de células con código de barras que llevan uno de los ensayos basados ​​en células previamente desarrollados en el laboratorio, como ejemplo 59. Este protocolo lo tanto, no se pretende mostrar la tecnología bien establecida retroviral / lentiviral para la transferencia genética, el valor de las proteínas fluorescentes o las aplicaciones de la citometría de flujo 60,48 sino más bien para mostrar el poder de la mejora de la combinación de los tres para aplicaciones multiplexados.

<table><tbody><tr><td>Jeringas de 10 ml</td><td>BD 309604</td><td></td><td>utiliza para filtrar el virus</td></tr><tr><td>0.45 &micro; m ployfiltro de tetrafluoroetileno</td><td>Pall Corporation</td><td>4219</td><td>utilizado para filtrar el virus</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Corning</td><td>45000-304 medios de</td><td>crecimiento celular para células HEK 293T</td></tr><tr><td>PEI (polietilenimina)</td><td>poly sciences</td><td>23966-2</td> concentración de <td>2 mg/ml utilizada</td></tr><tr><td>Centrífuga de cubeta colgante (refrigerada)</td><td>Eppendorf</td><td>5805 000.017</td><td>utilizada para </td></tr><tr><td>Corning</td><td></td> <td>21-040-CV</td><td>Se utiliza para el lavado de células</td></tr><tr><td>Polibreno (bromuro de hexadimetriena)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>Se utiliza para aumentar la eficacia de la infección viral. Utilizado en un 5 &micro; concentración de g/ml.</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Instrumento utilizado para la clasificación de poblaciones celulares</td></tr><tr><td>FACSCanto</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>instrumento utilizado para el análisis celular</td></tr><tr><td>Phoenix-GP</td><td>Gift de Gary Nolan</td><td></td><td>línea celular utilizada para producir partículas retrovirales</td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero</td><td>Mediatech</td><td></td><td>MT35015CV utilizado para el crecimiento celular y la clasificación de</td></tr><tr><td>células SupT1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1942</td><td>Linfoblastos T humanos</td></tr><tr><td>Células HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Células de riñón embrionario humano que también contienen el antígeno T grande SV40</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>medio de crecimiento celular para células SupT1</td></tr></tbody></table>

el código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Las proteínas fluorescentes, los colorantes fluorescentes y los fluoróforos en general han revolucionado el campo de la biología celular molecular. En particular, el descubrimiento de las proteínas fluorescentes y sus genes ha permitido la ingeniería de fusiones de proteínas para la localización, el análisis de la activación transcripcional y la traducción de proteínas de interés, o el seguimiento general de células individuales y poblaciones celulares. El uso de genes de proteínas fluorescentes en combinación con la tecnología retroviral ha permitido aún más la expresión de estas proteínas en células de mamíferos de manera estable y fiable. Aquí se muestra cómo se pueden utilizar estos genes para dar a las células dentro de una población de células su propia biofirma. Como la biofirma se logra con la tecnología retroviral, las células tienen un código de barras "indefinido". Como tales, se pueden rastrear individualmente dentro de una mezcla de celdas con códigos de barras y utilizar en aplicaciones biológicas más complejas. El seguimiento de distintas poblaciones en una mezcla de células es ideal para aplicaciones multiplexadas, como el descubrimiento de fármacos frente a multitud de dianas o el perfil de activación de diferentes promotores. El protocolo describe cómo desarrollar y amplificar elegantemente células de mamíferos con códigos de barras con distintos marcadores genéticos fluorescentes, y cómo usar varios marcadores a la vez o un marcador a diferentes intensidades. Por último, el protocolo describe cómo se pueden utilizar las células en combinación con ensayos basados en células para aumentar la potencia de análisis a través de la multiplexación.

Multiplexing fluorescente barcoded genéticamente células con el propósito de aplicaciones biológicas sólo puede lograrse una vez que se han generado poblaciones clonales individuales. Multiplexación es más efectiva cuando las poblaciones con códigos de barras tienen características fluorescentes distintas claras con solapamiento espectral mínima. El ejemplo mostrado en la Figura 1 con poblaciones clonales de células de mamíferos SupT1 ilustra que las células con códigos de barras con mCherry y proteína ...

