El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

El objetivo general del siguiente experimento es codificar con fluorescencia células de mamíferos para mejorar los ensayos biológicos multiplexados de alto rendimiento que se basan en distintas lecturas fluorescentes. Para ello, se utilizan partículas retrovirales para expresar de forma estable proteínas fluorescentes en células de mamíferos, codificando así su código de barras. A continuación, se realiza una clasificación de células activadas fluorescentes para obtener poblaciones clonales con códigos de barras.

A continuación, las poblaciones clonales se amplifican, se combinan y se analizan mediante citometría de flujo para confirmar que pueden distinguirse entre sí y, por lo tanto, utilizarse al mismo tiempo. Finalmente, las líneas celulares con código de barras se transducen con un ensayo marcado. Las proteínas y la actividad biológica se monitorean utilizando canales fluorescentes distintos de los canales con códigos de barras.

Los resultados demuestran la utilidad del recubrimiento de barras fluorescentes de células de mamíferos para aplicaciones multiplexadas en un entorno de alto rendimiento. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes que requieren una calibración cuidadosa del anticuerpo o el tinte es que una vez que se establecen las líneas celulares con códigos de barras genéticos, no requieren más manipulación y, debido a que la proteína de interés se expresa durante largos períodos de tiempo, se utilizan aún más para adaptaciones biológicas. El acoplamiento de líneas celulares fluorescentes con códigos de barras genéticos con ensayos de superficie nos permite investigar funciones o efectos biológicos de forma independiente en un formato de rendimiento hidráulico.

En nuestro ejemplo, utilizamos un recubrimiento de barras genéticas fluorescentes para controlar la escisión de la multiplexación de diferentes sustratos virales. El ensayo puede explotarse aún más para investigar las maquinarias implicadas en la escisión y para el descubrimiento de fármacos de alto rendimiento. El día antes de la transfección, siembre una placa de 10 centímetros con 2,5 veces 10 a las seis células Phoenix GP en DMEM con 10% de FBS.

Esta línea celular de empaquetamiento expresa de manera estable las proteínas gag y polo para la formación de partículas retrovirales en trance. El día de la transfección, use un microscopio de campo claro para examinar las células. Las células deben estar sanas y adherirse a la placa en una monocapa para ser utilizadas para la transfección.

A continuación, prepare la mezcla de transfección de ADN a 125 microlitros de suero sin suero. DMEM. Agregue tres microgramos de vector de glicoproteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular, P-C-I-V-S-V-G, y tres microgramos de vector de transferencia que lleva el gen de la proteína fluorescente de interés, agregue 15 microlitros de reactivo de transfección de polieteramina y mezcle para obtener partículas virales que transportan diferentes marcadores de proteínas fluorescentes. Realice cada transfección de forma independiente con el marcador de elección para hacerlo.

Incubar cada mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos después de la incubación transfectando añadiendo la mezcla a las celdas. A continuación, incube las placas a 37 grados centígrados. Opcionalmente, después de 24 horas, reemplace el medio con siete mililitros de medio fresco.

Aunque esto puede mejorar la salud celular, puede disminuir la carga viral en el sobrenadante. 48 horas después de la transfección, use una pipeta para transferir el sobrenadante, que contiene las partículas del virus, a una jeringa de 10 mililitros. Equipado con un filtro de politetrafluoroetileno de 0,20 micromolares para presionar el émbolo y dispensar el filtrado en dos tubos de microcentrífuga de mililitros.

Reserve una alícuota de dos mililitros para uso inmediato. Coloque el SNAT viral restante y las alícuotas en hielo y transfiéralos a menos 80 grados Celsius hasta que se usen 24 horas antes de la transducción en cada pocillo de una semilla de placa de seis pocillos, 2.0 a 3.0 veces 10 a la quinta células adherentes aquí, aquí se usan 2, 9, 3 células T al día siguiente. Para transducir las células adherentes, retire los medios existentes de la placa.

