Caracterización funcional de Na ⁺ / H ⁺ Intercambiadores de compartimentos intracelular usando selección Protón-matanza para expresarlos a la membrana plasmática

El objetivo general del siguiente experimento es medir la actividad de los intercambiadores de protones de sodio expresados intracelularmente. Esto se logra seleccionando primero las células que expresan los intercambiadores intracelulares de sodio-protones en la membrana plasmática mediante la selección de destrucción de protones. Como segundo paso, las células seleccionadas se acidifican y, a continuación, se mide la recuperación del pH intracelular para confirmar la actividad de intercambio de sodio-protones de las células.

A continuación, se mide la cinética rápida del transporte de iones para determinar las constantes de afinidad del catión transportado y los inhibidores. En última instancia, el seguimiento de los cambios en el pH intracelular y la cinética rápida de las células somáticas seleccionadas permite la caracterización funcional del intercambio de proteínas intracelulares. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la expresión de transportadores mutantes o el uso de células por células, es que permite la expresión de transportadores intracelulares de tipo blanco en la membrana plasmática, lo que permite medir directamente su función.

El Dr. Mallory, poeta, un científico investigador de mi laboratorio, demostrará el procedimiento para comenzar el procedimiento de matanza de protones. En primer lugar, incubar las células que expresan el intercambiador de protones de sodio intracelular de interés en una solución de carga a 37 grados centígrados y una incubadora libre de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, aspire la solución de carga y lave las celdas dos veces con medio fresco.

Después del segundo lavado, aspire el medio e incube las células en solución de recuperación en una incubadora libre de dióxido de carbono. Después de otra hora, reemplace el medio de recuperación con un medio de cultivo regular y cultive las células en condiciones de cultivo estándar. Repitiendo este ciclo de selección dos veces por semana hasta que emerjan clones estables para obtener imágenes del pH de fluorescencia intracelular de las células.

Primero equipó un conjunto de imágenes que consistía en un microscopio invertido acoplado a una cámara de video de alta sensibilidad con filtros de interferencia de banda estrecha de 450 nanómetros y 490 nanómetros emparejados con los filtros de densidad neutra de cuarzo apropiados para la excitación. Si es posible, utilice el conjunto adecuado de filtros y condiciones de iluminación para establecer valores de fluorescencia comparables para los canales uno y dos, de modo que la relación se acerque a uno para medir la actividad directa del intercambiador de sodio y protón. A continuación, acidificar las células con una incubación de una hora en una solución de carga de amonio.

En ausencia de dióxido de carbono durante los últimos cinco minutos de la incubación, las células con una relación métrica sensible al pH fluorescente mueren. Al final del período de incubación, reine las células con una solución de carga de amonio para eliminar la sonda extracelular y monte las células teñidas en el microscopio. Seleccione las regiones de interés en las que se medirán los valores fluorescentes según corresponda.

A continuación, grabe varias imágenes para establecer una línea de base y perfundir las células con la solución RIN para iniciar una caída en la fluorescencia. Después de que el pH se estabilice, examine las células con la solución de interés para medir las tasas de recuperación del pH mediadas por el intercambio de hidrógeno de litio, hidrógeno de sodio o hidrógeno de potasio. Ahora examina las células con la solución de hippies suplementada con cloruro de potasio y gerina.

A continuación, recoja las mediciones de fluorescencia de las imágenes y exporte los datos a un programa de hoja de cálculo en formato de texto para medir la tasa inicial del intercambiador de sodio-protón. Siete, por la rápida absorción de litio, acidifica las células y las placas de pocillos múltiples mediante la técnica de carga de Imodium como se acaba de demostrar. A continuación, enjuague las placas dos veces rápidamente como se acaba de demostrar.

A continuación, incubar las células en soluciones de absorción que contengan de uno a 10 micromolares de litio y las concentraciones deseadas del catión o de los inhibidores de interés durante aproximadamente un minuto o menos al final del período de absorción, retirar cuidadosamente el medio de absorción y lavar rápidamente las células cuatro veces con PBS helado en menos de 10 segundos en total para evitar el flujo de litio, luego lisar las células en 250 microlitros de ácido nítrico al 25% por bueno durante al menos una hora. Raspar cada pocillo con el extremo de la punta de la pipeta al final de la incubación y transferir las suspensiones de cada pocillo a nuevos tubos de microcentrífuga. Finalmente, centrifuga las muestras durante cinco minutos a 15.000 G a temperatura ambiente para eliminar los restos celulares y luego medir el contenido de litio del snat mediante espectroscopia de absorción atómica.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la selección de eliminación de protones se basa en la difusión de la base débil de amonio. Por ejemplo, las células que no expresan un intercambiador de protones de sodio funcional en la membrana plasmática no pueden recuperar un valor de pH neutro y, por lo tanto, exhiben un aspecto acidificado típico con una forma plana y un citosol granular como se ve en esta imagen representativa después de repetidos ciclos de selección, células que sobreviven completa y establemente. La acidificación, sin embargo, forma clones celulares individuales como se ve aquí, como se ha demostrado en la actividad y selectividad iónica de los intercambiadores de protones de sodio intracelulares expresados en la membrana plasmática se puede caracterizar midiendo los cambios en el pH intracelular inducidos en diversas condiciones experimentales, como se observa en estos gráficos después de la acidificación por carga de Imodium.

En cuanto a la cinética enzimática, la dosis-respuesta para las tasas de absorción iniciales se puede utilizar para derivar los valores de la constante de afinidad para los sustratos y para los valores de la constante de inhibición de los inhibidores. De hecho, una característica interesante de los transportadores es que diferentes cationes de acoplamiento competirán por el transporte, lo que brinda la posibilidad de medir la constante de afinidad por el sodio compitiendo con la absorción de litio, como se muestra en esta figura siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros experimentos, como la bioinnovación de superficie celular acoplada al silenciamiento de ARN, con el fin de verificar que el transportador de interés se expresa efectivamente en la membrana plasmática.