Desde el descubrimiento del gen de la proteína fluorescente verde, las proteínas fluorescentes han impactado en la biología celular molecular. Este protocolo describe cómo se utiliza la expresión de distintas proteínas fluorescentes a través de la ingeniería genética para codificar células individuales. El procedimiento permite el seguimiento de distintas poblaciones en una mezcla de células, lo que es ideal para aplicaciones multiplexadas.

El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en etiquetar mediante códigos de barras fluorescentes células de mamífero para mejorar ensayos biológicos multiplexados de alto rendimiento que dependen de lecturas fluorescentes distintas. Para ello, se utilizan partículas retrovirales para expresar de manera estable proteínas fluorescentes en células de mamífero, etiquetándolas así con códigos de barras. A continuación, se realiza la clasificación fluorescente de células activadas para obtener poblaciones clonales marcadas con códigos de barras.Las poblaciones clonales se amplifican, combinan y analizan mediante citometría de flujo para confirmar que pueden distinguirse entre sí y, por lo tanto, utilizarse simultáneamente. Finalmente, las líneas celulares con códigos de barras se transducen con el ensayo marcado. Las proteínas y la actividad biológica se monitorean utilizando canales fluorescentes distintos de los canales con códigos de barras.Los resultados demuestran la utilidad del recubrimiento fluorescente con códigos de barras en células de mamífero para aplicaciones multiplexadas en un entorno de alto rendimiento. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes que requieren una cuidadosa calibración de anticuerpos o colorantes es que, una vez establecidas las líneas celulares con códigos de barras genéticos, no necesitan manipulaciones adicionales y, dado que la proteína de interés se expresa durante largos períodos de tiempo, pueden utilizarse posteriormente para adaptaciones biológicas. La combinación de líneas celulares con códigos de barras genéticos fluorescentes con ensayos de superficie nos permite investigar funciones o efectos biológicos de forma independiente en un formato de alto rendimiento.En nuestro ejemplo, utilizamos un recubrimiento genético con barras fluorescentes para monitorear la escisión de diferentes sustratos virales en multiplex. El ensayo puede aprovecharse aún más para investigar los mecanismos implicados en la escisión y para el descubrimiento de fármacos de alto rendimiento. El día anterior a la transfección, siembre una placa de 10 centímetros con 2,5 × 10⁶ células Phoenix GP en DMEM con 10 % de FBS.Esta línea celular de empaquetamiento expresa establemente las proteínas gag y pol para la formación de partículas retrovirales en trance. El día de la transfección, utilice un microscopio de campo claro para examinar las células. Las células deben estar sanas y adheridas a la placa en una monocapa para ser utilizadas en la transfección.A continuación, prepare la mezcla de transfección de ADN hasta 125 microlitros de DMEM sin suero. Añada tres microgramos del vector de glicoproteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular, P-C-I-V-S-V-G, y tres microgramos del vector de transferencia que porta el gen de la proteína fluorescente de interés, añada 15 microlitros del reactivo de transfección de polieteramina y mezcle para obtener partículas virales que porten diferentes marcadores de proteína fluorescente. Realice cada transfección independientemente con el marcador de elección para ello.Incube cada mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos; tras la incubación, transfecte añadiendo la mezcla a las células gota a gota, y luego incube las placas a 37 grados Celsius. Opcionalmente, después de 24 horas, reemplace el medio con siete mililitros de medio fresco.Aunque esto podría mejorar la salud celular, podría disminuir la carga viral en el sobrenadante. 