Agregue cinco microgramos por mililitro de policerebro a los dos mililitros del seno viral recolectado previamente y agregue la mezcla con cuidado a las células. Sella las placas con perfume. A continuación, coloque los platos en un cubo para colgar.

Centrífuga centrífuga a 1500 veces G durante 120 minutos a 32 grados centígrados. Después del centrifugado, incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, reemplace el medio de celdas al menos 72 horas.

Post transducción. Prepárese para analizar las células transducidas mediante citometría de flujo para cuantificar la tasa porcentual de transducción. En primer lugar, utilizando una línea celular transducida no t comparable como control negativo, asegúrese de que las puertas estén correctamente configuradas en los canales correctos.

Ajuste el parámetro voltaje del canal de modo que la población negativa esté por debajo del valor de 10 al tercero en cada eje fluorescente de interés. A continuación, establezca las puertas para la fluorescencia positiva como eventos que aparecen más allá del control negativo. A continuación, utilizando las células transducidas, determine el porcentaje positivo para el canal fluorescente específico.

Clasifique las células en tubos cónicos de 15 mililitros que contengan un mililitro de 100% FBS. A continuación, gira las poblaciones clasificadas en un cubo colgante. Centrífuga de rotor a 524 veces G a 32 grados centígrados durante cinco minutos.

Después del centrifugado, vuelva a suspender las células en un mililitro de medio fresco, luego siembre dos veces 10 a las seis células en dos mililitros de DMEM en una placa de seis centímetros. A esta concentración, la confluencia está por debajo del 60% y permitirá el crecimiento y la división durante al menos dos días. Coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados durante varios días para dar tiempo a la amplificación.

Las poblaciones clonales se pueden generar a partir de las células transducidas originalmente o de las células ordenadas. La clasificación de poblaciones ajustadas en función de la fluorescencia elegida en lugar de clones individuales en esta etapa garantiza una población de respaldo para la selección futura. Si es necesario, configure las compuertas para clasificar de acuerdo con las poblaciones de interés, asegúrese de que las compuertas estén separadas por al menos una escala logarítmica Para obtener poblaciones distinguibles utilizando una unidad de deposición de celdas automatizada, clasifique las celdas individuales en placas de 96 pocillos, tenga en cuenta que habrá un promedio de una celda por pocillo.

Es posible que algunos pozos no tengan celdas y otros pueden tener más de una célula. Clasificación, incubar las células a 37 grados centígrados durante al menos dos semanas Para amplificar los clones individuales. Examine regularmente las células bajo el microscopio para asegurarse de que las poblaciones en crecimiento surjan de células individuales y no de más de una.

También asegúrese de que las células no crezcan demasiado después de que hayan pasado dos semanas. Cribar las poblaciones clonales putativas mediante citometría de flujo y compararlas con una población de control negativa. Las verdaderas poblaciones clonales deben tener patrones de fluorescencia muy estrictos.

Elija las poblaciones más claramente separadas en función de la intensidad media y la estrechez de la población. Amplíelos según sea necesario o almacene las existencias en medio de congelación con 10% de DMSO a menos 80 grados Celsius durante períodos cortos de tiempo o nitrógeno líquido durante más tiempo. A continuación, probar si las poblaciones clonales se pueden utilizar con éxito en un sistema de cribado múltiplex de alto rendimiento.

Elija un conjunto de clones con espectros de absorción, emisión y/o intensidades distinguibles, y combínelos en una sola semilla tubular. 50.000 de las células combinadas en 200 microlitros de DMEM suplementado en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en tubos separados. Prepare los controles negativos y de un solo color para su uso en la configuración de parámetros y valores de compensación en el citómetro de flujo.