48 horas después de la transfección, utilice una pipeta para transferir el sobrenadante, que contiene las partículas virales, a una jeringa de 10 mililitros. Equipada con un filtro de politetrafluoroetileno de 0,20 micrómetros, presione el émbolo para dispensar el filtrado en tubos microcentrífugos de dos mililitros.Reserve una alícuota de dos mililitros para uso inmediato. Coloque el sobrenadante vírico restante y las alícuotas sobre hielo y transfiéralos a menos 80 grados Celsius hasta su uso, 24 horas antes de la transducción en cada pocillo de una placa de seis pocillos siembre 2,0 a 3,0 veces 10 a la quinta células adherentes; aquí se utilizan células 293T al día siguiente. Para transducir las células adherentes, retire el medio existente de la placa.Añada cinco microgramos por mililitro de poli cerebro a los dos mililitros del sobrenadante vírico previamente recolectado, y agregue cuidadosamente la mezcla a las células. Selle las placas con parafina. Luego coloque las placas en un cubo colgante.Centrifugar la centrífuga a 1500 × g durante 120 minutos a 32 grados Celsius. Después de la centrifugación, incubar las células a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Después de 24 horas, cambiar el medio de las células al menos cada 72 horas.Después de la transducción. Prepárese para analizar las células transducidas mediante citometría de flujo para cuantificar el porcentaje de tasa de transducción. Primero, utilizando una línea celular comparable no transducida como control negativo, asegúrese de que las compuertas estén configuradas correctamente en los canales adecuados.Configure el voltaje del canal del parámetro de modo que la población negativa se encuentre por debajo del valor de 10 a la tercera potencia en cada eje fluorescente de interés. A continuación, establezca las compuertas para la fluorescencia positiva como eventos que aparecen más allá del control negativo. Luego, utilizando las células transducidas, determine el porcentaje positivo para el canal fluorescente específico.Ordene las células en tubos cónicos de 15 mililitros que contienen un mililitro de FBS al 100%. Luego, centrifugue las poblaciones ordenadas en una centrífuga con rotor de cubeta colgante a 524 ×g a 32 grados Celsius durante cinco minutos.Después de la centrifugación, resuspenda las células en un mililitro de medio fresco y siembre dos veces 10 a la seis células en dos mililitros de DMEM en una placa de seis centímetros. A esta concentración, la confluencia es inferior al 60 % y permitirá el crecimiento y la división durante al menos dos días. Incube las células en un incubador a 37 grados Celsius durante varios días para permitir el tiempo necesario para la amplificación.Pueden generarse poblaciones clonales a partir de las células originalmente transducidas o de las células ordenadas. Ordenar poblaciones compactas según la fluorescencia elegida, en lugar de clones individuales en esta etapa, garantiza una población de respaldo para selecciones futuras. Si es necesario, ajuste las compuertas para la clasificación según las poblaciones de interés y asegúrese de que las compuertas estén establecidas con al menos una escala logarítmica de separación para obtener poblaciones distinguibles. Utilizando una unidad automatizada de deposición celular, ordene células individuales en placas de 96 pocillos, teniendo en cuenta que habrá un promedio de una célula por pocillo.Algunos pozos pueden no tener ninguna célula y otros pueden tener más de una. Tras la clasificación, incubar las células a 37 grados Celsius durante al menos dos semanas para amplificar los clones individuales. Examinar regularmente las células bajo el microscopio para asegurarse de que las poblaciones en crecimiento provienen de células individuales y no de más de una.Asimismo, asegúrese de que las células no se sobrecrezcan después de dos semanas. Analice las poblaciones clonales putativas mediante citometría de flujo y compárelas con una población de control negativo. Las poblaciones clonales verdaderas deben presentar patrones de fluorescencia muy definidos.Seleccione las poblaciones más claramente separadas según la intensidad promedio y la compacidad de la población. Amplifíquelas según sea necesario o almacene los cultivos en medio de congelación con 10 % DMSO a menos 80 grados Celsius durante períodos cortos de tiempo o en nitrógeno líquido para períodos más largos. A continuación, pruebe si las poblaciones clonales pueden utilizarse con éxito en un sistema de cribado multiplex de alto rendimiento.Seleccione un conjunto de clones con espectros de absorción, emisión o intensidades diferentes distinguibles, y combínelos en una única semilla de tubo. 50.000 de las células combinadas en 200 microlitros de DMEM suplementado en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en tubos separados. Prepare controles negativos y de un solo color para su uso en el ajuste de parámetros y valores de compensación en el citómetro de flujo.Establezca los valores de compensación. Luego analice la muestra para asegurarse de que se puedan distinguir cada una de las líneas celulares fluorescentes independientes establecidas. Para adaptar las líneas celulares con códigos de barras a una aplicación biológica, primero seleccione elementos del ensayo que hayan sido diseñados de manera que estén acoplados a una etiqueta o proteína fluorescente como fusión o mediante un sitio de entrada de ribosomas internos.Ires, que permite una detección sencilla mediante citometría de flujo, inmunotransferencia o microscopía. El sistema utilizado aquí consiste en un ensayo biológico en el que una proteína de envoltura de VIH se expresa en la superficie de la célula, exponiendo sus etiquetas HA y flag. La proteína del ensayo se expresa en una célula codificada con una etiqueta de barras que expresa tomate TD.La escisión de la proteína se puede monitorear mediante tinción con un anticuerpo Anti-Flag marcado con FSE. Cuando la proteína no está escindida, se observa tinción, pero cuando la proteína está escindida, la fluorescencia verde ya no es evidente. Para establecer el ensayo biológico en las células con códigos de barras, transducirlas con partículas virales que contengan los elementos del ensayo de elección.Agregue el SUP viral natin a las células de elección y centrifugue. A continuación, incube las células con anticuerpos anti HA marcados con fluorescencia. Luego, separe las células con códigos de barras para aislar aquellas que contienen elementos del ensayo positivos para ha.Finalmente, combine líneas celulares marcadas con códigos de barras distintos, cada una conteniendo un ensayo con un sustrato diferente. Incube la mezcla de células con el anticuerpo conjugado Anti-Flag y ZI y analícelas mediante citometría de flujo para determinar si ha ocurrido el corte de la proteína, y así rastrear el ensayo, analizar o decodificar las poblaciones en el canal apropiado donde se pueden distinguir las líneas celulares marcadas genéticamente. El canal PE para el tomate TD luego decodifica la naturaleza del sustrato mediante el análisis en el canal fite para revelar la población positiva y ensayar la escisión de proteínas expresadas en la superficie en la vía secretora. Las células Sub T1 se marcaron fluorescentemente para expresar tomate TD y se separaron en tres poblaciones con diferentes intensidades. Cada una de las poblaciones se transdujo luego con un retrovirus diferente para inducir la expresión de la proteína de envoltura de VIH tipo silvestre, la proteína de envoltura mutante de VIH o el virus del dengue.Proteína de límite PRM, cada una flanqueada por etiquetas flag y HA. Las células transducidas se incubaron con anticuerpos anti-HA y anti-Flag. La tinción con anti-HA se realizó para confirmar la presencia de la proteína de ensayo modificada, mientras que la tinción con anti-Flag se realizó para determinar si había sido escindida.Cuando se analizaron poblaciones combinadas sin teñir mediante citometría de flujo, las poblaciones clonales fueron distinguibles según la etiqueta de código de barras TD tomate, pero indistinguibles en el canal fite. En contraste, cuando las mismas poblaciones se tiñeron con el anticuerpo flag fite, una población resultó positiva para flagg. Basándose en el etiquetado con códigos de barras, esta población puede identificarse fácilmente como la población que porta el sustrato mutante del envoltorio del VIH it.Ahora, debería tener una comprensión muy clara de cómo utilizar la tecnología de válvula retrógrada junto con la citometría de flujo. Para establecer líneas celulares codificadas genéticamente con marcadores fluorescentes, cuatro aplicaciones biológicas en formato multiplex, la capacidad de acoplar células codificadas genéticamente con marcadores fluorescentes a ensayos basados en células en formato multiplex mejora notablemente las capacidades de alto rendimiento. Después de generar las líneas celulares, es importante congelarlas.Luego, descongele periódicamente las muestras, vuelva a analizarlas y vuélvalas a congelar. Aunque la generación de líneas celulares marcadas genéticamente con códigos de barras fluorescentes podría ser un proceso que lleva tiempo al principio, una vez establecidas, mejoran notablemente la repetibilidad y la robustez de aplicaciones futuras.

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