Establezca los valores de compensación. A continuación, analice la muestra para asegurarse de que se puede distinguir cada una de las líneas celulares fluorescentes independientes establecidas. Para adaptar las líneas celulares con códigos de barras a una aplicación biológica, primero seleccione elementos de ensayo que hayan sido diseñados de tal manera que se acoplen a una proteína etiqueta o fluorescente como una fusión o a través de un sitio de entrada de ribosoma interno.

Ires, que permite una detección sencilla a través de la citometría de flujo de Western blot o una microscopía. El sistema utilizado aquí consiste en un ensayo biológico en el que una proteína de la envoltura del VIH se expresa en la superficie de la célula, exponiendo sus etiquetas HA y bandera. La proteína del ensayo se expresa en una celda con código de barras que expresa tomate TD.

La escisión de la proteína se puede controlar mediante la tinción con un anticuerpo Anti-Flag marcado con FSE. Cuando la proteína no se escinde, se observa tinción, pero cuando la proteína se escinde, el marcaje de fluorescencia verde ya no es evidente. Para establecer el ensayo biológico en las células con código de barras, transdúzcalas con partículas virales que contengan los elementos del ensayo de elección.

Agregue SUP natin viral a las células de su elección y centrifuga por centrifugación. A continuación, incube las células con anticuerpos anti HA marcados con fluorescencia. A continuación, clasifique las celdas con código de barras para aislar las que contienen elementos de ensayo que son positivos para ha.

Por último, se combinaron distintas líneas de celdas con códigos de barras. Cada uno de ellos contiene un ensayo que contiene un sustrato diferente. Incubar la mezcla de células con anticuerpo conjugado Anti-Flag y ZI y analizarlas mediante citometría de flujo para determinar si se ha producido la escisión de la proteína para rastrear el ensayo, analizar o decodificar las poblaciones en el canal apropiado donde se pueden distinguir aquí las distintas líneas celulares genéticamente con códigos de barras.

A continuación, el canal PE para el tomate TD decodifica la naturaleza del sustrato mediante el análisis en el canal fite para revelar la población positiva para analizar la escisión de las proteínas expresadas en la superficie en la vía de secreción. Las células Sub T one se codificaron con código de barras fluorescente para expresar tomate TD y se clasificaron en tres poblaciones a diferentes intensidades. A continuación, cada una de las poblaciones se transdució con un retrovirus diferente para inducir la expresión de la proteína de la envoltura del VIH de tipo salvaje, la proteína mutante de la envoltura del VIH o el virus del dengue.

Proteína límite PRM, cada una flanqueada por etiquetas bandera y HA. Las células transducidas se incubaron con anticuerpos anti HA y anti-Flag. Se realizó una tinción anti HA para confirmar la presencia de la proteína de ensayo modificada, mientras que la tinción anti-Flag se realizó para determinar si se había escindido.

Cuando las poblaciones combinadas no teñidas se analizaron por citometría de flujo, las poblaciones clonales se distinguieron en función del código de barras del tomate TD, pero indistinguibles en el canal fite. Por el contrario, cuando las mismas poblaciones se tiñeron con el anticuerpo flag fite, una población dio positivo para flagg. Sobre la base de los códigos de barras, esta población puede identificarse fácilmente como la población portadora de la envoltura mutante del VIH

Ahora, debe tener una muy buena comprensión de cómo utilizar la tecnología de válvulas retro junto con la citometría de flujo. Con el fin de establecer líneas celulares fluorescentes con códigos de barras genéticos, cuatro aplicaciones biológicas en un formato multiplex, La capacidad de acoplar células fluorescentes con códigos de barras genéticos con ensayos basados en células en un formato multiplex mejora drásticamente las capacidades de alto rendimiento. Una vez generadas las líneas celulares, es importante congelarlas.

A continuación, descongélelos periódicamente, vuelva a analizarlos y vuelva a liberarlos. Si bien la generación de líneas celulares fluorescentes con códigos de barras genéticos puede llevar mucho tiempo al principio, una vez establecidas, mejoran drásticamente la repetibilidad y la solidez de las aplicaciones futuras.